Ο μετασχηματισμός με τη μεσολάβηση αγροβακτηριδίου με τη βοήθεια υπερήχων (SAAT) είναι μια αποτελεσματική μέθοδος για τη μόλυνση φυτικών κυττάρων με ξένα γονίδια χρησιμοποιώντας το Agrobacterium ως μεταφορέα. Η υπερηχητική σπηλαίωση προκαλεί sonoporation, η οποία μπορεί να περιγραφεί ως στοχευμένη μικρο-πληγή φυτικού ιστού. Μέσω αυτών των υπερήχων δημιουργεί μικρο-πληγές, το DNA και οι φορείς DNA μπορούν να μεταφερθούν αποτελεσματικά στην κυτταρική μήτρα.

Ηχοδιάσκεψη – Υπερηχητικά ενισχυμένος μετασχηματισμός κυττάρων

Όταν ο υπέρηχος χαμηλής συχνότητας (περίπου 20kHz) εφαρμόζεται σε κυτταρικά εναιωρήματα, οι επιδράσεις της ακουστικής σπηλαίωσης προκαλούν παροδική διαπερατότητα μεμβράνης στους κυτταρικούς ιστούς. Αυτό το υπερηχητικό αποτέλεσμα είναι γνωστό ως sonoporation και χρησιμοποιείται για τη μεταφορά γονιδίων σε κύτταρα ή ιστούς.
Τα πλεονεκτήματα της υπερήχων βασίζονται στη μη θερμική μηχανική αρχή εργασίας, γεγονός που καθιστά την υπερήχηση συχνά πιο ευέλικτη και λιγότερο εξαρτημένη από τους τύπους κυττάρων. Η ευέλικτη εφαρμογή του sonoporation ανοίγει τη δυνατότητα στην αξιοποίηση διαγονιδιακών φυτών, τα οποία έχουν σημαντικές δυνατότητες στη βιοπαραγωγή σύνθετων ανθρώπινων θεραπευτικών πρωτεϊνών. Τέτοιοι φυτικοί βιοαντιδραστήρες μπορούν να χειραγωγηθούν εύκολα γενετικά, να αποτρέψουν την πιθανή μόλυνση με παθογόνα του ανθρώπου, να μην βλάψουν τα βακτήρια που μεσολαβούν στον μετασχηματισμό (π.χ. Agrobacterium) και αποτελούν μια φθηνή, αποτελεσματική μέθοδο βιοσυνθεσης.

Υπερηχητικός υποβοηθούμενος μετασχηματισμός κυττάρων

Κατεργασία με υπερήχους είναι μια τεχνική που εφαρμόζει κύματα υπερήχων χαμηλής συχνότητας για την ανάδευση σωματιδίων σε διάλυμα, για την ανάμειξη διαλυμάτων, αυξάνοντας έτσι το ρυθμό μεταφοράς μάζας και διάλυσης. Ταυτόχρονα, υπερήχηση μπορεί να αφαιρέσει διαλυμένα αέρια από υγρά. Στον φυτικό μετασχηματισμό, υπερήχηση θα προκαλέσει το σχηματισμό μικροσυστοιχιών στον φυτικό ιστό και θα ενισχύσει την παράδοση γυμνού DNA στον φυτικό πρωτοπλάστη.

Για τον γενετικό μετασχηματισμό, ο μετασχηματισμός με τη μεσολάβηση agrobacterium με τη βοήθεια υπερήχων (SAAT) είναι η προτιμώμενη μέθοδος και έχει σημαντικά υψηλότερη αποτελεσματικότητα από την υπερήχηση που χρησιμοποιείται για τη μεταφορά γυμνού DNA και φορέων DNA απευθείας στον πρωτοπλάστη. Πολυάριθμες μελέτες έχουν δείξει ότι η υποβοηθούμενη από υπερήχους μετασχηματισμός με τη μεσολάβηση του Agrobacterium (SAAT) μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να προκαλέσει μηχανική διαταραχή και σχηματισμό τραυμάτων στα φυτικά κύτταρα από κύματα υπερήχων και την προκύπτουσα ακουστική σπηλαίωση. Μια σύντομη υπερηχητική θεραπεία δημιουργεί μικρο-πληγές στην επιφάνεια των εκβλαστών. Καθώς τα τραυματισμένα κύτταρα θα επιτρέψουν τη διείσδυση του Agrobacterium στο βαθύτερο τμήμα των φυτικών ιστών, αυξάνοντας έτσι την πιθανότητα μόλυνσης των φυτικών κυττάρων. Επιπλέον, οι εκκρινόμενες φαινολικές ενώσεις ενισχύουν τον μετασχηματισμό. Τα υπερηχητικά παραγόμενα μικρο-τραύματα καθιστούν επίσης πιο εφικτή τη διείσδυση των βακτηρίων. Το SAAT χρησιμοποιήθηκε με επιτυχία για γενετικό μετασχηματισμό σε φυτικά είδη που θεωρούνται ιδιαίτερα ανθεκτικά στο Agrobacterium.
Όντας μια πολύ απλή και φθηνή μέθοδος, καθώς και η σημαντική ενίσχυση της μεταφοράς γονιδίων με τη μεσολάβηση του Agrobacterium είναι τα σημαντικότερα πλεονεκτήματα του SAAT. Εκτός από την επιτυχή εφαρμογή του SAAT στον μετασχηματισμό των Chenopodium rubrum L. και Beta vulgaris L., αυτή η προσέγγιση έχει επίσης εφαρμοστεί στην παραγωγή ανασυνδυασμένων Escherichia coli άγριου τύπου θερμικά ασταθή ολοτοξίνη και ανοσοενισχυτικών εμβολίων LT μεταλλαγμένων εμβολίων Escherichia coli στο Nicotiana tabacum, στα οποία ανιχνεύθηκαν οι υψηλότεροι συστηματικοί τίτλοι IgG ειδικά για LT-B σε πτηνά.
(πρβλ. Λάερ κ.ά., 2016, Μ. Κλίμεκ-Τσαντάκα και Ρ. Μπαράνσκι, 2014)

Γενική διαδικασία μεταφοράς γονιδίων μέσω υπερηχοπόρωσης σε φυτικά κύτταρα

1. Παρασκευή γενετικού υλικού: Ξεκινήστε προετοιμάζοντας το γενετικό υλικό που θέλετε να εισαγάγετε στα φυτικά κύτταρα. Αυτό θα μπορούσε να είναι πλασμιδικό DNA, RNA ή άλλα νουκλεϊνικά οξέα.
2. Απομόνωση φυτικών κυττάρων: Απομονώστε τα φυτικά κύτταρα που θέλετε να στοχεύσετε. Ανάλογα με το πείραμά σας, αυτά τα κύτταρα μπορούν να απομονωθούν από φυτικούς ιστούς ή καλλιέργειες.
3. Κυτταρικό εναιώρημα: Εναιωρήστε τα φυτικά κύτταρα σε κατάλληλο μέσο ή ρυθμιστικό διάλυμα. Αυτό είναι απαραίτητο για να διασφαλιστεί ότι τα κύτταρα είναι υγιή και σε κατάσταση που ευνοεί την πρόσληψη γονιδίων.
4. Ρυθμίστε το Sonicator σας: Προετοιμάστε τον υπερηχητή τύπου καθετήρα σας με προ-ρύθμιση παραμέτρων υπερήχων όπως πλάτος, χρόνος, ενέργεια και θερμοκρασία. Βυθίστε τον υπερηχητικό καθετήρα στο κυτταρικό εναιώρημα.
5. Η κατεργασία με υπερήχους: Ξεκινήστε τη διαδικασία υπερήχων. Η ταχεία ταλάντωση του άκρου του καθετήρα δημιουργεί φυσαλίδες σπηλαίωσης στο υγρό. Αυτές οι φυσαλίδες επεκτείνονται και καταρρέουν λόγω των υπερηχητικών κυμάτων, δημιουργώντας μηχανικές δυνάμεις και μικροροή στην ανάρτηση.
6. Sonoporation: Οι μηχανικές δυνάμεις και η μικροροή που παράγονται από τη σπηλαίωση δημιουργούν προσωρινά πόρους και τρύπες στις μεμβράνες των φυτικών κυττάρων. Το γενετικό υλικό που υπάρχει στο εναιώρημα μπορεί να εισέλθει στα φυτικά κύτταρα μέσω αυτών των πόρων.
7. Επώαση: Μετά τη θεραπεία sonoporation, επωάστε τα φυτικά κύτταρα για να τους επιτρέψετε να ανακάμψουν και να σταθεροποιήσουν τις μεμβράνες τους. Αυτό είναι ένα κρίσιμο βήμα για να εξασφαλιστεί η επιβίωση των κυττάρων και η επιτυχής μεταφορά γονιδίων.

Μεταφορά γονιδίων μέσω Agrobacterium ή λιποσωμάτων

Υπάρχουν δύο κοινές μορφές για τη μετάγγιση φυτικών κυττάρων. Χρησιμοποιούν είτε agrobacterium, ένα γένος Gram-αρνητικών βακτηρίων, είτε λιποσώματα ως φορέα του γενετικού υλικού.

• Sonoporation με μεσολάβηση αγροβακτηριδίου: Το Agrobacterium tumefaciens είναι ένα βακτήριο που χρησιμοποιείται συνήθως στη γενετική μηχανική φυτών. Σε αυτή τη μέθοδο, το πλασμιδικό DNA που περιέχει το επιθυμητό γονίδιο εισάγεται στο Agrobacterium, το οποίο στη συνέχεια αναμιγνύεται με φυτικά κύτταρα. Το κυτταρικό εναιώρημα υποβάλλεται σε sonoporation χρησιμοποιώντας έναν υπερηχητικό τύπο καθετήρα. Η υπερηχητική ενέργεια ενισχύει τη μεταφορά του γενετικού υλικού από το Agrobacterium στα φυτικά κύτταρα. Αυτή η μέθοδος χρησιμοποιείται ευρέως για τη γενετική τροποποίηση των φυτών.
• Υπερηχοπόρωση με μεσολάβηση λιποσωμάτων: Τα λιποσώματα είναι κυστίδια με βάση τα λιπίδια που μπορούν να μεταφέρουν γενετικό υλικό. Σε αυτή τη μέθοδο, λιποσώματα φορτωμένα με πλασμιδικό DNA ή άλλα νουκλεϊνικά οξέα αναμιγνύονται με φυτικά κύτταρα. Sonoporation χρησιμοποιώντας έναν υπερήχων τύπου καθετήρα χρησιμοποιείται για να διευκολύνει την πρόσληψη λιποσωμάτων από φυτικά κύτταρα. Ο υπέρηχος διαταράσσει τις λιπιδικές διπλοστιβάδες των λιποσωμάτων, απελευθερώνοντας το γενετικό υλικό στα φυτικά κύτταρα. Αυτή η προσέγγιση είναι χρήσιμη για μελέτες παροδικής γονιδιακής έκφρασης σε φυτικά κύτταρα.

Επιστημονικά αποδεδειγμένα οφέλη του μετασχηματισμού με τη μεσολάβηση αγροβακτηριδίου με υπερήχους (SAAT)

Ο μετασχηματισμός με τη μεσολάβηση αγροβακτηριδίου με τη βοήθεια υπερήχων (SAAT) έχει εφαρμοστεί σε πολλά είδη φυτών. Μια σύντομη και σχετικά ήπια υπερηχητική επεξεργασία των καλλιεργειών φυτικών κυττάρων προκαλεί sonoporation, η οποία στη συνέχεια επιτρέπει μια βαθιά διείσδυση του Agrobacterium ως μεταφορέα γονιδίων. Παρακάτω μπορείτε να διαβάσετε υποδειγματικές μελέτες που αποδεικνύουν τα ευεργετικά αποτελέσματα του SAAT.

Υπερηχητικά υποβοηθούμενος μετασχηματισμός του Ashwagandha

Προκειμένου να βελτιωθεί η αποτελεσματικότητα μετασχηματισμού στο W. somnifera (γνωστό ως ashwagandha ή χειμερινό κεράσι), ο Dehdashti και οι συνεργάτες του (2016) διερεύνησαν τη χρήση ακετοσυριγγόνης (AS) και υπερήχησης.
Η ακετοσυριγγόνη (AS) προστέθηκε σε τρία στάδια: υγρή καλλιέργεια Agrobacterium, μόλυνση από Agrobacterium και συν-καλλιέργεια εκφυτευμάτων με Agrobacterium. Η προσθήκη 75 μM AS στην υγρή καλλιέργεια Agrobacterium βρέθηκε να είναι η βέλτιστη για την επαγωγή γονιδίων vir.
Η πρόσθετη εφαρμογή της υπερήχησης (SAAT) είχε ως αποτέλεσμα την υψηλότερη γονιδιακή έκφραση. Η γονιδιακή έκφραση gusA στις τριχωτές ρίζες βρέθηκε να είναι καλύτερη όταν τα φύλλα και οι άκρες των βλαστών ήταν sonicated για 10 και 20s, αντίστοιχα. Η απόδοση μετασχηματισμού του βελτιωμένου πρωτοκόλλου καταγράφηκε 66,5 και 59,5% στην περίπτωση των εκβλαστών φύλλων και βλαστών, αντίστοιχα. Σε σύγκριση με άλλα πρωτόκολλα, η απόδοση μετασχηματισμού αυτού του βελτιωμένου πρωτοκόλλου βρέθηκε να είναι 2,5 φορές υψηλότερη για τα φύλλα και 3,7 φορές μεγαλύτερη για τις άκρες των βλαστών. Οι αναλύσεις της νότιας κηλίδας επιβεβαίωσαν 1-2 αντίγραφα του διαγονιδίου gusA στις γραμμές W1-W4, ενώ 1-4 διαγονιδιακά αντίγραφα ανιχνεύθηκαν στη γραμμή W5 που δημιουργήθηκε από το βελτιωμένο πρωτόκολλο.

Επίδραση της διάρκειας του μετασχηματισμού με τη μεσολάβηση αγροβακτηριδίου (SAAT) με τη βοήθεια υπερήχων στη συχνότητα μετασχηματισμού των φύλλων W. somnifera (α) και των βλαστών (β)
(μελέτη και γραφική παράσταση: © Ντεχντάστι κ.ά., 2016)

Υπερηχητικά υποβοηθούμενος μετασχηματισμός του βαμβακιού

Hussain et al. (2007) αποδεικνύουν τις ευεργετικές επιδράσεις του μετασχηματισμού βαμβακιού με υπερήχους. Η ακουστική σπηλαίωση που προκαλείται από υπερήχους χαμηλής συχνότητας δημιουργεί μικρο-τραύματα πάνω και κάτω από την επιφάνεια του φυτικού ιστού (sonoporation) και επιτρέπει στο Agrobacterium να ταξιδεύει βαθύτερα και πλήρως σε όλο τον φυτικό ιστό. Αυτή η τραυματική μόδα αυξάνει την πιθανότητα μόλυνσης φυτικών κυττάρων που βρίσκονται βαθύτερα στον ιστό. Προκειμένου να αξιολογηθεί η αποτελεσματικότητα μετασχηματισμού του SAAT, μετρήθηκε η γονιδιακή έκφραση GUS. Το σύστημα αναφοράς GUS είναι ένα γονιδιακό σύστημα αναφοράς, ιδιαίτερα χρήσιμο στη μοριακή βιολογία φυτών και τη μικροβιολογία. Ρυθμίζοντας διάφορες παραμέτρους SAAT, η παροδική έκφραση GUS στο βαμβάκι χρησιμοποιώντας ώριμα έμβρυα ως έκφυτο ενισχύθηκε σημαντικά. Το GUS ανιχνεύθηκε για πρώτη φορά 24 ώρες μετά την επώαση των φυτών και από 48 ώρες, η έκφραση GUS ήταν πολύ έντονη, γεγονός που χρησίμευσε ως χρήσιμος δείκτης επιτυχούς μετασχηματισμού του εκφυτεμένου βαμβακιού μετά από κατεργασία με υπερήχους υποβοηθούμενο μετασχηματισμό Agrobacterium (SAAT). Η σύγκριση των διαφόρων τεχνικών μετασχηματισμού (δηλαδή βιολιστική, Agro, BAAT, SAAT), με υποβοήθηση υπερήχων Agrobacterium-μεσολαβούμενο μετασχηματισμό (SAAT) έδειξε μακράν τα καλύτερα αποτελέσματα του μετασχηματισμού.

Επιλογή διαδικασίας μετασχηματισμού με βάση την παροδική έκφραση του GUS. Ο μετασχηματισμός με τη μεσολάβηση αγροβακτηριδίου με τη βοήθεια υπερήχων (SAAT) παρουσιάζει σημαντικά υψηλότερη παροδική έκφραση.
(μελέτη και γραφική παράσταση: © Hussain et al., 2007)

Υπερηχητικές λύσεις υψηλής απόδοσης για Sonoporation και SAAT

Hielscher Υπέρηχοι είναι εδώ και πολύ καιρό εμπειρία στην ανάπτυξη και την κατασκευή υπερήχων υψηλής απόδοσης για εργαστήρια, ερευνητικές εγκαταστάσεις, καθώς και βιομηχανική παραγωγή με πολύ υψηλές αποδόσεις. Για τη μικροβιολογία και τις βιοεπιστήμες, η Hielscher προσφέρει διάφορες λύσεις για να ικανοποιήσει διαφορετικές απαιτήσεις που είναι απαραίτητες για συγκεκριμένους ιστούς και τις θεραπείες τους. Για την ταυτόχρονη υπερήχους πολλών δειγμάτων Hielscher προσφέρει το UIP400MTP για πλάκες πολλαπλών κοιλοτήτων, το VialTweeter για την υπερήχηση έως και 10 φιαλιδίων (π.χ. σωλήνες Eppendorf) ή το υπερηχητικό CupHorn. Οι υπερηχητικοί ανιχνευτές τύπου είναι διαθέσιμοι από 50 έως 400 Watt ως εργαστηριακοί ομογενοποιητές, ενώ τα βιομηχανικά συστήματα καλύπτουν το εύρος ισχύος από 500 Watt έως 16kW.
Επικοινωνήστε μαζί μας και ενημερώστε μας για τις απαιτήσεις της αίτησής σας και της διαδικασίας. Το έμπειρο προσωπικό μας θα χαρεί να συστήσει τον πιο κατάλληλο υπερηχητικό για τη βιολογική σας διαδικασία.
Ο παρακάτω πίνακας σας δίνει μια ένδειξη για την κατά προσέγγιση ικανότητα επεξεργασίας των υπερήχων μας: