Ultrazvuková formulace niozomů

Niozomy jsou vezikuly nanometrové velikosti, které lze využít jako nosiče léčiv (např. protinádorových léčiv) a dalších bioaktivních látek. Ultrazvuková emulgace je jednoduchá a rychlá metoda formulace malých niozomů s vysokým obsahem léčiva.

Niozomové vezikuly jako nanonosiče účinných látek

Niozom je vezikula na bázi neionogenních povrchově aktivních látek, tvořená většinou neionogenní povrchově aktivní látkou a cholesterolem začleněným jako pomocná látka. Niozomy jsou ve srovnání s liposomy stabilnější vůči chemické degradaci či oxidaci a mají dlouhou dobu skladovatelnosti. Díky povrchově aktivním látkám použitým k přípravě niozomů jsou biologicky odbouratelné, biokompatibilní a neimunogenní. Niozomy jsou osmoticky aktivní, chemicky stabilní a ve srovnání s liposomy nabízejí delší dobu skladovatelnosti. V závislosti na velikosti a lamelaritě jsou k dispozici různé metody přípravy, jako je sonikace, odpařování s reverzní fází, hydratace tenkého filmu nebo proces vychytávání léčiva pomocí transmembránového gradientu pH. Ultrazvuková příprava niozomů je preferovanou technikou pro výrobu unilamelárních vezikul, které jsou malé a mají jednotnou velikost.

Ultrazvuková formulace niozomů

Pro formulaci niozomů je nutné připravit emulzi typu olej ve vodě (o/w) z organického roztoku povrchově aktivní látky a cholesterolu a z vodného roztoku obsahujícího bioaktivní sloučeninu, tj. léčivo. Ultrazvuková emulgace je vynikající technikou pro míchání nemísitelných kapalin, jako je olej a voda. Smykovým působením na kapičky obou fází a jejich rozbitím na nanovelikost se získá nanoemulze. Následně se organické rozpouštědlo odpaří, čímž vzniknou niozomy naplněné terapeutickými látkami, které jsou dispergovány ve vodné fázi. Ve srovnání s mechanickým mícháním vyniká ultrazvuková technika formulace niozomů tím, že v rychlém procesu vytváří niozomy s menším průměrným rozměrem a nižším polydisperzním indexem. Použití menších vezikul je obecně výhodnější, neboť mají tendenci lépe se vyhýbat mechanismům clearance v těle než větší částice a zůstávají v krevním oběhu po delší dobu. (srov. Bragagni et al. 2014)
Přečtěte si více o sonikaci pro zlepšené formulace niozomů!

Protokoly ultrazvukové přípravy niozomů

Formulace niozomů pomocí sonikace byla rozsáhle zkoumána, takže je k dispozici řada vědecky ověřených protokolů pro ultrazvukovou výrobu niozomů.
Níže naleznete stručný přehled několika protokolů formulace pro přípravu a plnění niozomů pomocí sonikace.

Niozomy naplněné extrakty z Withania somnifera
Chinembiri et al. (2017) formulovali surový extrakt z Withania somnifera do niozomů určených k topické aplikaci. Bioaktivní sloučeniny byly enkapsulovány metodou injekce rozpouštědla. Za tímto účelem byly organická a vodná fáze nepřetržitě míchány magnetickým míchadlem a teplota byla udržována na 60°C ± 2°C, dokud se organické rozpouštědlo neodpařilo. Výsledná formulace byla ochlazena a sonikována na ledu pomocí sonikátoru Hielscher UP200ST. Niozomy měly průměrnou velikost v rozmezí přibližně 165,9 ± 9,4 a vykazovaly vysokou účinnost enkapsulace (EE%) withanolidu A.

Niozomy naplněné doxorubicinem
Niozomy s N-palmitoylglukosaminem (Glu) naplněné doxorubicinem, protinádorovým léčivem, byly připraveny protřepáváním směsi NPG (16 mg), Span 60 (65 mg), cholesterolu (58 mg) a Solulan C24 (54 mg) v roztoku doxorubicinu (1,5 mg/ml, 2 ml, připraveném v PBS) při 90°C po dobu 1 h, s následnou sonikací sondou po dobu 10 min (75% maxima).
Vezikuly z palmitoyl glykol chitosanu (GCP) byly připraveny, jak bylo popsáno dříve (11), sonikací glykol chitosanu (10 mg) a cholesterolu (4 mg) sondou v roztoku doxorubicinu (1,5 mg/ml). (Dufes et al. 2004)

Alternativní metody přípravy niozomů

Alternativní metody formulace niozomů, jako je technika odpařování s reverzní fází nebo proces vychytávání léčiva pomocí transmembránového gradientu pH, zahrnují aplikaci ultrazvukové energie. Obě techniky se používají hlavně k formulaci multilamelárních vezikul (MLVs). Níže naleznete stručný popis obou technik a příslušného kroku sonikace.

Sonikace při přípravě niozomů odpařováním s reverzní fází

U metody odpařování s reverzní fází (REV) se složky niozomální formulace rozpustí ve směsi etheru a chloroformu a přidají se do vodné fáze, která obsahuje léčivo. Ultrazvuková emulgace se používá k převedení směsi na jemnou emulzi. Následně se organická fáze odpaří. Niozomy získané během odpařování organického rozpouštědla jsou unilamelární vezikuly velké velikosti.

Proces vychytávání léčiva pomocí transmembránového gradientu pH

Pro proces vychytávání léčiva pomocí transmembránového gradientu pH (uvnitř kyselé prostředí) (se vzdáleným plněním) se povrchově aktivní látka a cholesterol rozpustí v chloroformu. Rozpouštědlo se poté odpaří ve vakuu, čímž se na stěně baňky s kulatým dnem získá tenký film. Film se hydratuje 300 mM kyselinou citronovou (pH 4,0) vortexováním suspenze. Multilamelární vezikuly se třikrát zmrazí a rozmrazí a následně se sonikují pomocí sonikátoru sondového typu. K této niozomální suspenzi se přidá vodný roztok obsahující 10 mg/ml léčiva a směs se vortexuje. pH vzorku se poté zvýší na pH 7,0–7,2 pomocí 1M hydrogenfosforečnanu disodného. Poté se směs zahřívá na 60°C po dobu 10 minut. Tato technika poskytuje multilamelární vezikuly. (srov. Kazi et al. 2010)

Ultrazvuková redukce velikosti niozomů

Niozomy mají obvykle velikost v rozmezí 10nm až 1000nm. V závislosti na technice přípravy mají niozomy často relativně velkou velikost a mají tendenci tvořit agregáty. Konkrétní velikost niozomů je však důležitým faktorem s ohledem na cílový typ systému podávání. Například velmi malá velikost niozomů v nanometrovém rozsahu je nejvhodnější pro systémové podávání léčiv, kdy musí být léčivo dopraveno přes buněčné membrány k cílovému místu v buňce, zatímco větší niozomy se doporučují pro intramuskulární a intrakavitální podávání léčiv nebo pro oftalmologické aplikace. Ultrazvuková redukce velikosti niozomů je běžným krokem při přípravě vysoce účinných niozomů. Ultrazvukové smykové síly deaglomerují a dispergují niozomy na monodisperzní nanoniozomy.

Protokol – ultrazvuková redukce velikosti LipoNiozomů

Naderinezhad et al. (2017) formulovali biokompatibilní LipoNiozomy (kombinaci niozomu a liposomu) obsahující Tween 60: cholesterol: DPPC (v poměru 55 : 30 : 15 : 3) s 3% DSPE-mPEG. Ke zmenšení velikosti připravených LipoNiozomů sonikovali suspenzi po hydrataci po dobu 45 min (15 sekund zapnuto a 10 sekund vypnuto, amplituda 70% při 100 wattech), aby minimalizovali agregaci částic, pomocí ultrazvukového homogenizátoru UP200St (Hielscher Ultrasonics GmbH, Německo). Pro metodu pH gradientu byly vysušené filmy CUR, povrchově aktivních látek a lipidů hydratovány 1300 mL síranu amonného (pH 1⁄4 4) při 63 C po dobu 47 min. Poté byly nanočástice sonikovány nad ledovou lázní za vzniku malých vezikul.

Ultrazvukové přístroje pro přípravu niozomů

Hielscher Ultrasonics má dlouholeté zkušenosti s návrhem, výrobou, distribucí a servisem vysoce výkonných ultrazvukových homogenizátorů pro farmaceutický, potravinářský a kosmetický průmysl.
Příprava vysoce kvalitních niozomů, liposomů, pevných lipidových nanočástic, polymerních nanočástic, cyklodextrinových komplexů a dalších nanostrukturovaných nosičů léčiv patří mezi procesy, v nichž sonikátory Hielscher vynikají díky své vysoké spolehlivosti, konzistentnímu výkonu a přesné řiditelnosti. Ultrazvukové přístroje Hielscher umožňují přesnou kontrolu všech procesních parametrů, jako je amplituda, teplota, tlak a energie sonikace. Inteligentní software automaticky zaznamenává všechny parametry sonikace (čas, datum, amplitudu, čistou energii, celkovou energii, teplotu, tlak) na vestavěnou SD kartu.
Robustnost sonikátorů Hielscher umožňuje provoz 24/7 při vysokém zatížení a v náročných prostředích.
Níže uvedená tabulka uvádí přibližnou zpracovatelskou kapacitu našich ultrazvukových přístrojů: