Prøveforberedelse med høj gennemløbskapacitet til mitokondriel diagnostik
Mitokondriel diagnostik inden for forskning og klinisk praksis udføres ved hjælp af forskellige teknikker såsom sekventering, PCR og biokemiske analyser. Disse metoder bruges til at identificere DNA-mutationer og måle mitokondriefunktionen. Sekventering hjælper med at påvise genetiske mutationer, mens PCR kan kvantificere specifikke DNA-sekvenser. Biokemiske analyser vurderer mitokondrielle proteiners og enzymers funktionalitet.
Diagnosticering af mitokondrielle sygdomme er særligt vanskelig på grund af disse sygdommes udtalte kliniske variabilitet samt det komplekse samspil mellem to genomer, der nedarves forskelligt: mitokondrielt DNA (mtDNA) og det nukleære genom.
DNA-ekstraktion og fragmentering ved hjælp af sonikering
DNA-ekstraktion fra muskelvæv er særligt nyttig, når der er mistanke om vævsspecifikke ændringer i mtDNA. Disse ændringer kan omfatte deletioner i mtDNA ved kronisk progressiv ekstern oftalmoplegi (CPEO), punktmutationer i mtDNA ved mitokondrielle myopatier eller depletering af mtDNA ved Alpers syndrom. Det DNA, der ekstraheres fra muskelvæv, kan derefter bruges til forskellige genetiske tests, såsom Southern blot og langtrækkende PCR til deletioner, realtids-PCR til depletering eller sekventering til punktmutationer.
Sonikering med intense ultralydsbølger anvendes til flere formål inden for mitokondriel diagnostik. Den bruges til at lysere celler for at ekstrahere intracellulært indhold såsom mitokondrier og DNA, til at fragmentere DNA såsom mtDNA og nDNA ved forskydningskræfter til sekventering og til at homogenisere prøver.
Pladesonikatoren UIP400MTP til prøveforberedelse med høj gennemløbskapacitet sonikerer prøver ensartet i multibrøndsplader og 96-brøndsplader
Sådan isoleres mitokondrier fra celler og væv
Isolering af mitokondrier omfatter to væsentlige trin: nedbrydning af celler for at frigive deres indhold og anvendelse af differentialcentrifugering til at adskille og opsamle mitokondriefraktioner.
Sonikering
Hielschers sonikatorer er kompatible med standardlysebuffere og -kits, hvilket gør dem velegnede til isolering af mitokondrier. Sonikering tjener to hovedformål:
- Cellelyse: Ultralydsbølgerne nedbryder cellemembranerne og frigiver det intracellulære indhold.
- Nedbrydning af mitokondrier: Sonikering i et efterfølgende trin kan bryde mitokondrierne op for at frigive mitokondrielle proteiner eller mitokondrielt DNA.
- mtDNA-fragmentering: Sonikering er en pålidelig teknik til at fragmentere mitokondrielt DNA ved forskydningskræfter til sekventering.
Multibrøndspladesonikatoren UIP400MTP muliggør prøveforberedelse af mitokondrieprøver med høj gennemløbskapacitet. Sammen med differentialcentrifugering øger sonikering effektiviteten af mitokondrieisolering og sikrer høje udbytter af intakte mitokondrier, der er velegnede til forskellige efterfølgende anvendelser.
Multibrøndspladesonikatoren Hielscher UIP400MTP fungerer med enhver standardplade
Multibrøndspladesonikatoren UIP400MTP giver adskillige fordele ved prøveforberedelse med høj gennemløbskapacitet, f.eks. inden for mitokondriel diagnostik.
Multibrøndspladesonikatoren UIP400MTP til prøveforberedelse med høj gennemløbskapacitet inden for biomarkørdiagnostik.
Eksempel på fremgangsmåde til mtDNA-fragmentering med ultralyd
Forberedelse og ekstraktion:
- C57BL/6-mus blev aflivet ved cervikal dislokation.
- Leverne blev hurtigt udtaget og vasket i iskold, steril PBS.
Isolering af mitokondrier:
- Mitokondrier blev isoleret ved hjælp af en 2-mL Dounce-vævshomogenisator og et Mitochondria Isolation Kit for Tissue.
- Indledende centrifugering ved 700× g og 3.000× g.
- Udfør to yderligere vasketrin med buffer C.
DNA-isolering:
- Pelleten fra den første centrifugering ved 700× g blev brugt til at isolere nukleært DNA (nDNA).
- DNA blev isoleret ved hjælp af spin-kolonner.
- Mitokondrielt DNA (mtDNA) blev ekstraheret fra isolerede mitokondrier.
- Nukleært DNA (nDNA) blev ekstraheret fra rå kerneekstrakter, begge fra muselevervæv.
DNA-fragmentering:
- DNA blev fragmenteret på is ved hjælp af en 30-kHz/50-W ultralydssonikator UP50H med en 0,5-mm sonotrode med mikrospids ved 14 μm i 2 × 30 sekunder.
Visualisering og kvantificering af fragmentering:
- Fragmenteringen efter sonikering blev visualiseret på en 1% agarosegel med SYBR safe DNA-farvestof.
- De relative mængder af mtDNA og nDNA blev bestemt ved qPCR.
(jf. Mariero et al., 2019)
Til prøveforberedelse med høj gennemløbskapacitet letter multibrøndspladesonikatoren UIP400MTP forberedelsen af et stort antal prøver i standardplader med 96 brønde, multibrøndsplader og mikrotiterplader.
Læs mere om fordelene ved prøveforberedelse med høj gennemløbskapacitet ved hjælp af UIP400MTP!
Tips til optimal isolering af mitokondrier ved hjælp af sonikering:
- Temperaturkontrol: Udfør alle trin i temperaturintervallet fra 0°C til 4°C. Dette er afgørende for at bevare mitokondriernes integritet og funktionalitet.
- Effektivitet og hastighed: Arbejd hurtigt, og oprens kun mitokondrierne i det omfang, der kræves til din specifikke anvendelse. Overdreven håndtering kan føre til betydelige tab af mitokondrielt indhold.
- Fortynding af suspensioner: Hold koncentrationerne af celle- og organelsuspensioner lave under hele isoleringsprocessen. Dette hjælper med at minimere risikoen for indeslutning og agglutination og forbedrer dermed renheden af de isolerede mitokondrier.
- Prøvevolumen: Vælg flere præparationer i lille skala frem for en enkelt stor. Denne tilgang giver typisk bedre udbytter, da opskalering ikke øger mængden af mitokondrier, der kan udvindes, proportionalt. Multibrøndspladesonikatoren UIP400MTP letter hurtig og pålidelig cellelyse til isolering af mitokondrier samt ekstraktion af proteiner fra mitokondrier.
Disse retningslinjer vil gøre isoleringsprocessen med ultralydslyse og centrifugering mere effektiv og give mitokondriepræparationer af høj kvalitet, der er velegnede til efterfølgende anvendelser.
Hielscher sonikatorer – kvalitet fremstillet i Tyskland
Hielschers ultralydsapparater er kendt for deres højeste kvalitets- og designstandarder. Robusthed og nem betjening muliggør problemfri integration af vores ultralydsapparater i industrielle anlæg. Hielschers ultralydsapparater klarer nemt barske forhold og krævende miljøer.
Hielscher Ultrasonics er en ISO-certificeret virksomhed og lægger særlig vægt på højtydende ultralydsapparater med den nyeste teknologi og brugervenlighed. Hielschers ultralydsapparater er naturligvis CE-kompatible og opfylder kravene fra UL, CSA og RoHs.
96-brøndspladesonikator UIP400MTP til sonikering af mikrotiterplader og multibrøndsplader
Litteratur / referencer
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- UIP400MTP-Multi-well-Plate-Sonicator-Infographic
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
Ofte stillede spørgsmål om mitokondrier og mitokondriel diagnostik
Hvad er mitokondrier?
Mitokondrier er membranbundne organeller, som findes i cellerne hos de fleste eukaryote organismer. De er kendt som cellens kraftværker, fordi de producerer energi i form af adenosintrifosfat (ATP) gennem cellulær respiration. Derudover har mitokondrier deres eget DNA og spiller centrale roller i andre cellulære processer, herunder regulering af cellecyklus og celledød.
Hvad adskiller mtDNA fra genomisk DNA?
Mitokondrielt DNA (mtDNA) adskiller sig fra genomisk DNA (gDNA) på flere væsentlige måder. MtDNA findes i mitokondrierne, er cirkulært og nedarves fra moderen, mens gDNA findes i cellekernen, er lineært og nedarves fra begge forældre. MtDNA er meget mindre og koder kun for 37 gener, mens gDNA indeholder omkring 20.000–25.000 gener. MtDNA findes i flere kopier pr. celle, har en højere mutationsrate og koder primært for proteiner, der er involveret i mitokondriefunktionen. Derimod er gDNA typisk diploidt, har en lavere mutationsrate og koder for en lang række gener, der er nødvendige for organismens udvikling og funktion. Derudover foregår transkription og translation af mtDNA i mitokondrierne, mens transkription af gDNA foregår i cellekernen, og translation foregår i cytoplasmaet. Disse forskelle afspejler deres forskellige roller og evolutionære oprindelse.
Hvad er et cellefrit ekstrakt?
Et cellefrit ekstrakt er en opløsning, der indeholder indholdet af lyserede celler, herunder proteiner, nukleinsyrer og andre cellulære komponenter, men uden intakte cellemembraner. Dette ekstrakt bruges i biokemisk og molekylærbiologisk forskning til at undersøge cellulære processer in vitro, hvilket gør det muligt for forskere at analysere reaktioner og mekanismer uden for levende celler.
Hvilken rolle spiller PCR-tests i mitokondriel diagnostik?
PCR-tests spiller en afgørende rolle i mitokondriel diagnostik ved at muliggøre påvisning af mutationer, deletioner eller variationer i kopiantallet af mitokondrielt DNA (mtDNA). De muliggør amplifikation af specifikke mtDNA-regioner for at identificere patogene varianter forbundet med mitokondrielle sygdomme. PCR-baserede teknikker, såsom kvantitativ PCR (qPCR) og langtrækkende PCR, bruges også til at vurdere mtDNA-integritet, heteroplasminiveauer og mtDNA-depletering og giver dermed væsentlig indsigt i mitokondriefunktion og sygdom.
Læs, hvordan mikropladesonikatoren UIP400MTP letter PCR-tests og -analyser!
Hvad er differentialcentrifugering?
Differentialcentrifugering er en meget anvendt teknik til cellefraktionering og isolering af mitokondrier. Denne metode adskiller cellulære strukturer ud fra deres sedimentationskoefficient, som afhænger af både densitet og form. Processen indebærer, at prøver i bufferholdige saltopløsninger med specifikke densiteter udsættes for forskellige niveauer af centrifugalkraft. Strukturer med lignende sedimentationskoefficienter vil bundfælde sig i bunden af opsamlingsrøret samtidig, så de kan opsamles.
Hvordan bruges differentialcentrifugering til isolering af mitokondrier?
Differentialcentrifugering gør det muligt for forskere effektivt at adskille mitokondriefraktioner fra andre cellulære komponenter. Isolering af mitokondrier omfatter flere centrifugeringstrin og efterfølgende opsamling af isolatet.
Indledende centrifugering: Anvend en lav centrifugalkraft til at sedimentere store cellerester og cellekerner.
Efterfølgende centrifugeringer: Øg centrifugalkraften trinvist for at danne pellets af fraktioner beriget med mitokondrier. Hvert centrifugeringstrin fjerner strukturer med gradvist højere sedimentationskoefficienter.
Opsamling af fraktioner: Efter hver centrifugering opsamles pelleten, og supernatanten udsættes for højere g-kræfter for at isolere den næste fraktion. Dette gentages, indtil den ønskede renhed af mitokondrierne er opnået.