Genetická transformace v rostlinných buňkách pomocí ultrazvuku

Sonication-Assisted Agrobacterium-Mediated Transformation (SAAT) je účinná metoda infekce rostlinných buněk cizími geny pomocí Agrobacterium jako transportéru. Ultrazvuková kavitace způsobuje sonoporaci, kterou lze popsat jako cílené mikro-zranění rostlinné tkáně. Prostřednictvím těchto ultrazvukem vytváří mikro-rány, DNA a DNA vektory mohou být účinně transportovány do buněčné matrice.

Soporace – Ultrazvukem vylepšená transformace buněk

Ultrasonicator UP100H je laboratorní homogenizátor často používaný pro přípravu vzorků desek buněčných kultur.Když se na buněčné suspenze aplikuje nízkofrekvenční ultrazvuk (cca 20 kHz), účinky akustické kavitace způsobují přechodnou membránovou permeabilizaci na buněčných tkáních. Tento ultrazvukový efekt je známý jako sonoporace a používá se pro přenos genů do buněk nebo tkání.
Výhody ultrazvuku jsou založeny na jeho netepelném mechanickém pracovním principu, díky němuž je sonikace často univerzálnější a méně závislá na typech buněk. Všestranná aplikace sonoporace otevírá možnost využití transgenních rostlin, které mají významný potenciál v biovýrobě komplexních lidských terapeutických proteinů. Takové bioreaktory na rostlinné bázi lze snadno geneticky manipulovat, zabránit potenciální kontaminaci lidskými patogeny, nepoškozují bakterie zprostředkovávající transformaci (např. Agrobacterium) a jsou levnou a účinnou metodou biosyntézy.

Žádost o informace





Ultrasonicator UP200St, 200 wattů výkonný sondový typ ultrasonicator pro genetiku, mikrobiologii a transformaci buněk

Ultrasonicator UP200St (200W, 26kHz) s protihlukovým krytem

Video ukazuje ultrazvukový systém přípravy vzorků UIP400MTP, který umožňuje spolehlivou přípravu vzorků všech standardních vícejamkových desek pomocí ultrazvuku s vysokou intenzitou. Typické aplikace UIP400MTP zahrnují buněčnou lýzu, DNA, RNA a stříhání chromatinu, stejně jako extrakci proteinů.

Ultrasonicator UIP400MTP pro více-well deskové použití ultrazvuku

Miniatura videa

Ultrazvukem asistovaná transformace buněk

Ultrazvukové sondy, jako je UP200St, jsou spolehlivé tkáňové homogenizátory a široce používané pro přípravu vzorků v genetice, např. Pro Sonikace-asistovanou agrobakterií zprostředkovanou transformaci (SAAT).Sonikace je technika, která aplikuje nízkofrekvenční ultrazvukové vlny k míchání částic v roztoku, k míchání roztoků, čímž se zvyšuje rychlost přenosu a rozpouštění hmoty. Současně může sonikace odstranit rozpuštěné plyny z kapalin. Při transformaci rostlin způsobí sonikace tvorbu mikrovin na rostlinné tkáni a zvýší dodávku nahé DNA do rostlinného protoplastu.

Pro genetickou transformaci, Sonication-Assisted Agrobacterium-mediated Transformation (SAAT) je upřednostňovanou metodou a má výrazně vyšší účinnost než sonikace používaná k přenosu nahých DNA a DNA vektorů přímo do protoplastu. Četné studie prokázaly, že sonikace asistovaná Agrobacterium-zprostředkovaná transformace (SAAT) může být použita k vyvolání mechanického narušení a tvorby ran na rostlinných buňkách ultrazvukovými vlnami a výslednou akustickou kavitací. Krátká ultrazvuková léčba vytváří mikro-rány na povrchu explantátů. Protože zraněné buňky umožní pronikání Agrobakterie do hlubší části rostlinných tkání, čímž se zvýší pravděpodobnost infekce rostlinných buněk. Navíc vylučované fenolické sloučeniny zvyšují transformaci. Ultrazvukem generované mikro-rány činí explantační penetraci bakteriemi také proveditelnější. SAAT byl úspěšně použit pro genetickou transformaci u rostlinných druhů, které jsou zvláště považovány za odolné vůči Agrobacterium.
Být velmi jednoduchá a levná metoda, stejně jako významné zvýšení přenosu genů zprostředkovaných Agrobacterium jsou hlavními výhodami SAAT. Kromě úspěšné aplikace SAAT při transformaci Chenopodium rubrum L. a Beta vulgaris L. byl tento přístup aplikován také při výrobě rekombinantních tepelně labilních holotoxinů Escherichia coli divokého typu a adjuvans vakcíny Escherichia coli mutant LT v Nicotiana tabacum, ve kterých byly u ptáků zjištěny nejvyšší systémové titry IgG specifické pro LT-B.
(srov. Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka a R. Baranski, 2014)

VialTweeter může být použit pro infekci DNA plan buněk, např. pomocí sonikace asistované Agrobacterium-zprostředkované transformace (SAAT)

VialTweeter pro současnou sonikaci více zkumavek se vzorkem, např. pro agrobakteriem zprostředkovanou transformaci (SAAT)

Obecný postup přenosu genů prostřednictvím sonoporace v rostlinných buňkách

  1. Příprava genetického materiálu: Začněte přípravou genetického materiálu, který chcete zavést do rostlinných buněk. Může to být plazmidová DNA, RNA nebo jiné nukleové kyseliny.
  2. Izolace rostlinných buněk: Izolujte rostlinné buňky, na které chcete cílit. V závislosti na vašem experimentu mohou být tyto buňky izolovány z rostlinných tkání nebo kultur.
  3. Buněčná suspenze: Suspendujte rostlinné buňky ve vhodném médiu nebo pufru. To je nezbytné k zajištění toho, aby buňky byly zdravé a ve stavu příznivém pro příjem genů.
  4. Nastavení Sonicator: Připravte si sondou-typ sonicator pomocí sonikace přednastavení parametrů, jako je amplituda, čas, energie a teplota. Ponořte ultrazvukovou sondu do buněčné suspenze.
  5. použití ultrazvuku: Spusťte postup sonikace. Rychlé kmitání hrotu sondy vytváří kavitační bubliny v kapalině. Tyto bubliny se rozšiřují a zhroutí v důsledku ultrazvukových vln, vytvářejí mechanické síly a mikrostreaming v suspenzi.
  6. Sonoporace: Mechanické síly a mikrostreaming generované kavitací vytvářejí dočasně póry a otvory v membránách rostlinných buněk. Genetický materiál přítomný v suspenzi může vstoupit do rostlinných buněk těmito póry.
  7. Inkubace: Po léčbě sonoporací inkubujte rostlinné buňky, aby se mohly zotavit a stabilizovat své membrány. Jedná se o zásadní krok k zajištění přežití buněk a úspěšného přenosu genů.

Přenos genů prostřednictvím agrobakterií nebo liposomů

Existují dvě běžné formy transfekce rostlinné buňky. Používají buď agrobakterii, rod gramnegativních bakterií, nebo liposomy jako nosič genetického materiálu.

  • Sonoporace zprostředkovaná agrobakteriemi: Agrobacterium tumefaciens je bakterie běžně používaná v genetickém inženýrství rostlin. Při této metodě se plazmidová DNA obsahující požadovaný gen zavádí do Agrobacterium, která se pak mísí s rostlinnými buňkami. Buněčná suspenze je podrobena sonoporaci pomocí sonometru typu sondy. Ultrazvuková energie zvyšuje přenos genetického materiálu z Agrobacterium do rostlinných buněk. Tato metoda je široce používána pro genetickou modifikaci rostlin.
  • Sonoporace zprostředkovaná liposomem: Liposomy jsou vezikuly na bázi lipidů, které mohou nést genetický materiál. Při této metodě se liposomy nabité plazmidovou DNA nebo jinými nukleovými kyselinami mísí s rostlinnými buňkami. Sonoporace pomocí sonometru typu sondy se používá k usnadnění vychytávání liposomů rostlinnými buňkami. Ultrazvuk narušuje lipidové dvojvrstvy liposomů a uvolňuje genetický materiál do rostlinných buněk. Tento přístup je užitečný pro studie přechodné genové exprese v rostlinných buňkách.

Vědecky prokázané výhody sonikace asistované agrobakterií zprostředkované transformace (SAAT)

Sonication-Assisted Agrobacterium-Mediated Transformation (SAAT) byla aplikována na mnoho druhů rostlin. Krátká a relativně mírná ultrazvuková léčba rostlinných buněčných kultur způsobuje sonoporaci, která následně umožňuje hluboké pronikání Agrobacterium jako genového transportéru. Níže si můžete přečíst příkladné studie prokazující příznivé účinky SAAT.

Sonicator UP200Ht s mikro-hrot pro transfekci rostlinné buňky s geny přes sonoporaci

Sonicator UP200Ht pro genovou transfekci prostřednictvím sonoporace

Žádost o informace





Ultrazvukem asistovaná transformace Ashwagandhy

Za účelem zlepšení účinnosti transformace u W. somnifera (známého jako ashwagandha nebo zimní třešeň), Dehdashti a kolegové (2016) zkoumali použití acetosyringonu (AS) a sonikace.
Acetosyringon (AS) byl přidán ve třech fázích: Agrobacterium kapalná kultura, Infekce Agrobacterium a kokultura explantátů s Agrobacterium. Bylo zjištěno, že přidání 75 μM AS do kapalné kultury Agrobacterium je optimální pro indukci virových genů.
Další aplikace sonikace (SAAT) vedla k nejvyšší genové expresi. Exprese genu gusA v chlupatých kořínkách byla shledána jako nejlepší, když listy a špičky výhonků byly sonikovány po dobu 10 a 20 let. Transformační účinnost vylepšeného protokolu byla zaznamenána 66,5% a 59,5% v případě explantátů listů a výhonků. Ve srovnání s jinými protokoly bylo zjištěno, že transformační účinnost tohoto vylepšeného protokolu je 2,5krát vyšší u listů a 3,7krát vyšší u špiček výhonků. Analýzy jižních skvrn potvrdily 1–2 kopie transgenu gusA v řádcích W1-W4, zatímco v řádku W5 generovaném vylepšeným protokolem byly detekovány 1–4 transgenové kopie.

Doba trvání sonikace (doba vystavení ultrazvuku) ovlivňuje sonikace asistovanou agrobakterií zprostředkovanou transformaci (SAAT) na transformaci ve W. somnifera

Vliv trvání agrobakteriem zprostředkované transformace (SAAT) na frekvenci transformace listů W. somnifera (a) a výhonů (b)
(studie a grafika: © Dehdashti et al., 2016)

Sonikátory jako UP200St se používají k přípravě genetického materiálu, jako je DNA, RNA, miRNA a následné genové transfekce pomocí sonoporace. Sonoporace umožňuje transfekci rostlinných buněk genetickým materiálem pomocí agrobakterie.

UP200St homogenizátor sondového typu pro sonoporaci a genovou transfekci

Ultrazvukem asistovaná transformace bavlny

Hussain et al. (2007) demonstrují příznivé účinky transformace bavlny s pomocí sonikace. Akustická kavitace způsobená nízkofrekvenčním ultrazvukem vytváří mikrorany na a pod povrchem rostlinné tkáně (sonoporace) a umožňuje Agrobacterium cestovat hlouběji a úplně po celé rostlinné tkáni. Tato zraňující móda zvyšuje pravděpodobnost infekce rostlinných buněk ležících hlouběji v tkáni. Za účelem vyhodnocení transformační účinnosti SAAT byla měřena exprese genu GUS. Reportérský systém GUS je genový systém reportéra, zvláště užitečný v molekulární biologii rostlin a mikrobiologii. Úpravou různých parametrů SAAT byla významně zvýšena přechodná exprese GUS v bavlně pomocí zralých embryí jako explantátu. GUS byl poprvé detekován 24 hodin po inkubaci explantátů a o 48 hodin byla exprese GUS velmi intenzivní, což sloužilo jako užitečný indikátor úspěšné transformace bavlněného explantátu po sonikaci asistované Agrobacterium zprostředkované transformace (SAAT). Srovnání různých transformačních technik (jmenovitě biolistické, Agro, BAAT, SAAT), sonikace asistované Agrobacterium-mediated transformace (SAAT) ukázal zdaleka nejlepší výsledky transformace.

Sonikace-asistované Agrobacterium-zprostředkované transformace (SAAT) vykazuje významně vyšší přechodnou expresi ve srovnání s alternativními metodami infekce.

Volba transformačního postupu na základě přechodné exprese GUS. Sonikace asistovaná Agrobacterium-zprostředkovaná transformace (SAAT) vykazuje výrazně vyšší přechodnou expresi.
(studie a grafika: © Hussain et al., 2007)

 

Tento tutoriál vysvětluje, jaký typ sonikátoru je nejlepší pro vaše úkoly přípravy vzorků, jako je lýza, narušení buněk, izolace proteinů, fragmentace DNA a RNA v laboratořích, analýza a výzkum. Vyberte ideální typ sonikátoru pro vaši aplikaci, objem vzorku, počet vzorků a propustnost. Hielscher Ultrasonics má ideální ultrazvukový homogenizátor pro vás!

Jak najít perfektní sonikátor pro narušení buněk a extrakci bílkovin ve vědě a analýze

Miniatura videa

 

Vysoce výkonná ultrazvuková řešení pro sonoporataci a SAAT

Hielscher Ultrasonics má dlouholeté zkušenosti s vývojem a výrobou vysoce výkonných ultrasonicators pro laboratoře, výzkumná zařízení i průmyslovou výrobu s velmi vysokou propustností. Pro mikrobiologii a vědy o životě nabízí Hielscher různá řešení, která vyhovují různým požadavkům nezbytným pro specifické tkáně a jejich ošetření. Pro současnou ultrazvuku četných vzorků Hielscher nabízí UIP400MTP pro vícejamkové desky, VialTweeter pro sonikaci až 10 lahviček (např. Eppendorfovy trubice) nebo ultrazvukový CupHorn. Ultrazvukové sondy jsou k dispozici od 50 do 400 wattů jako laboratorní homogenizátory, zatímco průmyslové systémy pokrývají rozsah výkonu od 500 wattů do 16 kW.
Spojte se s námi a dejte nám vědět o vašich požadavcích na aplikaci a proces. Náš zkušený personál vám rád doporučí nejvhodnější ultrasonicator pro váš biologický proces.
Níže uvedená tabulka vám dává informaci o přibližné zpracovatelské kapacity našich ultrasonicators:

Hromadná dávka průtok Doporučené Devices
multiwell / mikrotitrační desky na UIP400MTP
až 10 injekčních lahviček na VialTweeter
až 5 injekčních lahviček/zkumavek nebo 1 větší nádoba na CupHorn
1 až 500 ml 10 až 200 ml / min UP100H
10 až 2000ml 20 až 400 ml / min Uf200 ः t, UP400St
00,1 až 20L 00,2 až 4 litry / min UIP2000hdT
10 až 100L 2 až 10 l / min UIP4000hdT
na 10 až 100L / min UIP16000
na větší hrozen UIP16000

Kontaktujte nás! / Zeptej se nás!

Požádejte o další informace

Vyplňte prosím níže uvedený formulář a vyžádejte si další informace o našich ultrasonicators, jejich aplikacích a ceně. Rádi s vámi prodiskutujeme váš proces a nabídneme vám ultrazvukový systém splňující vaše požadavky!









Uvědomte si prosím naši Zásady ochrany osobních údajů,



Ultrazvukové homogenizátory s vysokým smykem se používají v laboratorních, stolních, pilotních a průmyslových zpracováních.

Hielscher Ultrazvuk vyrábí vysoce výkonné ultrazvukové homogenizátory pro míchání aplikací, disperze, emulgaci a extrakce v laboratoři, pilotním a průmyslovém měřítku.



Literatura / Reference


Vysoce výkonný ultrazvuk! Hielscherův sortiment pokrývá celé spektrum od kompaktního laboratorního ultrasonicatoru přes bench-top jednotky až po plně průmyslové ultrazvukové systémy.

Hielscher Ultrasonics vyrábí vysoce výkonné ultrazvukové homogenizátory od Laboratoř na průmyslové velikosti.


Rádi probereme váš proces.

Pojďme se spojit.