Prøveforberedelse med høj kapacitet til mitokondriediagnostik
Mitokondriediagnostik i forskning og klinikker udføres ved hjælp af forskellige teknikker såsom sekventering, PCR og biokemiske analyser. Disse metoder bruges til at identificere DNA-mutationer og måle mitokondriefunktion. Sekventering hjælper med at opdage genetiske mutationer, mens PCR kan kvantificere specifikke DNA-sekvenser. Biokemiske analyser evaluerer funktionaliteten af mitokondrielle proteiner og enzymer.
Diagnosticeringen af mitokondriesygdomme er især vanskelig på grund af den udtalte kliniske variation af disse sygdomme samt på grund af den komplekse interaktion mellem to forskelligt arvelige genomer: mitokondrie-DNA (mtDNA) og kernegenomet.
DNA-ekstraktion og fragmentering ved hjælp af sonikering
DNA-ekstraktion fra muskelvæv er især nyttig, når der er mistanke om vævsspecifikke ændringer i mtDNA. Disse ændringer kan omfatte sletninger af mtDNA i kronisk progressiv ekstern oftalmoplegi (CPEO), punktmutationer af mtDNA i mitokondrielle myopatier eller udtømning af mtDNA i Alpers syndrom. DNA'et ekstraheret fra muskelvæv kan derefter bruges til forskellige genetiske tests, såsom Southern blot og langtrækkende PCR til deletioner, realtids-PCR til udtømning eller sekventering for punktmutationer.
Sonikering, ved hjælp af intense ultralydsbølger, anvendes til flere applikationer inden for mitokondriediagnostik. Det bruges til at lyse celler til at ekstrahere intracellulært indhold såsom mitokondrier og DNA, til at klippe DNA såsom mtDNA og nDNA til sekventering og til at homogenisere prøver.
UIP400MTP Plate Sonicator til prøveforberedelse med høj kapacitet sonikerer prøver ensartet i plader med flere og 96 brønde
Sådan isoleres mitokondrier fra celler og væv
Mitokondrieisolering omfatter to væsentlige trin: forstyrrelse af celler for at frigive deres indhold og anvendelse af differentiel centrifugering til at adskille og genvinde mitokondriefraktioner.
Sonikering
Hielscher sonikere er kompatible med standard lysisbuffere og sæt, hvilket gør dem velegnede til isolering af mitokondrier. Sonikering tjener to hovedformål:
- Cellelyse: Ultralydsbølgerne forstyrrer cellemembraner og frigiver intracellulært indhold.
- Mitokondriel forstyrrelse: Sonikering i et efterfølgende trin kan bryde mitokondrierne op for at frigive mitokondrieproteiner eller mitokondrie-DNA.
- mtDNA-fragmentering: Sonikering er en pålidelig teknik til at skære mitokondrie-DNA til sekventering.
Multi-brønds plade sonicator giver UIP400MTP mulighed for prøveforberedelse med høj kapacitet af mitokondrieprøver. I forbindelse med differentiel centrifugering forbedrer sonikering effektiviteten af mitokondrieisolering, hvilket sikrer høje udbytter af intakte mitokondrier, der er egnede til forskellige downstream-applikationer.
Hielscher UIP400MTP multiwell plade soniker Fungerer med enhver standardplade
Multi-brønds plade sonikator UIP400MTP tilbyder adskillige fordele ved prøveforberedelse med høj kapacitet, f.eks. i mitokondriediagnostik.
UIP400MTP Multiwell Plate Sonicator til prøveforberedelse med høj kapacitet i biomarkørdiagnostik.
Eksempler på instruktioner til ultralyd mtDNA-fragmentering
Forberedelse og ekstraktion:
- C57BL/6 mus blev dræbt af cervikal dislokation.
- Leveren blev hurtigt udtaget og vasket i iskold steril PBS.
Mitokondrier isolering:
- Mitokondrier blev isoleret ved hjælp af en 2-ml Dounce vævssliber og et mitokondrieisoleringssæt til væv.
- Indledende centrifugering ved 700× g og 3.000× g.
- Udfør yderligere to vasketrin med buffer C.
DNA-isolering:
- Pelleten fra den første centrifugering ved 700× g blev brugt til at isolere nukleart DNA (nDNA).
- DNA blev isoleret ved hjælp af spin-kolonner.
- Mitokondrie-DNA (mtDNA) blev ekstraheret fra isolerede mitokondrier.
- Nukleart DNA (nDNA) blev ekstraheret fra rå nukleare ekstrakter, begge fra muselevervæv.
DNA-fragmentering:
- DNA blev fragmenteret på is ved hjælp af en 30 kHz / 50 W ultralyd soniker UP50H med en 0,5 mm mikrospids sonotrode ved 14 μm i 2 × 30 sekunder.
Fragmenteringsvisualisering og kvantificering:
- Fragmentering efter ultralydsbehandling blev visualiseret på en 1% agarosegel med SYBR sikkert DNA-farvestof.
- Den relative forekomst af mtDNA og nDNA blev bestemt ved qPCR.
(jf. Mariero et al., 2019)
Til prøveforberedelse med høj kapacitet letter multi-brønds pladesonikeren UIP400MTP forberedelsen af store prøvenumre i standard 96-brønds-, multi-brønd- og mikrotiterplader.
Læs mere om fordelene ved prøveforberedelse med høj kapacitet ved hjælp af UIP400MTP!
Tips til optimal mitokondrieisolering ved hjælp af sonikering:
- Temperaturkontrol: Udfør alle trin ved et temperaturområde på 0°C til 4°C. Dette er afgørende for at opretholde mitokondriernes integritet og funktionalitet.
- Effektivitet og hastighed: Arbejd hurtigt og rens kun mitokondrierne i det omfang, det er nødvendigt for din specifikke anvendelse. Overdreven manipulation kan føre til betydelige tab af mitokondrieindhold.
- Fortynding af suspensioner: Oprethold lave koncentrationer af celle- og organelsuspensioner under hele isoleringsprocessen. Dette hjælper med at minimere risikoen for fælde og agglutinering og forbedrer derved renheden af de isolerede mitokondrier.
- Sample volumen: Vælg flere små præparater frem for en enkelt stor. Denne tilgang resulterer typisk i bedre udbytter, da opskalering ikke forholdsmæssigt øger mængden af genvindelige mitokondrier. Multi-brønds plade sonikeren UIP400MTP letter den hurtige og pålidelige lysering af cellen til mitokondrieisolering samt proteinekstraktion fra mitokondrier.
Disse retningslinjer vil gøre isoleringsprocessen ved hjælp af ultralydslyse og centrifugering mere effektiv, hvilket giver mitokondriepræparater af høj kvalitet, der er egnede til downstream-applikationer.
Hielscher Sonicators – Kvalitet fremstillet i Tyskland
Hielscher ultralydapparater er kendt for deres højeste kvalitet og designstandarder. Robusthed og nem betjening muliggør en jævn integration af vores ultralydapparater i industrielle faciliteter. Hårde forhold og krævende miljøer håndteres let af Hielscher ultralydsapparater.
Hielscher Ultrasonics er et ISO-certificeret firma og lægger særlig vægt på højtydende ultralydapparater med avanceret teknologi og brugervenlighed. Selvfølgelig er Hielscher ultralydapparater CE-kompatible og opfylder kravene i UL, CSA og RoHs.
96-brønds plade soniker UIP400MTP til sonikering af mikrotiter- og multiwell-plader
Litteratur / Referencer
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- UIP400MTP-Multi-well-Plate-Sonicator-Infographic
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
Ofte stillede spørgsmål om mitokondrier og mitokondriediagnostik
Hvad er mitokondrier?
Mitokondrier er membranbundne organeller, der findes i cellerne i de fleste eukaryote organismer. De er kendt som cellens kraftcentre, fordi de producerer energi i form af adenosintrifosfat (ATP) gennem processen med cellulær respiration. Derudover har mitokondrier deres eget DNA og spiller nøgleroller i andre cellulære processer, herunder regulering af cellecyklussen og celledød.
Hvad adskiller mtDNA fra genomisk DNA?
Mitokondrie-DNA (mtDNA) adskiller sig fra genomisk DNA (gDNA) på flere vigtige måder. MtDNA er placeret i mitokondrierne, er cirkulært og er maternelt nedarvet, hvorimod gDNA er placeret i cellekernen, er lineært og arves fra begge forældre. MtDNA er meget mindre og koder kun for 37 gener, mens gDNA indeholder omkring 20.000-25.000 gener. MtDNA er til stede i flere kopier pr. celle, har en højere mutationshastighed og koder primært for proteiner involveret i mitokondriefunktion. I modsætning hertil er gDNA typisk diploide, har en lavere mutationshastighed og koder for en lang række gener, der er nødvendige for organismens udvikling og funktion. Derudover forekommer mtDNA-transkription og translation i mitokondrierne, hvorimod gDNA-transkription forekommer i kernen, og translation sker i cytoplasmaet. Disse forskelle afspejler deres forskellige roller og evolutionære oprindelse.
Hvad er cellefrit ekstrakt?
Et cellefrit ekstrakt er en opløsning, der indeholder indholdet af lyserede celler, herunder proteiner, nukleinsyrer og andre cellulære komponenter, men uden intakte cellemembraner. Dette ekstrakt bruges i biokemisk og molekylærbiologisk forskning til at studere cellulære processer in vitro, hvilket gør det muligt for forskere at analysere reaktioner og mekanismer uden for levende celler.
Hvilket rollespil PCR-tests i mitokondriediagnostik?
PCR-tests spiller en afgørende rolle i mitokondriediagnostik ved at muliggøre påvisning af mutationer, deletioner eller kopiantalsvariationer i mitokondrie-DNA (mtDNA). De giver mulighed for amplifikation af specifikke mtDNA-regioner for at identificere patogene varianter forbundet med mitokondrielidelser. PCR-baserede teknikker, såsom kvantitativ PCR (qPCR) og langtrækkende PCR, bruges også til at vurdere mtDNA-integritet, heteroplasmaniveauer og mtDNA-udtømning, hvilket giver vigtig indsigt i mitokondriefunktion og sygdom.
Lær, hvordan UIP400MTP Microplate Sonicator letter PCR-tests og -analyser!
Hvad er differentiel centrifugering?
Differentiel centrifugering er en meget anvendt teknik til cellefraktionering og mitokondrieisolering. Denne metode adskiller cellulære strukturer baseret på deres sedimentationskoefficient, som afhænger af både densitet og form. Processen involverer påføring af forskellige niveauer af centrifugalkraft på prøver i bufferede saltopløsninger med specifikke tætheder. Strukturer med lignende sedimentationskoefficienter vil sætte sig i bunden af opsamlingsrøret på samme tid, hvilket giver mulighed for deres genopretning.
Hvordan bruges differentiel centrifugering til mitokondrieisolering?
Differentiel centrifugering giver forskere mulighed for effektivt at adskille mitokondriefraktioner fra andre cellulære komponenter. Isolering af mitokondrier involverer flere centrifugeringstrin og den efterfølgende gendannelse af isolatet.
Indledende centrifugering: Påfør en lav centrifugalkraft på sedimentering af store cellulære affald og kerner.
Efterfølgende centrifugeringer: Øg centrifugalkraften trinvis til pillefraktioner beriget med mitokondrier. Hvert centrifugeringstrin fjerner strukturer med gradvist højere sedimentationskoefficienter.
Fraktion genvinding: Efter hver centrifugering opsamles pelleten, og supernatanten udsættes for højere g-kræfter for at isolere den næste fraktion. Dette gentages, indtil den ønskede renhed af mitokondrier er opnået.