Γενετικός μετασχηματισμός φυτικών κυττάρων με χρήση υπερήχων

Ο μετασχηματισμός με τη μεσολάβηση Agrobacterium και την υποβοήθηση κατεργασίας με υπερήχους (SAAT) είναι μια αποτελεσματική μέθοδος μόλυνσης φυτικών κυττάρων με ξένα γονίδια, χρησιμοποιώντας το Agrobacterium ως μεταφορέα. Η σπηλαίωση που προκαλείται από τους υπερήχους επιφέρει ηχοπόρωση, η οποία μπορεί να περιγραφεί ως στοχευμένος μικροτραυματισμός του φυτικού ιστού. Μέσω αυτών των μικροτραυμάτων που δημιουργούνται με υπερήχους, το DNA και οι φορείς DNA μπορούν να μεταφερθούν αποτελεσματικά στην κυτταρική μήτρα.

Ηχοπόρωση – Κυτταρικός μετασχηματισμός ενισχυμένος με υπερήχους

Όταν εφαρμόζονται υπέρηχοι χαμηλής συχνότητας (περίπου 20kHz) σε κυτταρικά εναιωρήματα, οι επιδράσεις της ακουστικής σπηλαίωσης προκαλούν παροδική αύξηση της διαπερατότητας των μεμβρανών στους κυτταρικούς ιστούς. Αυτή η επίδραση των υπερήχων είναι γνωστή ως ηχοπόρωση και χρησιμοποιείται για τη μεταφορά γονιδίων σε κύτταρα ή ιστούς.
Τα πλεονεκτήματα της κατεργασίας με υπερήχους βασίζονται στη μη θερμική, μηχανική αρχή λειτουργίας της, η οποία συχνά καθιστά την κατεργασία με υπερήχους πιο ευέλικτη και λιγότερο εξαρτώμενη από τους τύπους κυττάρων. Η ευέλικτη εφαρμογή της ηχοπόρωσης ανοίγει τη δυνατότητα αξιοποίησης διαγονιδιακών φυτών, τα οποία έχουν σημαντικές δυνατότητες στη βιοπαραγωγή σύνθετων ανθρώπινων θεραπευτικών πρωτεϊνών. Τέτοιοι φυτικοί βιοαντιδραστήρες μπορούν να τροποποιηθούν γενετικά με ευκολία, αποτρέπουν την πιθανή επιμόλυνση με ανθρώπινα παθογόνα, δεν βλάπτουν τα βακτήρια που μεσολαβούν στον μετασχηματισμό (π.χ. Agrobacterium) και αποτελούν μια οικονομική, αποτελεσματική μέθοδο βιοσύνθεσης.

Κυτταρικός μετασχηματισμός υποβοηθούμενος από υπερήχους

Η κατεργασία με υπερήχους είναι μια τεχνική που εφαρμόζει υπερηχητικά κύματα χαμηλής συχνότητας για την ανάδευση σωματιδίων σε διάλυμα και την ανάμειξη διαλυμάτων, αυξάνοντας έτσι τον ρυθμό μεταφοράς μάζας και διάλυσης. Ταυτόχρονα, η κατεργασία με υπερήχους μπορεί να απομακρύνει διαλυμένα αέρια από υγρά. Στον μετασχηματισμό φυτών, η κατεργασία με υπερήχους προκαλεί τον σχηματισμό μικροτραυμάτων στον φυτικό ιστό και ενισχύει τη μεταφορά γυμνού DNA στον φυτικό πρωτοπλάστη.

Για τον γενετικό μετασχηματισμό, ο μετασχηματισμός με τη μεσολάβηση Agrobacterium και την υποβοήθηση κατεργασίας με υπερήχους (SAAT) είναι η προτιμώμενη μέθοδος και έχει σημαντικά υψηλότερη απόδοση από την κατεργασία με υπερήχους που χρησιμοποιείται για την απευθείας μεταφορά γυμνού DNA και φορέων DNA στον πρωτοπλάστη. Πολυάριθμες μελέτες έχουν καταδείξει ότι ο μετασχηματισμός με τη μεσολάβηση Agrobacterium και την υποβοήθηση κατεργασίας με υπερήχους (SAAT) μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την πρόκληση μηχανικής διάρρηξης και τον σχηματισμό τραυμάτων στα φυτικά κύτταρα μέσω υπερηχητικών κυμάτων και της προκύπτουσας ακουστικής σπηλαίωσης. Μια σύντομη κατεργασία με υπερήχους δημιουργεί μικροτραύματα στην επιφάνεια των εκφύτων. Τα τραυματισμένα κύτταρα επιτρέπουν τη διείσδυση του Agrobacterium στα βαθύτερα τμήματα των φυτικών ιστών, αυξάνοντας έτσι την πιθανότητα μόλυνσης των φυτικών κυττάρων. Επιπλέον, οι εκκρινόμενες φαινολικές ενώσεις ενισχύουν τον μετασχηματισμό. Τα μικροτραύματα που δημιουργούνται με υπερήχους διευκολύνουν επίσης τη διείσδυση των βακτηρίων στα έκφυτα. Η SAAT χρησιμοποιήθηκε με επιτυχία για τον γενετικό μετασχηματισμό φυτικών ειδών που θεωρούνται ιδιαίτερα ανθεκτικά στο Agrobacterium.
Τα κύρια πλεονεκτήματα της SAAT είναι ότι αποτελεί μια πολύ απλή και οικονομική μέθοδο, καθώς και ότι ενισχύει σημαντικά τη μεταφορά γονιδίων με τη μεσολάβηση Agrobacterium. Εκτός από την επιτυχή εφαρμογή της SAAT στον μετασχηματισμό των Chenopodium rubrum L. και Beta vulgaris L., αυτή η προσέγγιση έχει επίσης εφαρμοστεί στην παραγωγή ανασυνδυασμένης θερμοευαίσθητης ολοτοξίνης άγριου τύπου του Escherichia coli και ανοσοενισχυτικών εμβολίων από μεταλλαγμένη LT του Escherichia coli στο Nicotiana tabacum, όπου οι υψηλότεροι συστηματικοί τίτλοι IgG ειδικών για την LT-B ανιχνεύθηκαν σε πτηνά.
(πρβλ. Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka and R. Baranski, 2014)

Γενική διαδικασία μεταφοράς γονιδίων μέσω ηχοπόρωσης σε φυτικά κύτταρα

1. Προετοιμασία γενετικού υλικού: Ξεκινήστε προετοιμάζοντας το γενετικό υλικό που θέλετε να εισαγάγετε στα φυτικά κύτταρα. Αυτό θα μπορούσε να είναι πλασμιδιακό DNA, RNA ή άλλα νουκλεϊκά οξέα.
2. Απομόνωση φυτικών κυττάρων: Απομονώστε τα φυτικά κύτταρα που θέλετε να στοχεύσετε. Ανάλογα με το πείραμά σας, τα κύτταρα αυτά μπορούν να απομονωθούν από φυτικούς ιστούς ή καλλιέργειες.
3. Κυτταρικό εναιώρημα: Εναιωρήστε τα φυτικά κύτταρα σε κατάλληλο μέσο ή ρυθμιστικό διάλυμα. Αυτό είναι απαραίτητο για να διασφαλιστεί ότι τα κύτταρα είναι υγιή και σε κατάσταση που ευνοεί την πρόσληψη γονιδίων.
4. Ρύθμιση της συσκευής υπερήχων: Προετοιμάστε τη συσκευή υπερήχων με ακίδα, προρυθμίζοντας παραμέτρους της κατεργασίας με υπερήχους, όπως το πλάτος ταλάντωσης, τον χρόνο, την ενέργεια και τη θερμοκρασία. Βυθίστε την ακίδα υπερήχων στο κυτταρικό εναιώρημα.
5. Κατεργασία με υπερήχους: Ξεκινήστε τη διαδικασία κατεργασίας με υπερήχους. Η ταχεία ταλάντωση του άκρου της ακίδας δημιουργεί φυσαλίδες σπηλαίωσης στο υγρό. Οι φυσαλίδες αυτές διαστέλλονται και καταρρέουν λόγω των υπερηχητικών κυμάτων, δημιουργώντας μηχανικές δυνάμεις και μικροροές στο εναιώρημα.
6. Ηχοπόρωση: Οι μηχανικές δυνάμεις και οι μικροροές που δημιουργούνται από τη σπηλαίωση σχηματίζουν προσωρινούς πόρους και οπές στις μεμβράνες των φυτικών κυττάρων. Το γενετικό υλικό που υπάρχει στο εναιώρημα μπορεί να εισέλθει στα φυτικά κύτταρα μέσω αυτών των πόρων.
7. Επώαση: Μετά την κατεργασία ηχοπόρωσης, επωάστε τα φυτικά κύτταρα ώστε να ανακάμψουν και να σταθεροποιήσουν τις μεμβράνες τους. Αυτό είναι ένα κρίσιμο βήμα για τη διασφάλιση της επιβίωσης των κυττάρων και της επιτυχούς μεταφοράς γονιδίων.

Μεταφορά γονιδίων μέσω Agrobacterium ή λιποσωμάτων

Υπάρχουν δύο συνήθεις τρόποι διαμόλυνσης των φυτικών κυττάρων. Χρησιμοποιούν ως φορέα του γενετικού υλικού είτε το Agrobacterium, ένα γένος Gram-αρνητικών βακτηρίων, είτε λιποσώματα.

• Ηχοπόρωση με τη μεσολάβηση Agrobacterium: Το Agrobacterium tumefaciens είναι ένα βακτήριο που χρησιμοποιείται συνήθως στη γενετική μηχανική των φυτών. Σε αυτή τη μέθοδο, πλασμιδιακό DNA που περιέχει το επιθυμητό γονίδιο εισάγεται στο Agrobacterium, το οποίο στη συνέχεια αναμειγνύεται με φυτικά κύτταρα. Το κυτταρικό εναιώρημα υποβάλλεται σε ηχοπόρωση με τη χρήση συσκευής υπερήχων με ακίδα. Η ενέργεια των υπερήχων ενισχύει τη μεταφορά του γενετικού υλικού από το Agrobacterium στα φυτικά κύτταρα. Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιείται ευρέως για τη γενετική τροποποίηση των φυτών.
• Ηχοπόρωση με τη μεσολάβηση λιποσωμάτων: Τα λιποσώματα είναι κυστίδια με βάση τα λιπίδια, τα οποία μπορούν να μεταφέρουν γενετικό υλικό. Σε αυτή τη μέθοδο, λιποσώματα φορτωμένα με πλασμιδιακό DNA ή άλλα νουκλεϊκά οξέα αναμειγνύονται με φυτικά κύτταρα. Η ηχοπόρωση με τη χρήση συσκευής υπερήχων με ακίδα εφαρμόζεται για να διευκολύνει την πρόσληψη των λιποσωμάτων από τα φυτικά κύτταρα. Οι υπέρηχοι διαρρηγνύουν τις λιπιδικές διπλοστιβάδες των λιποσωμάτων, απελευθερώνοντας το γενετικό υλικό μέσα στα φυτικά κύτταρα. Η προσέγγιση αυτή είναι χρήσιμη για μελέτες παροδικής γονιδιακής έκφρασης σε φυτικά κύτταρα.

Επιστημονικά τεκμηριωμένα οφέλη του μετασχηματισμού με τη μεσολάβηση Agrobacterium και την υποβοήθηση κατεργασίας με υπερήχους (SAAT)

Ο μετασχηματισμός με τη μεσολάβηση Agrobacterium και την υποβοήθηση κατεργασίας με υπερήχους (SAAT) έχει εφαρμοστεί σε πολυάριθμα φυτικά είδη. Μια σύντομη και σχετικά ήπια κατεργασία καλλιεργειών φυτικών κυττάρων με υπερήχους προκαλεί ηχοπόρωση, η οποία στη συνέχεια επιτρέπει τη βαθιά διείσδυση του Agrobacterium ως φορέα γονιδίων. Παρακάτω μπορείτε να διαβάσετε ενδεικτικές μελέτες που καταδεικνύουν τις ευεργετικές επιδράσεις του SAAT.

Μετασχηματισμός της ασβαγκάντα με την υποβοήθηση υπερήχων

Για τη βελτίωση της αποδοτικότητας μετασχηματισμού στη W. somnifera (γνωστή ως ashwagandha ή χειμερινό κεράσι), οι Dehdashti και συνεργάτες (2016) διερεύνησαν τη χρήση ακετοσυριγγόνης (AS) και κατεργασίας με υπερήχους.
Η ακετοσυριγγόνη (AS) προστέθηκε σε τρία στάδια: στην υγρή καλλιέργεια Agrobacterium, κατά τη μόλυνση με Agrobacterium και κατά τη συγκαλλιέργεια εκφύτων με Agrobacterium. Η προσθήκη 75 μM AS στην υγρή καλλιέργεια Agrobacterium διαπιστώθηκε ότι ήταν η βέλτιστη για την επαγωγή των γονιδίων vir.
Η επιπρόσθετη εφαρμογή κατεργασίας με υπερήχους (SAAT) οδήγησε στην υψηλότερη γονιδιακή έκφραση. Η έκφραση του γονιδίου gusA στις τριχωτές ρίζες διαπιστώθηκε ότι ήταν η καλύτερη όταν τα φύλλα και οι κορυφές των βλαστών υποβλήθηκαν σε κατεργασία με υπερήχους για 10 και 20s, αντίστοιχα. Η αποδοτικότητα μετασχηματισμού του βελτιωμένου πρωτοκόλλου καταγράφηκε σε 66,5 και 59,5% στην περίπτωση των εκφύτων φύλλων και κορυφών βλαστών, αντίστοιχα. Σε σύγκριση με άλλα πρωτόκολλα, η αποδοτικότητα μετασχηματισμού αυτού του βελτιωμένου πρωτοκόλλου διαπιστώθηκε ότι ήταν 2,5 φορές υψηλότερη για τα φύλλα και 3,7 φορές υψηλότερη για τις κορυφές των βλαστών. Οι αναλύσεις Southern blot επιβεβαίωσαν 1–2 αντίγραφα του διαγονιδίου gusA στις σειρές W1-W4, ενώ 1–4 αντίγραφα του διαγονιδίου ανιχνεύθηκαν στη σειρά W5 που δημιουργήθηκε με το βελτιωμένο πρωτόκολλο.

Επίδραση της διάρκειας του μετασχηματισμού με τη μεσολάβηση Agrobacterium και την υποβοήθηση κατεργασίας με υπερήχους (SAAT) στη συχνότητα μετασχηματισμού εκφύτων φύλλων (a) και κορυφών βλαστών (b) της W. somnifera
(μελέτη και γράφημα: © Dehdashti et al., 2016)

Μετασχηματισμός βαμβακιού με την υποβοήθηση υπερήχων

Οι Hussain et al. (2007) καταδεικνύουν τις ευεργετικές επιδράσεις του μετασχηματισμού βαμβακιού με την υποβοήθηση κατεργασίας με υπερήχους. Η ακουστική σπηλαίωση που προκαλείται από υπερήχους χαμηλής συχνότητας δημιουργεί μικροτραυματισμούς επάνω και κάτω από την επιφάνεια του φυτικού ιστού (ηχοπόρωση) και επιτρέπει στο Agrobacterium να διεισδύσει βαθύτερα και να διαπεράσει ολόκληρο τον φυτικό ιστό. Αυτός ο τρόπος τραυματισμού αυξάνει την πιθανότητα μόλυνσης φυτικών κυττάρων που βρίσκονται βαθύτερα στον ιστό. Για την αξιολόγηση της αποδοτικότητας μετασχηματισμού με τη μέθοδο SAAT, μετρήθηκε η έκφραση του γονιδίου GUS. Το σύστημα αναφοράς GUS είναι ένα σύστημα γονιδίου αναφοράς, ιδιαίτερα χρήσιμο στη μοριακή βιολογία των φυτών και στη μικροβιολογία. Με τη ρύθμιση διαφόρων παραμέτρων της SAAT, ενισχύθηκε σημαντικά η παροδική έκφραση του GUS στο βαμβάκι, με χρήση ώριμων εμβρύων ως εκφύτων. Το GUS ανιχνεύθηκε για πρώτη φορά 24h μετά την επώαση των εκφύτων και στις 48h η έκφραση του GUS ήταν πολύ έντονη, γεγονός που αποτέλεσε χρήσιμο δείκτη επιτυχούς μετασχηματισμού του εκφύτου βαμβακιού μετά τον μετασχηματισμό με τη μεσολάβηση Agrobacterium και την υποβοήθηση κατεργασίας με υπερήχους (SAAT). Κατά τη σύγκριση διαφόρων τεχνικών μετασχηματισμού (συγκεκριμένα, βιοβαλλιστικής, Agro, BAAT, SAAT), ο μετασχηματισμός με τη μεσολάβηση Agrobacterium και την υποβοήθηση κατεργασίας με υπερήχους (SAAT) έδειξε μακράν τα καλύτερα αποτελέσματα μετασχηματισμού.

Επιλογή της διαδικασίας μετασχηματισμού με βάση την παροδική έκφραση του GUS. Ο μετασχηματισμός με τη μεσολάβηση Agrobacterium και την υποβοήθηση κατεργασίας με υπερήχους (SAAT) παρουσιάζει σημαντικά υψηλότερη παροδική έκφραση.
(μελέτη και γράφημα: © Hussain et al., 2007)

Λύσεις υπερήχων υψηλής απόδοσης για ηχοπόρωση και SAAT

Η Hielscher Ultrasonics διαθέτει πολυετή εμπειρία στην ανάπτυξη και κατασκευή συσκευών υπερήχων υψηλών επιδόσεων για εργαστήρια, ερευνητικές εγκαταστάσεις καθώς και βιομηχανική παραγωγή με πολύ υψηλή παραγωγική δυναμικότητα. Για τη μικροβιολογία και τις βιοεπιστήμες, η Hielscher προσφέρει διάφορες λύσεις για την κάλυψη των διαφορετικών απαιτήσεων που αφορούν συγκεκριμένους ιστούς και την επεξεργασία τους. Για την ταυτόχρονη κατεργασία πολλών δειγμάτων με υπερήχους, η Hielscher προσφέρει το UIP400MTP για πλάκες πολλαπλών βοθρίων, το VialTweeter για την κατεργασία έως και 10 φιαλιδίων με υπερήχους (π.χ. σωληναρίων Eppendorf) ή το CupHorn υπερήχων. Οι συσκευές υπερήχων τύπου ακίδας καλύπτουν το εύρος ισχύος από 50 έως 400 watts για εργαστηριακούς ομογενοποιητές και από 500 watts έως 16kW για βιομηχανικά συστήματα.
Επικοινωνήστε μαζί μας και ενημερώστε μας για την εφαρμογή σας και τις απαιτήσεις της διεργασίας σας. Το έμπειρο προσωπικό μας θα χαρεί να σας προτείνει την καταλληλότερη συσκευή υπερήχων για τη βιολογική σας διεργασία.
Ο παρακάτω πίνακας παρέχει μια ένδειξη της κατά προσέγγιση δυναμικότητας επεξεργασίας των συσκευών υπερήχων μας: