Γενετικός μετασχηματισμός σε φυτικά κύτταρα χρησιμοποιώντας υπερήχους

Υπερήχηση-Assisted Agrobacterium-Mediated Transformation (SAAT) είναι μια αποτελεσματική μέθοδος για τη μόλυνση φυτικών κυττάρων με ξένα γονίδια χρησιμοποιώντας Agrobacterium ως μεταφορέα. Υπερήχων σπηλαίωση προκαλεί sonoporation, η οποία μπορεί να περιγραφεί ως στοχευμένη μικρο-τραυματισμό του φυτικού ιστού. Μέσω αυτών των υπερήχων δημιουργεί μικρο-πληγές, DNA και DNA φορείς μπορούν να μεταφερθούν αποτελεσματικά στη μήτρα κυττάρων.

sonoporation – Υπερήχων ενισχυμένο μετασχηματισμό κυττάρων

Όταν εφαρμόζεται υπερηχογράφημα χαμηλής συχνότητας (περίπου 20kHz) σε κυτταρικά εναιωρήματα, τα αποτελέσματα της ακουστικής σπηλαίωσης προκαλούν παροδική διαπερατότητα μεμβράνης στους κυτταρικούς ιστούς. Αυτό το υπερηχητικό αποτέλεσμα είναι γνωστό ως sonoporation και χρησιμοποιείται για τη μεταφορά γονιδίων σε κύτταρα ή ιστούς.
Πλεονεκτήματα της υπερήχων βασίζονται στη μη θερμική μηχανική αρχή λειτουργίας της, η οποία καθιστά κατεργασία με υπερήχους συχνά πιο ευέλικτη και λιγότερο εξαρτώμενη από τους τύπους κυττάρων. Η πολύπλευρη εφαρμογή της sonoporation ανοίγει τη δυνατότητα αξιοποίησης διαγονιδιακών φυτών, τα οποία έχουν σημαντικές δυνατότητες στη βιοπαραγωγή σύνθετων ανθρώπινων θεραπευτικών πρωτεϊνών. Τέτοιοι βιοαντιδραστήρες φυτικής προέλευσης μπορούν να τροποποιηθούν εύκολα γενετικά, να αποτρέψουν την πιθανή μόλυνση με ανθρώπινα παθογόνα, να μην βλάψουν τα βακτήρια που μεσολαβούν στον μετασχηματισμό (π.χ. Agrobacterium) και είναι μια φθηνή, αποτελεσματική μέθοδος βιοσύνθεσης.

Υπερήχων-υποβοηθούμενη κυτταρική μετατροπή

Κατεργασία με υπερήχους είναι μια τεχνική που εφαρμόζει κύματα υπερήχων χαμηλής συχνότητας για την ανάδευση σωματιδίων σε διάλυμα, για την ανάμιξη διαλυμάτων, αυξάνοντας έτσι το ρυθμό μεταφοράς μάζας και διάλυσης. Ταυτόχρονα, κατεργασία με υπερήχους μπορεί να αφαιρέσει διαλυμένα αέρια από υγρά. Στον μετασχηματισμό των φυτών, η υπερήχηση θα προκαλέσει το σχηματισμό μικροτραυμάτων στον φυτικό ιστό και θα ενισχύσει την παράδοση γυμνού DNA στον πρωτοπλάστη του φυτού.

Για γενετικό μετασχηματισμό, ο μετασχηματισμός με μεσολάβηση υπερήχων Agrobacterium (SAAT) είναι η προτιμώμενη μέθοδος και έχει σημαντικά υψηλότερη αποτελεσματικότητα από την υπερήχηση που χρησιμοποιείται για τη μεταφορά γυμνού DNA και φορέων DNA απευθείας στον πρωτοπλάστη. Πολυάριθμες μελέτες έχουν δείξει ότι ο υπερήχων υποβοηθούμενος μετασχηματισμός με μεσολάβηση Agrobacterium (SAAT) μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να προκαλέσει μηχανική διαταραχή και σχηματισμό τραυμάτων σε φυτικά κύτταρα από κύματα υπερήχων και την προκύπτουσα ακουστική σπηλαίωση. Μια σύντομη υπερηχητική θεραπεία δημιουργεί μικρο-πληγές στην επιφάνεια των εκφύτων. Καθώς τα τραυματισμένα κύτταρα θα επιτρέψουν τη διείσδυση του Agrobacterium στο βαθύτερο τμήμα των φυτικών ιστών, αυξάνοντας έτσι την πιθανότητα μόλυνσης των φυτικών κυττάρων. Επιπλέον, οι εκκρινόμενες φαινολικές ενώσεις ενισχύουν τον μετασχηματισμό. Οι μικροπληγές που δημιουργούνται με υπερήχους καθιστούν επίσης πιο εφικτή τη διείσδυση των βακτηρίων. Το SAAT χρησιμοποιήθηκε με επιτυχία για γενετικό μετασχηματισμό σε φυτικά είδη που θεωρούνται ιδιαίτερα ανθεκτικά στο Agrobacterium.
Όντας μια πολύ απλή και φθηνή μέθοδος, καθώς και η σημαντική ενίσχυση της μεταφοράς γονιδίων με μεσολάβηση Agrobacterium είναι τα σημαντικότερα πλεονεκτήματα του SAAT. Εκτός από την επιτυχή εφαρμογή του SAAT στον μετασχηματισμό των Chenopodium rubrum L. και Beta vulgaris L., η προσέγγιση αυτή εφαρμόστηκε επίσης στην παραγωγή ανασυνδυασμένων ανοσοενισχυτικών εμβολίων Escherichia coli άγριου τύπου θερμοασταθούς ολοτοξίνης και μεταλλαγμένων Escherichia coli LT σε Nicotiana tabacum, στα οποία ανιχνεύθηκαν οι υψηλότεροι συστηματικοί τίτλοι IgG ειδικά για LT-B σε πτηνά.
(βλ. Laere κ.ά., 2016· M. Klimek-Chodacka και R. Baranski, 2014)

Γενική διαδικασία μεταφοράς γονιδίων μέσω υπερηχοπόρωσης σε φυτικά κύτταρα

1. Παρασκευή γενετικού υλικού: Ξεκινήστε προετοιμάζοντας το γενετικό υλικό που θέλετε να εισαγάγετε στα φυτικά κύτταρα. Αυτό θα μπορούσε να είναι πλασμιδικό DNA, RNA ή άλλα νουκλεϊνικά οξέα.
2. Απομόνωση φυτικών κυττάρων: Απομονώστε τα φυτικά κύτταρα που θέλετε να στοχεύσετε. Ανάλογα με το πείραμά σας, αυτά τα κύτταρα μπορούν να απομονωθούν από φυτικούς ιστούς ή καλλιέργειες.
3. Κυτταρικό εναιώρημα: Εναιωρήστε τα φυτικά κύτταρα σε κατάλληλο μέσο ή ρυθμιστικό διάλυμα. Αυτό είναι απαραίτητο για να διασφαλιστεί ότι τα κύτταρα είναι υγιή και σε κατάσταση που ευνοεί την πρόσληψη γονιδίων.
4. Ρυθμίστε το Sonicator σας: Προετοιμάστε τον υπερηχητή τύπου καθετήρα σας με προ-ρύθμιση παραμέτρων υπερήχων όπως πλάτος, χρόνος, ενέργεια και θερμοκρασία. Βυθίστε τον υπερηχητικό καθετήρα στο κυτταρικό εναιώρημα.
5. Υπερήχηση: Ξεκινήστε τη διαδικασία υπερήχων. Η ταχεία ταλάντωση του άκρου του καθετήρα δημιουργεί φυσαλίδες σπηλαίωσης στο υγρό. Αυτές οι φυσαλίδες επεκτείνονται και καταρρέουν λόγω των υπερηχητικών κυμάτων, δημιουργώντας μηχανικές δυνάμεις και μικροροή στην ανάρτηση.
6. Sonoporation: Οι μηχανικές δυνάμεις και η μικροροή που παράγεται από τη σπηλαίωση δημιουργούν προσωρινά πόρους και τρύπες στις μεμβράνες των φυτικών κυττάρων. Το γενετικό υλικό που υπάρχει στο εναιώρημα μπορεί να εισέλθει στα φυτικά κύτταρα μέσω αυτών των πόρων.
7. Επώαση: Μετά τη θεραπεία sonoporation, επωάστε τα φυτικά κύτταρα για να τους επιτρέψετε να ανακάμψουν και να σταθεροποιήσουν τις μεμβράνες τους. Αυτό είναι ένα κρίσιμο βήμα για να εξασφαλιστεί η επιβίωση των κυττάρων και η επιτυχής μεταφορά γονιδίων.

Μεταφορά γονιδίων μέσω Agrobacterium ή λιποσωμάτων

Υπάρχουν δύο κοινές μορφές για τη μετάγγιση φυτικών κυττάρων. Χρησιμοποιούν είτε agrobacterium, ένα γένος Gram-αρνητικών βακτηρίων, είτε λιποσώματα ως φορέα του γενετικού υλικού.

• Sonoporation με μεσολάβηση αγροβακτηριδίου: Το Agrobacterium tumefaciens είναι ένα βακτήριο που χρησιμοποιείται συνήθως στη γενετική μηχανική φυτών. Σε αυτή τη μέθοδο, πλασμιδικό DNA που περιέχει το επιθυμητό γονίδιο εισάγεται στο Agrobacterium, το οποίο στη συνέχεια αναμιγνύεται με φυτικά κύτταρα. Το κυτταρικό εναιώρημα υποβάλλεται σε sonoporation χρησιμοποιώντας έναν υπερηχητή τύπου καθετήρα. Η υπερηχητική ενέργεια ενισχύει τη μεταφορά του γενετικού υλικού από το Agrobacterium στα φυτικά κύτταρα. Αυτή η μέθοδος χρησιμοποιείται ευρέως για τη γενετική τροποποίηση των φυτών.
• Υπερηχοπόρωση με μεσολάβηση λιποσωμάτων: Τα λιποσώματα είναι κυστίδια με βάση τα λιπίδια που μπορούν να μεταφέρουν γενετικό υλικό. Σε αυτή τη μέθοδο, λιποσώματα φορτωμένα με πλασμιδικό DNA ή άλλα νουκλεϊνικά οξέα αναμιγνύονται με φυτικά κύτταρα. Sonoporation χρησιμοποιώντας έναν υπερήχων τύπου καθετήρα χρησιμοποιείται για να διευκολύνει την πρόσληψη λιποσωμάτων από φυτικά κύτταρα. Ο υπέρηχος διαταράσσει τις λιπιδικές διπλοστιβάδες των λιποσωμάτων, απελευθερώνοντας το γενετικό υλικό στα φυτικά κύτταρα. Αυτή η προσέγγιση είναι χρήσιμη για μελέτες παροδικής γονιδιακής έκφρασης σε φυτικά κύτταρα.

Επιστημονικά αποδεδειγμένα οφέλη του μετασχηματισμού με τη μεσολάβηση υπερήχων Agrobacterium (SAAT)

Υπερήχηση-υποβοηθούμενη Agrobacterium-Mediated Transformation (SAAT) έχει εφαρμοστεί σε πολλά είδη φυτών. Μια σύντομη και σχετικά ήπια υπερηχητική θεραπεία καλλιεργειών φυτικών κυττάρων προκαλεί sonoporation, η οποία στη συνέχεια επιτρέπει μια βαθιά διείσδυση του Agrobacterium ως μεταφορέα γονιδίων. Παρακάτω μπορείτε να διαβάσετε υποδειγματικές μελέτες που αποδεικνύουν τα ευεργετικά αποτελέσματα του SAAT.

Υπερήχων-υποβοηθούμενη μεταμόρφωση του Ashwagandha

Προκειμένου να βελτιωθεί η αποτελεσματικότητα μετασχηματισμού στο W. somnifera (γνωστό ως ashwagandha ή χειμερινό κεράσι), ο Dehdashti και οι συνεργάτες του (2016) διερεύνησαν τη χρήση ακετοσυριγιόνης (AS) και υπερήχων.
Η ακετοσυριγιόνη (AS) προστέθηκε σε τρία στάδια: υγρή καλλιέργεια Agrobacterium, μόλυνση από Agrobacterium και συγκαλλιέργεια εκφύτων με Agrobacterium. Η προσθήκη 75 μM AS σε υγρή καλλιέργεια Agrobacterium βρέθηκε να είναι βέλτιστη για την επαγωγή ιικών γονιδίων.
Η πρόσθετη εφαρμογή υπερήχων (SAAT) είχε ως αποτέλεσμα την υψηλότερη γονιδιακή έκφραση. Η έκφραση του γονιδίου gusA στις τριχωτές ρίζες βρέθηκε να είναι καλύτερη όταν τα φύλλα και οι άκρες των βλαστών υπερήχων για 10 και 20 δευτερόλεπτα, αντίστοιχα. Η αποτελεσματικότητα μετασχηματισμού του βελτιωμένου πρωτοκόλλου καταγράφηκε 66,5 και 59,5% στην περίπτωση των εκφύσεων φύλλων και άκρων βλαστών, αντίστοιχα. Σε σύγκριση με άλλα πρωτόκολλα, η αποτελεσματικότητα μετασχηματισμού αυτού του βελτιωμένου πρωτοκόλλου βρέθηκε να είναι 2,5 φορές υψηλότερη για τα φύλλα και 3,7 φορές μεγαλύτερη για τις άκρες βλαστών. Οι αναλύσεις των νότιων κηλίδων επιβεβαίωσαν 1-2 αντίγραφα του διαγονιδίου gusA στις γραμμές W1-W4, ενώ 1-4 διαγονιδιακά αντίγραφα ανιχνεύθηκαν στη γραμμή W5 που δημιουργήθηκε από το βελτιωμένο πρωτόκολλο.

Επίδραση της διάρκειας του μετασχηματισμού με μεσολάβηση υπερήχων Agrobacterium-mediated (SAAT) στη συχνότητα μετασχηματισμού των φύλλων W. somnifera (α) και βλαστών άκρων (β) εκφύτων
(μελέτη και γράφημα: © Dehdashti et al., 2016)

Υπερήχων υποβοηθούμενη μετατροπή του βαμβακιού

Hussain et al. (2007) αποδεικνύουν τα ευεργετικά αποτελέσματα του μετασχηματισμού βαμβακιού με υπερήχους. Η ακουστική σπηλαίωση που προκαλείται από υπερήχους χαμηλής συχνότητας δημιουργεί μικροπληγές πάνω και κάτω από την επιφάνεια του φυτικού ιστού (sonoporation) και επιτρέπει στο Agrobacterium να ταξιδέψει βαθύτερα και πλήρως σε όλο τον φυτικό ιστό. Αυτός ο τραυματικός τρόπος αυξάνει την πιθανότητα μόλυνσης φυτικών κυττάρων που βρίσκονται βαθύτερα στον ιστό. Προκειμένου να αξιολογηθεί η αποτελεσματικότητα μετασχηματισμού του SAAT, μετρήθηκε η έκφραση του γονιδίου GUS. Το σύστημα ρεπόρτερ GUS είναι ένα γονιδιακό σύστημα ρεπόρτερ, ιδιαίτερα χρήσιμο στη μοριακή βιολογία και μικροβιολογία των φυτών. Προσαρμόζοντας διάφορες παραμέτρους SAAT, ενισχύθηκε σημαντικά η παροδική έκφραση GUS στο βαμβάκι χρησιμοποιώντας ώριμα έμβρυα ως έκφυτο. Το GUS ανιχνεύθηκε για πρώτη φορά 24 ώρες μετά την επώαση των εκφύτων και μέχρι το 48ωρο, η έκφραση του GUS ήταν πολύ έντονη, γεγονός που χρησίμευσε ως χρήσιμος δείκτης επιτυχούς μετασχηματισμού του βαμβακιού μετά από υπερήχους υποβοηθούμενο μετασχηματισμό με μεσολάβηση Agrobacterium (SAAT). Η σύγκριση διαφόρων τεχνικών μετασχηματισμού (δηλαδή βιολιστικού, Agro, BAAT, SAAT), υποβοηθούμενου από υπερήχους μετασχηματισμού με μεσολάβηση αγροβακτηριδίου (SAAT) έδειξε μακράν τα καλύτερα αποτελέσματα του μετασχηματισμού.

Επιλογή διαδικασίας μετασχηματισμού με βάση την παροδική έκφραση του GUS. Υπερήχηση-υποβοηθούμενη Agrobacterium-μεσολαβείται μετασχηματισμό (SAAT) δείχνει μια σημαντικά υψηλότερη παροδική έκφραση.
(μελέτη και γράφημα: © Hussain et al., 2007)

Υψηλής απόδοσης λύσεις υπερήχων για Sonoporation και SAAT

Hielscher Υπέρηχοι είναι μακροχρόνια εμπειρία στην ανάπτυξη και την κατασκευή των υπερήχων υψηλής απόδοσης για εργαστήρια, ερευνητικές εγκαταστάσεις, καθώς και βιομηχανική παραγωγή με πολύ υψηλή απόδοση. Για τη μικροβιολογία και τις επιστήμες της ζωής, Hielscher προσφέρει διάφορες λύσεις για να φιλοξενήσει διαφορετικές απαιτήσεις απαραίτητες για συγκεκριμένους ιστούς και τις θεραπείες τους. Για την ταυτόχρονη υπερήχους πολυάριθμων δειγμάτων Hielscher προσφέρει την UIP400MTP για πλάκες πολλαπλών φρεατίων, το VialTweeter για την υπερήχηση έως και 10 φιαλίδια (π.χ., σωλήνες Eppendorf) ή το υπερήχων CupHorn. Οι υπερήχων τύπου καθετήρα διατίθενται από 50 έως 400 watt ως ομογενοποιητές εργαστηρίου, ενώ τα βιομηχανικά συστήματα καλύπτουν το εύρος ισχύος από 500 watt έως 16kW.
Επικοινωνήστε μαζί μας και ενημερώστε μας σχετικά με τις απαιτήσεις της αίτησής σας και της διαδικασίας. Το έμπειρο προσωπικό μας θα χαρεί να συστήσει τον καταλληλότερο υπερηχητικό για τη βιολογική σας διαδικασία.
Ο παρακάτω πίνακας σας δίνει μια ένδειξη της κατά προσέγγιση ικανότητας επεξεργασίας των υπερήχων μας: