Ultrazvuková příprava liposomů

Liposomy vyrobené ultrazvukem vykazují velmi vysokou účinnost zachycení, vysokou kapacitu plnění a rovnoměrně malou sférickou velikost. Ultrazvukové liposomy tak nabízejí vynikající biologickou dostupnost. Hielscher Ultrasonics nabízí ultrazvukové přístroje pro spolehlivou výrobu liposomů ve farmaceutické kvalitě ve vsádkovém i kontinuálním režimu.

Výhody ultrazvukové výroby liposomů

Ultrazvuková enkapsulace do liposomů je technika, při níž se léčiva nebo jiné terapeutické látky enkapsulují do liposomů pomocí ultrazvukové energie. Ve srovnání s jinými metodami enkapsulace do liposomů má ultrazvuková enkapsulace několik výhod, které z ní činí nadřazenou výrobní techniku.

• Vysoké plnění, vysoká účinnost zachycení: Ultrazvuková výroba liposomů je dobře známa tím, že poskytuje liposomy s vysokým obsahem účinných látek, např. vitaminu C, molekul léčiv atd. Metoda sonikace zároveň vykazuje vysokou účinnost zachycení. To znamená, že se sonikací enkapsuluje vysoké procento účinné látky. Celkově tak sonikace představuje vysoce účinnou metodu výroby liposomů.
• Rovnoměrně malé liposomy: Jednou z výhod ultrazvukové enkapsulace do liposomů je schopnost vytvářet vysoce uniformní liposomy s úzkou distribucí velikosti. Ultrazvukovou energii lze využít k rozbití větších liposomů nebo lipidových agregátů na menší, uniformnější liposomy. To vede k větší konzistenci velikosti a tvaru liposomů, což může být důležité pro aplikace v oblasti podávání léčiv, kde velikost částic může ovlivnit jejich farmakokinetiku a účinnost.
• Použitelné pro jakékoli molekuly: Další výhodou ultrazvukové enkapsulace do liposomů je schopnost enkapsulovat širokou škálu léčiv a dalších terapeutických látek. Techniku lze použít k enkapsulaci hydrofilních i hydrofobních léčiv, což může být jinými metodami obtížné. Ultrazvukovou energii lze navíc využít k enkapsulaci makromolekul a nanočástic, které mohou být pro enkapsulaci jinými metodami příliš velké.
• Rychlé a spolehlivé: Ultrazvuková enkapsulace do liposomů je rovněž poměrně jednoduchý a rychlý proces. Nevyžaduje použití agresivních chemikálií ani vysokých teplot, které mohou enkapsulovaným terapeutickým látkám škodit.
• Zvětšení měřítka: Techniku lze navíc snadno převést do velkovýroby, což z ní činí nákladově efektivní volbu pro aplikace v oblasti podávání léčiv.

Souhrnně lze říci, že ultrazvuková enkapsulace do liposomů je nadřazenou technikou enkapsulace do liposomů díky své schopnosti vytvářet uniformní liposomy s úzkou distribucí velikosti a enkapsulovat širokou škálu terapeutických látek a také díky své jednoduchosti a škálovatelnosti.

Po vytvoření lipidového filmu a jeho následné rehydrataci se sonikace používá k podpoře zachycení účinných látek v liposomu. Sonikací se navíc dosáhne požadované velikosti liposomů.

Ultrazvuková příprava liposomů pro farmaceutika a kosmetiku

Liposomy (vezikuly na bázi lipidů), transferosomy (ultradeformovatelné liposomy), ethosomy (ultradeformovatelné vezikuly s vysokým obsahem alkoholu) a niosomy (syntetické vezikuly) jsou mikroskopické vezikuly, které lze uměle připravit jako kulovité nosiče, do nichž lze enkapsulovat účinné molekuly. Tyto vezikuly o průměru 25 až 5000 nm se často používají jako nosiče léčiv ve farmaceutickém a kosmetickém průmyslu, např. při perorálním nebo topickém podávání léčiv, genové terapii a imunizaci. Sonikace je vědecky ověřená metoda vysoce účinné výroby liposomů. Ultrazvukové přístroje Hielscher vyrábějí liposomy s vysokým obsahem účinných látek a vynikající biologickou dostupností.

Liposomy a liposomální formulace

Liposomy jsou unilamelární, oligolamelární nebo multilamelární vezikulární systémy a jsou tvořeny stejným materiálem jako buněčná membrána (lipidová dvojvrstva). Podle složení a velikosti se liposomy rozlišují takto:

• multilamelární vezikuly (MLV, 0,1–10μm)
• malé unilamelární vezikuly (SUV, <100 nm)
• velké unilamelární vezikuly (LUV, 100–500 nm)
• obří unilamelární vezikuly (GUV, ≥1 μm)

Základní strukturu liposomů tvoří fosfolipidy. Fosfolipidy mají hydrofilní hlavovou skupinu a hydrofobní koncovou skupinu, která je tvořena dlouhým uhlovodíkovým řetězcem.
Membrána liposomů má velmi podobné složení jako kožní bariéra, takže se liposomy mohou snadno začlenit do lidské kůže. Když liposomy splývají s kůží, mohou zachycené látky uvolnit přímo v cílovém místě, kde mohou účinné látky plnit své funkce. Liposomy tak zvyšují penetrabilitu/ permeabilitu kůže pro zachycené farmaceutické a kosmetické látky. Také liposomy bez enkapsulovaných látek, tedy prázdné vezikuly, jsou pro kůži účinnými aktivními látkami, neboť fosfatidylcholin obsahuje dvě esenciální složky, které si lidský organismus nedokáže sám vytvořit: kyselinu linolovou a cholin.
Liposomy se používají jako biokompatibilní nosiče léčiv, peptidů, proteinů, „plasmic DNA“, antisense oligonukleotidů nebo ribozymů pro farmaceutické, kosmetické a biochemické účely. Obrovská variabilita velikosti částic a fyzikálních parametrů lipidů nabízí atraktivní potenciál pro konstrukci nosičů na míru pro širokou škálu aplikací. (Ulrich 2002)

Tvorba liposomů pomocí ultrazvuku

Liposomy lze vytvářet pomocí ultrazvuku. Výchozím materiálem pro přípravu liposomů jsou amfifilní molekuly odvozené z lipidů biologických membrán nebo na nich založené. K vytvoření malých unilamelárních vezikul (SUV) se lipidová disperze šetrně sonikuje – např. ručním ultrazvukovým přístrojem UP50H (50W, 30kHz), přístrojem VialTweeter nebo ultrazvukovým reaktorem CupHorn – v ledové lázni. Takové ultrazvukové ošetření trvá přibl. 5 – 15 minut. Další metodou výroby malých unilamelárních vezikul je sonikace multilamelárních vezikulárních liposomů.
Dinu-Pirvu et al. (2010) popisují získání transferosomů sonikací MLV při pokojové teplotě.
Hielscher Ultrasonics nabízí různé ultrazvukové přístroje, sonotrody a příslušenství, a může tak poskytnout nejvhodnější ultrazvukovou sestavu pro vysoce účinnou enkapsulaci do liposomů v jakémkoli měřítku.

Ultrazvuková enkapsulace účinných látek do liposomů

Liposomy fungují jako nosiče účinných látek, jako jsou vitaminy, terapeutické molekuly, peptidy atd. Ultrazvuk je účinným nástrojem pro přípravu a tvorbu liposomů k zachycení účinných látek. Sonikace zároveň napomáhá procesu enkapsulace a zachycení, takže vznikají liposomy s vysokým obsahem účinných látek. Před enkapsulací mají liposomy sklon tvořit shluky v důsledku povrchové interakce nábojů polárních hlav fosfolipidů (srov. Míckova et al. 2008), a navíc je nutné je otevřít. Například Zhu et al. (2003) popisují enkapsulaci biotinového prášku do liposomů pomocí sonikace. Po přidání biotinového prášku do roztoku suspenze vezikul byl roztok sonikován. Po tomto ošetření byl biotin zachycen v liposomech.
Přečtěte si více o ultrazvukové enkapsulaci peptidů GLP-1 (např. semaglutidu) do liposomů!

Liposomální emulze pomocí sonikace

Pro zesílení vyživujícího účinku hydratačních krémů nebo krémů proti stárnutí, pleťových mlék, gelů a dalších kosmeceutických formulací se do liposomálních disperzí přidávají emulgátory, které stabilizují vyšší množství lipidů. Výzkumy však ukázaly, že kapacita liposomů je obecně omezená. Při přidání emulgátorů se tento efekt projeví dříve a přídavné emulgátory oslabují bariérovou afinitu fosfatidylcholinu. Nanočástice – složené z fosfatidylcholinu a lipidů – jsou odpovědí na tento problém. Tyto nanočástice tvoří olejová kapička pokrytá monovrstvou fosfatidylcholinu. Použití nanočástic umožňuje formulace, které dokážou absorbovat více lipidů a zůstat stabilní, takže přídavné emulgátory nejsou zapotřebí.
Sonikace je osvědčenou metodou výroby nanoemulzí a nanodisperzí. Vysoce intenzivní ultrazvuk dodává výkon potřebný k dispergaci kapalné fáze (dispergované fáze) ve formě malých kapiček ve druhé fázi (kontinuální fázi). V disperzní zóně způsobují implodující kavitační bubliny intenzivní rázové vlny v okolní kapalině a vedou ke vzniku kapalinových proudů s vysokou rychlostí kapaliny. Aby se nově vzniklé kapičky dispergované fáze stabilizovaly proti koalescenci, přidávají se do emulze emulgátory (povrchově aktivní látky, tenzidy) a stabilizátory. Protože koalescence kapiček po jejich rozbití ovlivňuje výslednou distribuci velikosti kapiček, používají se účinně stabilizující emulgátory, které udržují výslednou distribuci velikosti kapiček na úrovni odpovídající distribuci bezprostředně po rozbití kapiček v ultrazvukové disperzní zóně.

Liposomální disperze pomocí sonikace

Liposomální disperze na bázi nenasyceného „phosphatidylchlorine“ postrádají stabilitu vůči oxidaci. Stabilizace disperze lze dosáhnout antioxidanty, například komplexem vitaminů C a E.

Tvorba liposomů metodou reverzní fázové evaporace pomocí sonikace

Ortan et al. (2002) dosáhli ve své studii zabývající se ultrazvukovou přípravou esenciálního oleje Anethum graveolens v liposomech dobrých výsledků. Po sonikaci se velikost liposomů pohybovala v rozmezí 70–150 nm a u MLV v rozmezí 230–475 nm; tyto hodnoty zůstaly přibližně konstantní i po 2 měsících, avšak po 12 měsících se zvýšily, zejména u disperze SUV (viz histogramy níže). Měření stability týkající se ztráty esenciálního oleje a distribuce velikosti rovněž ukázalo, že liposomální disperze si zachovaly obsah těkavého oleje. To naznačuje, že zachycení esenciálního oleje v liposomech zvýšilo stabilitu oleje.

Ortan et al. (2009): Stabilita disperzí MLV a SUV po 1 roce. Liposomální formulace byly skladovány při 4±1 ºC.

Ultrazvukové procesory Hielscher jsou ideálními přístroji pro aplikace v kosmetickém a farmaceutickém průmyslu. Systémy složené z několika ultrazvukových procesorů o výkonu až 16 000 wattů každý poskytují kapacitu potřebnou k převedení této laboratorní aplikace na efektivní výrobní metodu pro získání jemně dispergovaných emulzí v kontinuálním průtoku nebo ve vsádce – s výsledky srovnatelnými s dnešními nejlepšími dostupnými vysokotlakými homogenizátory, jako jsou clonové ventily. Kromě této vysoké účinnosti při kontinuální emulgaci vyžadují ultrazvukové přístroje Hielscher velmi nízkou údržbu a velmi snadno se obsluhují i čistí. Ultrazvuk čištění a oplachování dokonce podporuje. Ultrazvukový výkon je nastavitelný a lze jej přizpůsobit konkrétním produktům a požadavkům na emulgaci. K dispozici jsou také speciální reaktory s průtokovou celou splňující pokročilé požadavky CIP (clean-in-place) a SIP (sterilize-in-place).

Často kladené otázky o liposomech

Jaké typy liposomů se rozlišují?

Liposomy se dělí do různých typů podle své velikosti a počtu dvojvrstev, které obsahují. Mezi tyto kategorie patří:

• Malé unilamelární vezikuly (SUV): Jedná se o nejmenší liposomy s jedinou lipidovou dvojvrstvou.
• Velké unilamelární vezikuly (LUV): Jsou větší než SUV a mají rovněž jedinou dvojvrstvu.
• Multilamelární vezikuly (MLV): Obsahují více soustředných dvojvrstev.
• Multivezikulární vezikuly (MVV): Skládají se z více menších vezikul uvnitř větší vezikuly.

Mezi další specializované typy patří:

• PEGylované liposomy: Liposomy modifikované polyethylenglykolem (PEG) za účelem zvýšení stability a doby cirkulace.
• Nanoliposomy: Velmi malé liposomy, obvykle používané pro cílené podávání léčiv.

Jaké vezikulární struktury mohou liposomy vykazovat?

Liposomy se dále podle své vezikulární struktury dělí do sedmi hlavních typů:

• Multilamelární velké vezikuly (MLV): Obsahují více dvojvrstev.
• Oligolamelární vezikuly (OLV): Mají několik dvojvrstev.
• Malé unilamelární vezikuly (SUV): Nejmenší, s jedinou dvojvrstvou.
• Středně velké unilamelární vezikuly (MUV): Střední velikost s jedinou dvojvrstvou.
• Velké unilamelární vezikuly (LUV): Větší, s jedinou dvojvrstvou.
• Obří unilamelární vezikuly (GUV): Velmi velké, s jedinou dvojvrstvou.
• Multivezikulární vezikuly (MVV): Více vezikul uvnitř jedné velké vezikuly.

Jaké jsou rozdíly mezi liposomy a niosomy?

Liposomy a niosomy se liší především svým složením:
Liposomy: Vyrábějí se z dvouřetězcových fosfolipidů, které mohou být neutrální nebo nabité.
Niosomy: Vyrábějí se z nenabitých jednořetězcových tenzidů a cholesterolu.
Obě struktury vznikají sonikací, která podporuje sestavování vezikul s dvojvrstvou.

Jaká je ideální velikost liposomu?

Pro terapeutické podávání se ideální velikost liposomu teoreticky pohybuje v rozmezí 50 až 200 nanometrů v průměru. Toto rozmezí velikostí optimalizuje stabilitu a biologickou dostupnost. Ke zmenšení vezikul na požadovanou velikost se běžně používá sonikace.

Mohou liposomy přenášet hydrofilní léčiva?

Ano, liposomy mohou přenášet hydrofilní léčiva. V biomedicínských aplikacích jsou ceněny pro svou schopnost enkapsulovat hydrofobní i hydrofilní látky. Kromě toho nabízejí vysokou biokompatibilitu a biologickou odbouratelnost, díky čemuž jsou účinnými systémy pro podávání.

Jak připravit liposomy?

Nejběžnějšími technikami přípravy liposomů jsou metoda tenkého filmu a metoda reverzní fázové evaporace.
Metoda hydratace tenkého filmu:

1. Rozpusťte lipidy v organickém rozpouštědle.
2. Odpařte rozpouštědlo, aby vznikl tenký lipidový film.
3. Hydratujte film vodným roztokem za použití sonikace, aby vznikly multilamelární vezikuly.

Metoda reverzní fázové evaporace:

1. Rozpusťte lipidy ve vodě a ethanolu.
2. Sonikujte roztok při 60°C po dobu přibližně 10 minut, aby vznikla lipidová pasta.
3. Lipidovou kaši ochlaďte a za míchání po kapkách přidávejte vodu nebo pufr.
4. Suspenzi hydratujte po dobu 1 hodiny, aby vznikly multilamelární vezikuly.
5. Velikost liposomů zmenšete další sonikací.

Co jsou archeosomy?

Archeosomy jsou liposomy vyrobené z lipidů archeí, které jsou známé svou stabilitou a odolností vůči extrémním podmínkám. Díky těmto vlastnostem jsou archeosomy obzvláště užitečné pro podávání léčiv a vývoj vakcín v náročných prostředích.

Jak se archeosomy připravují?

Postup sonikace podle Pise (2022): Archeosomy mohou být vyrobeny z polární lipidové frakce „PLF“ Sulfolobussolfataricus sonikací při 60°C bez nutnosti externího doplňování lipidů. Při 0°C byly polární lipidy ze Sulfolobusacidocaldarius účinně sonikovány za vzniku archeosomů. Archeosomy a konvenční liposomy s obsahem BMD, stejně jako lipidy archeí izolované z Archaea H. salinarum a obohacené fosfatidylcholinem, byly vyrobeny pomocí sonikačních technik. Sonikované vezikuly pro topické podávání byly vytvořeny sonikací disperzí MLV při amplitudě 80 procent po dobu 4 minut pomocí sondového sonikátoru Hielscher UP50H (viz obrázek vlevo).

Literatura/reference

• Raquel Martínez-González, Joan Estelrich, Maria Antònia Busquets (2016): Liposomes Loaded with Hydrophobic Iron Oxide Nanoparticles: Suitable T2 Contrast Agents for MRI. International Journal of Molecular Science 2016.
• Zahra Hadian, Mohammad Ali Sahari, Hamid Reza Moghimi; Mohsen Barzegar (2014): Formulation, Characterization and Optimization of Liposomes Containing Eicosapentaenoic and Docosahexaenoic Acids; A Methodology Approach. Iranian Journal of Pharmaceutical Research (2014), 13 (2): 393-404.
• Joanna Kopecka, Giuseppina Salzano, Ivana Campia, Sara Lusa, Dario Ghigo, Giuseppe De Rosa, Chiara Riganti (2014): Insights in the chemical components of liposomes responsible for P-glycoprotein inhibition. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine 2013.
• Pise, Ganesh (2022): Archaeosomes for both cell-based delivery applications and drug-based delivery applications. Journal of Medical Pharmaceutical and Allied Sciences 11, 2022. 4995-5003.