Ultrazvuková příprava lipozomu

Ultrazvukem produkované liposomy vykazují velmi vysokou účinnost zachytávání, vysokou zatěžovací kapacitu a rovnoměrně malou sférickou velikost. Ultrazvukové liposomy tak nabízejí vynikající biologickou dostupnost. Hielscher Ultrasonics nabízí ultrasonicators pro spolehlivou výrobu liposomů farmaceutické kvality v dávkovém a kontinuálním režimu.

Výhody ultrazvukové výroby lipozomů

Ultrazvukové zapouzdření lipozomů je technika používaná k zapouzdření léků nebo jiných terapeutických činidel v lipozomech pomocí ultrazvukové energie. Ve srovnání s jinými metodami zapouzdření lipozomů má ultrazvukové zapouzdření několik výhod, které z něj činí vynikající výrobní techniku.

• Vysoké zatížení, vysoká účinnost zachycování: Je dobře známo, že ultrazvuková produkce lipozomů produkuje lipozomy s vysokým zatížením účinných látek, např. vitaminu C, molekul léčiv atd. Současně metoda sonikace vykazuje vysokou účinnost zachycování. To znamená, že vysoké procento účinné látky je zapouzdřeno ultrazvukem. Závěrem lze říci, že díky tomu je ultrazvuku vysoce účinnou metodou pro produkci lipozomů.
• Rovnoměrně malé liposomy: Jednou z výhod ultrazvukového zapouzdření lipozomů je jeho schopnost produkovat vysoce uniformní lipozomy s úzkou distribucí velikosti. Ultrazvuková energie může být použita k rozbití větších lipozomů nebo lipidových agregátů na menší, rovnoměrnější lipozomy. To vede k větší konzistenci ve velikosti a tvaru lipozomů, což může být důležité pro aplikace dodávání léčiv, kde velikost částic může ovlivnit jejich farmakokinetiku a účinnost.
• Použitelné pro všechny molekuly: Další výhodou ultrazvukového zapouzdření lipozomů je jeho schopnost zapouzdřit širokou škálu léků a dalších terapeutických činidel. Tuto techniku lze použít k zapouzdření jak hydrofilních, tak hydrofobních léků, což může být obtížné s jinými metodami. Kromě toho může být ultrazvuková energie použita k zapouzdření makromolekul a nanočástic, které mohou být příliš velké na to, aby se zapouzdřily jinými metodami.
• Rychlé a spolehlivé: Ultrazvukové zapouzdření lipozomu je také poměrně jednoduchý a rychlý proces. Nevyžaduje použití agresivních chemikálií nebo vysokých teplot, které mohou být škodlivé pro terapeutické látky, které jsou zapouzdřeny.
• Rozšíření kapacity: Kromě toho lze tuto techniku snadno rozšířit pro výrobu ve velkém měřítku, což z ní činí nákladově efektivní možnost pro aplikace dodávání léků.

Stručně řečeno, ultrazvukové zapouzdření lipozomu je vynikající technikou pro zapouzdření lipozomů díky své schopnosti produkovat jednotné lipozomy s úzkou distribucí velikosti, zapouzdřit širokou škálu terapeutických činidel a své jednoduchosti a škálovatelnosti.

Ultrazvukový lipozomální přípravek pro léčiva a kosmetiku

Liposomy (vezikuly na bázi lipidů), transferozomy (ultradeformovatelné liposomy), ethozomy (ultradeformovatelné vezikuly s vysokým obsahem alkoholu) a niozomy (syntetické vezikuly) jsou mikroskopické vezikuly, které lze uměle připravit jako globulární nosiče, do kterých mohou být zapouzdřeny aktivní molekuly. Tyto vezikuly o průměru mezi 25 a 5000 nm se často používají jako nosiče léčiv ve farmaceutickém a kosmetickém průmyslu, jako je orální nebo topické podávání léků, genová terapie a imunizace. Ultrazvuku je vědecky ověřená metoda pro vysoce efektivní produkci lipozomů. Hielscher ultrasonicators produkují liposomy s vysokým zatížením účinných látek a vynikající biologickou dostupností.

Liposomy a liposomální formulace

Liposomy jsou unilamelární, oligolamelární nebo multilamelární vezikulární systémy a jsou složeny ze stejného materiálu jako buněčná membrána (lipidová dvojvrstva). Pokud jde o jejich složení a velikost, liposomy se rozlišují následovně:

• multilamelární vezikuly (MLV, 0,1-10μm)
• malé jednolamelární váčky (SUV, <100 nm)
• velké unilamelární vezikuly (LUV, 100–500 nm)
• obří jednolamelární vezikuly (GUV, ≥1 μm)

 

Hlavní strukturu lipozomů tvoří fosfolipidy. Fosfolipidy mají hydrofilní hlavovou skupinu a hydrofobní ocasní skupinu, která se skládá z dlouhého uhlovodíkového řetězce.
Lipozomální membrána má velmi podobné složení jako kožní bariéra, takže je lze snadno integrovat do lidské kůže. Jakmile se liposomy spojí s kůží, mohou zachycené látky vyložit přímo na místo určení, kde mohou aktivní látky plnit své funkce. Liposomy tak zvyšují pronikavost/propustnost kůže pro zachycené farmaceutické a kosmetické látky. Také liposomy bez zapouzdřených látek, prázdné vezikuly, jsou pro kůži silnými aktivními látkami, protože fosfatidylcholin obsahuje dvě základní látky, které si lidský organismus nedokáže vyrobit sám: kyselinu linolovou a cholin.
Liposomy se používají jako biokompatibilní nosiče léčiv, peptidů, proteinů, plazmatické DNA, antisense oligonukleotidů nebo ribozymů pro farmaceutické, kosmetické a biochemické účely. Enormní univerzálnost ve velikosti částic a fyzikálních parametrech lipidů poskytuje atraktivní potenciál pro konstrukci vozidel na míru pro širokou škálu aplikací. (Ulrich 2002)

Tvorba ultrazvukových lipozomů

Liposomy lze vytvořit pomocí ultrazvuku. Základním materiálem pro přípravu liposomů jsou amfilické molekuly odvozené nebo založené na biologických membránových lipidech. Pro tvorbu malých unilamelárních váčků (SUV) je lipidová disperze jemně sonikována – např. s ručním ultrazvukovým přístrojem UP50H (50W, 30kHz), VialTweeterem nebo ultrazvukovým reaktorem CupHorn – v ledové lázni. Doba trvání takového ultrazvukového ošetření trvá přibližně 5 – 15 minut. Další metodou výroby malých unilamelárních váčků je sonikace lipozomů multilamelárních váčků.
Dinu-Pirvu et al. (2010) uvádí získání transferozomů sonikací MLV při pokojové teplotě.
Hielscher Ultrasonics nabízí různá ultrazvuková zařízení, sonotrody a příslušenství a může tak poskytnout nejvhodnější ultrazvukové nastavení pro vysoce účinné zapouzdření lipozomů v jakémkoli měřítku.

Ultrazvukové zapouzdření účinných látek do lipozomů

Liposomy fungují jako nosiče účinných látek, jako jsou vitamíny, terapeutické molekuly, peptidy atd. Ultrazvuk je účinným nástrojem pro přípravu a tvorbu lipozomů pro zachycení účinných látek. Současně sonikace napomáhá procesu zapouzdření a zachycování, takže jsou produkovány liposomy s vysokým zatížením účinných látek. Před zapouzdřením mají liposomy tendenci tvořit shluky v důsledku interakce povrchového náboje a náboje fosfolipidových polárních hlav (srov. Míčková et al. 2008), dále musí být otevřeny. Jako příklad Zhu et al. (2003) popisují zapouzdření biotinového prášku v lipozomech ultrazvukem. Vzhledem k tomu, že biotinový prášek byl přidán do roztoku suspenze vezikuly, roztok byl sonikován. Po této úpravě byl biotin zachycen v lipozomech.

Lipozomální emulze s ultrazvukem

Pro zvýšení vyživujícího účinku hydratačních krémů nebo krémů proti stárnutí, pleťových vod, gelů a dalších kosmeceutických přípravků se do lipozomálních disperzí přidává emulgátor, který stabilizuje vyšší množství lipidů. Výzkumy však ukázaly, že schopnost lipozomů je obecně omezená. S přidáním emulgátorů se tento účinek objeví dříve a další emulgátory způsobí oslabení bariérové afinity fosfatidylcholinu. Nanočástice – Skládá se z fosfatidylcholinu a lipidů – jsou odpovědí na tento problém. Tyto nanočástice jsou tvořeny kapičkou oleje, která je pokryta monovrstvou fosfatidylcholinu. Použití nanočástic umožňuje formulace, které jsou schopny absorbovat více lipidů a zůstat stabilní, takže nejsou potřeba další emulgátory.
Ultrazvuku je osvědčená metoda pro výrobu nanoemulzí a nanodisperzí. Vysoce intenzivní ultrazvuk dodává energii potřebnou k dispergaci kapalné fáze (dispergovaná fáze) v malých kapičkách ve druhé fázi (kontinuální fáze). V disperzní zóně způsobují implodující kavitační bubliny intenzivní rázové vlny v okolní kapalině a vedou k tvorbě kapalných paprsků s vysokou rychlostí kapaliny. Za účelem stabilizace nově vzniklých kapiček disperzní fáze proti koalescenci se do emulze přidávají emulgátory (povrchově aktivní látky, povrchově aktivní látky) a stabilizátory. Vzhledem k tomu, že koalescence kapiček po narušení ovlivňuje konečnou distribuci velikosti kapek, používají se účinně stabilizující emulgátory k udržení konečné distribuce velikosti kapek na úrovni, která se rovná distribuci bezprostředně po narušení kapek v ultrazvukové dispergační zóně.

Lipozomální disperze pomocí ultrazvuku

Lipozomální disperze, které jsou založeny na nenasyceném fosfatidylchloru, postrádají stabilitu proti oxidaci. Stabilizace disperze lze dosáhnout antioxidanty, například komplexem vitamínů C a E.
 

 
Ortan et al. (2002) dosáhli ve své studii týkající se ultrazvukové přípravy éterického oleje Anethum graveolens v lipozomech dobré výsledky. Po sonikaci byl rozměr lipozomů mezi 70-150 nm a pro MLV mezi 230-475 nm; tyto hodnoty byly přibližně konstantní i po 2 měsících, ale po 12 měsících ustaly, zejména v rozptylu SUV (viz histogramy níže). Měření stability, pokud jde o ztrátu esenciálních olejů a distribuci velikosti, také ukázalo, že lipozomální disperze udržovaly obsah těkavého oleje. To naznačuje, že zachycení esenciálního oleje v lipozomech zvýšilo stabilitu oleje.

Hielscher ultrazvukové procesory jsou ideální zařízení pro aplikace v kosmetickém a farmaceutickém průmyslu. Systémy skládající se z několika ultrazvukových procesorů, z nichž každý má výkon až 16 000 wattů, poskytují kapacitu potřebnou k převedení této laboratorní aplikace do efektivní výrobní metody pro získání jemně dispergovaných emulzí v kontinuálním toku nebo v dávce – dosažení výsledků srovnatelných s dnešními nejlepšími dostupnými vysokotlakými homogenizátory, jako jsou clonové ventily. Kromě této vysoké účinnosti při kontinuální emulgaci vyžadují ultrazvuková zařízení Hielscher velmi nízkou údržbu a jsou velmi snadno ovladatelná a čistitelná. Ultrazvuk ve skutečnosti podporuje čištění a oplachování. Ultrazvukový výkon je nastavitelný a lze jej přizpůsobit konkrétním produktům a požadavkům na emulgaci. K dispozici jsou také speciální reaktory s průtočnou buňkou, které splňují pokročilé požadavky CIP (clean-in-place) a SIP (sterilize-in-place).

---

---

Často kladené otázky o lipozomech

Jaké typy liposomů se rozlišují?

Liposomy se dělí na různé typy na základě jejich velikosti a počtu dvojvrstev, které obsahují. Mezi tyto kategorie patří:

• Malé jednolamelární vezikuly (SUV): Jedná se o nejmenší liposomy s jednou lipidovou dvojvrstvou.
• Velké jednolamelární vezikuly (LUV): Jsou větší než SUV a mají také jednu dvojvrstvu.
• Multilamelární vezikuly (MLV): Ty obsahují více soustředných dvojvrstev.
• Multivezikulární vezikuly (MVV): Ty se skládají z více menších váčků ve větším váčku.

 
Mezi další specializované typy patří:

• PEGylované liposomy: Liposomy modifikované polyethylenglykolem (PEG) pro zvýšení stability a doby cirkulace.
• Nanoliposomy: Velmi malé liposomy, obvykle používané pro cílené dodávání léčiv.

 

Jaké vezikulové struktury mohou liposomy vykazovat?

Liposomy jsou dále kategorizovány na základě jejich struktury vezikul do sedmi hlavních typů:

• Multilamelární velké vezikuly (MLV): Obsahují více dvojvrstev.
• Oligolamelární vezikuly (OLV): Mít několik dvojvrstev.
• Malé jednolamelární vezikuly (SUV): Nejmenší s jednou dvojvrstvou.
• Středně velké jednolamelární vezikuly (MUV): Střední velikost s jednou dvojvrstvou.
• Velké jednolamelární vezikuly (LUV): Větší s jednou dvojvrstvou.
• Obří jednolamelární vezikuly (GUV): Velmi velké s jednou dvojvrstvou.
• Multivezikulární vezikuly (MVV): Více vezikul v jedné velké vezikule.

Jaké jsou rozdíly mezi lipozomy a niozomy?

Liposomy a niozomy se liší především svým složením:
Liposomy: Vyrobeno z fosfolipidů s dvojitým řetězcem, které mohou být neutrální nebo nabité.
Niozomy: Vyrobeno z nenabitých jednořetězcových povrchově aktivních látek a cholesterolu.
Obě struktury jsou tvořeny sonikací, která podporuje sestavení dvouvrstvých váčků.

Jaká je ideální velikost lipozomu?

Pro terapeutické podání je ideální velikost lipozomu teoreticky mezi 50 a 200 nanometry v průměru. Tento rozsah velikostí optimalizuje stabilitu a biologickou dostupnost. Sonikace se běžně používá ke snížení vezikuly na požadovanou velikost.

Mohou liposomy nést hydrofilní léky?

Ano, liposomy mohou přenášet hydrofilní léčiva. V biomedicínských aplikacích jsou ceněny pro svou schopnost zapouzdřit jak hydrofobní, tak hydrofilní činidla. Navíc nabízejí vysokou biokompatibilitu a biologickou rozložitelnost, což z nich činí efektivní doručovací systémy.

Jak vyrobit liposomy?

Nejběžnějšími technikami přípravy lipozomů jsou metoda tenké vrstvy a metoda odpařování reverzní fáze.
Metoda hydratace tenkého filmu:

1. Lipidy se rozpustí v organickém rozpouštědle.
2. Rozpouštědlo se odpaří a vytvoří se tenký lipidový film.
3. Hydratujte film vodným roztokem pomocí sonikace, aby se vytvořily multilamelární vezikuly.

Metoda odpařování reverzní fáze:

1. Rozpusťte lipidy ve vodě a ethanolu.
2. Sonikujte roztok při 60 ° C po dobu asi 10 minut, abyste vytvořili lipidovou pastu.
3. Lipidovou kaši ochlaďte a za stálého míchání po kapkách přidávejte vodu nebo pufr.
4. Suspenze hydratujte po dobu 1 hodiny, aby se vytvořily multilamelární váčky.
5. Snižte velikost lipozomu prostřednictvím další sonikace.

Co jsou archeozomy?

Archeozomy jsou lipozomy vyrobené z archeálních lipidů, které jsou známé svou stabilitou a odolností vůči extrémním podmínkám. Díky těmto vlastnostem jsou archeozomy zvláště užitečné pro dodávání léků a vývoj vakcín v náročných prostředích.

Jak se archeozomy připravují?

Postup sonikace podle Pise (2022): Archeozomy mohou být vyrobeny z polární lipidové frakce “PLF (Plž)” Sulfolobussolfataricus sonikací při 60 ° C bez nutnosti externího doplňování lipidů. Při 0 °C byly polární lipidy ze Sulfolobusacidocaldarius účinně sonikovány za vzniku archeozomů. BMD-naložené archeozomy a konvenční liposomy, stejně jako archaální lipidy izolované z Archaea H. salinarum a obohacené o fosfatidylcholin, byly vyrobeny pomocí sonikačních technik. Sonikované vezikuly byly vytvořeny pro lokální dodání sonikací disperzí MLV při 80% amplitudě po dobu 4 minut pomocí sondy Hielscher UP50H sonikátoru (viz obrázek vlevo).

Literatura/Odkazy

• Raquel Martínez-González, Joan Estelrich, Maria Antònia Busquets (2016): Liposomes Loaded with Hydrophobic Iron Oxide Nanoparticles: Suitable T2 Contrast Agents for MRI. International Journal of Molecular Science 2016.
• Zahra Hadian, Mohammad Ali Sahari, Hamid Reza Moghimi; Mohsen Barzegar (2014): Formulation, Characterization and Optimization of Liposomes Containing Eicosapentaenoic and Docosahexaenoic Acids; A Methodology Approach. Iranian Journal of Pharmaceutical Research (2014), 13 (2): 393-404.
• Joanna Kopecka, Giuseppina Salzano, Ivana Campia, Sara Lusa, Dario Ghigo, Giuseppe De Rosa, Chiara Riganti (2014): Insights in the chemical components of liposomes responsible for P-glycoprotein inhibition. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine 2013.
• Pise, Ganesh (2022): Archaeosomes for both cell-based delivery applications and drug-based delivery applications. Journal of Medical Pharmaceutical and Allied Sciences 11, 2022. 4995-5003.