Genetická transformace rostlinných buněk pomocí ultrazvuku

Sonikací podporovaná transformace mediovaná Agrobacterium (SAAT) je účinná metoda infikování rostlinných buněk cizorodými geny s využitím Agrobacterium jako přenašeče. Ultrazvuková kavitace vyvolává sonoporaci, kterou lze popsat jako cílené mikroporanění rostlinné tkáně. Prostřednictvím těchto ultrazvukově vytvořených mikroporanění lze DNA a vektory DNA účinně transportovat do buněčné matrix.

Sonoporace – ultrazvukově zesílená transformace buněk

Při aplikaci nízkofrekvenčního ultrazvuku (přibl. 20kHz) na buněčné suspenze vyvolávají účinky akustické kavitace přechodnou permeabilizaci membrán buněčných tkání. Tento ultrazvukový efekt je znám jako sonoporace a používá se k přenosu genů do buněk nebo tkání.
Výhody ultrasonikace vycházejí z jejího netepelného mechanického principu činnosti, díky němuž je sonikace často univerzálnější a méně závislá na typech buněk. Univerzální použití sonoporace otevírá možnost využití transgenních rostlin, které mají významný potenciál v bioprodukci komplexních lidských terapeutických proteinů. Takové bioreaktory na rostlinné bázi lze snadno geneticky manipulovat, zabraňují potenciální kontaminaci lidskými patogeny, nepoškozují bakterie zprostředkující transformaci (např. Agrobacterium) a představují nenákladnou, účinnou metodu biosyntézy.

Ultrazvukem podporovaná transformace buněk

Sonikace je technika, která využívá nízkofrekvenční ultrazvukové vlny k rozrušování částic v roztoku a k míchání roztoků, čímž zvyšuje rychlost přenosu hmoty a rozpouštění. Současně může sonikace odstraňovat z kapalin rozpuštěné plyny. Při transformaci rostlin sonikace vyvolá tvorbu mikroporanění na rostlinné tkáni a zesílí dodání nahé DNA do rostlinného protoplastu.

Pro genetickou transformaci je sonikací podporovaná transformace mediovaná Agrobacterium (SAAT) preferovanou metodou a má výrazně vyšší účinnost než sonikace používaná k přenosu nahé DNA a vektorů DNA přímo do protoplastu. Řada studií prokázala, že sonikací podporovanou transformaci mediovanou Agrobacterium (SAAT) lze využít k vyvolání mechanického rozrušení a tvorby poranění na rostlinných buňkách působením ultrazvukových vln a z nich vyplývající akustické kavitace. Krátké ultrazvukové ošetření vytváří mikroporanění na povrchu explantátů. Poraněné buňky umožní průnik Agrobacterium do hlubších částí rostlinných tkání, čímž se zvyšuje pravděpodobnost infikování rostlinných buněk. Vylučované fenolické látky navíc transformaci zesilují. Ultrazvukově vytvořená mikroporanění činí průnik bakterií do explantátu rovněž snadněji proveditelným. SAAT byla úspěšně použita pro genetickou transformaci u rostlinných druhů, které jsou považovány za zvláště odolné vůči Agrobacterium.
Hlavními výhodami SAAT jsou velmi jednoduchá a nenákladná metoda, jakož i významné zesílení přenosu genů mediovaného Agrobacterium. Kromě úspěšného použití SAAT při transformaci Chenopodium rubrum L. a Beta vulgaris L. byl tento přístup uplatněn také při produkci rekombinantního tepelně labilního holotoxinu divokého typu Escherichia coli a mutantních LT vakcinačních adjuvans Escherichia coli v Nicotiana tabacum, u nichž byly nejvyšší systémové titry IgG specifické pro LT-B detekovány u ptáků.
(srov. Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka a R. Baranski, 2014)

Obecný postup přenosu genů prostřednictvím sonoporace v rostlinných buňkách

1. Příprava genetického materiálu: Začněte přípravou genetického materiálu, který chcete vnést do rostlinných buněk. Může to být plazmidová DNA, RNA nebo jiné nukleové kyseliny.
2. Izolace rostlinných buněk: Izolujte rostlinné buňky, na které se chcete zaměřit. V závislosti na vašem experimentu mohou být tyto buňky izolovány z rostlinných tkání nebo z kultur.
3. Buněčná suspenze: Suspendujte rostlinné buňky ve vhodném médiu nebo pufru. To je nezbytné k zajištění toho, aby byly buňky zdravé a ve stavu příznivém pro příjem genů.
4. Nastavte svůj sonikátor: Připravte svůj sonikátor sondového typu předběžným nastavením parametrů sonikace, jako jsou amplituda, čas, energie a teplota. Ponořte ultrazvukovou sondu do buněčné suspenze.
5. Sonikace: Spusťte postup sonikace. Rychlé oscilace hrotu sondy generují v kapalině kavitační bubliny. Tyto bubliny se působením ultrazvukových vln rozpínají a kolabují, čímž v suspenzi vytvářejí mechanické síly a mikroproudění.
6. Sonoporace: Mechanické síly a mikroproudění generované kavitací vytvářejí v membránách rostlinných buněk dočasné póry a otvory. Genetický materiál přítomný v suspenzi může těmito póry vstoupit do rostlinných buněk.
7. Inkubace: Po sonoporačním ošetření rostlinné buňky inkubujte, aby se mohly zotavit a stabilizovat své membrány. Jde o klíčový krok k zajištění přežití buněk a úspěšného přenosu genů.

Přenos genů prostřednictvím Agrobacterium nebo liposomů

Existují dvě běžné formy transfekce rostlinných buněk. Používají jako nosič genetického materiálu buď agrobacterium, rod gramnegativních bakterií, nebo liposomy.

• Sonoporace mediovaná Agrobacterium: Agrobacterium tumefaciens je bakterie běžně používaná v rostlinném genetickém inženýrství. Při této metodě se plazmidová DNA obsahující požadovaný gen vnese do Agrobacterium, které se poté smíchá s rostlinnými buňkami. Buněčná suspenze je podrobena sonoporaci pomocí sonikátoru sondového typu. Ultrazvuková energie zesiluje přenos genetického materiálu z Agrobacterium do rostlinných buněk. Tato metoda je široce používána pro genetickou modifikaci rostlin.
• Sonoporace mediovaná liposomy: Liposomy jsou vezikuly na lipidové bázi, které mohou nést genetický materiál. Při této metodě se liposomy naplněné plazmidovou DNA nebo jinými nukleovými kyselinami smíchají s rostlinnými buňkami. K usnadnění příjmu liposomů rostlinnými buňkami se využívá sonoporace pomocí sonikátoru sondového typu. Ultrazvuk rozrušuje lipidové dvojvrstvy liposomů a uvolňuje genetický materiál do rostlinných buněk. Tento přístup je užitečný pro studie přechodné genové exprese v rostlinných buňkách.

Vědecky prokázané přínosy sonikací podporované transformace mediované Agrobacterium (SAAT)

Sonikací podporovaná transformace mediovaná Agrobacterium (SAAT) byla uplatněna u mnoha rostlinných druhů. Krátké a relativně mírné ultrazvukové ošetření rostlinných buněčných kultur vyvolává sonoporaci, která následně umožňuje hluboký průnik Agrobacterium jako přenašeče genů. Níže si můžete přečíst příkladové studie prokazující příznivé účinky SAAT.

Ultrazvukem podporovaná transformace ashwagandhy

Za účelem zvýšení účinnosti transformace u W. somnifera (známé jako ashwagandha nebo vitánie snodárná) zkoumali Dehdashti a kolegové (2016) použití acetosyringonu (AS) a sonikace.
Acetosyringon (AS) byl přidáván ve třech fázích: tekutá kultura Agrobacterium, infekce Agrobacterium a kokultivace explantátů s Agrobacterium. Přídavek 75 μM AS do tekuté kultury Agrobacterium se ukázal jako optimální pro indukci vir genů.
Dodatečná aplikace sonikace (SAAT) vedla k nejvyšší genové expresi. Exprese genu gusA ve vlasových kořenech byla nejlepší tehdy, když byly listy a vrcholy výhonů sonikovány po dobu 10 a 20s, v tomto pořadí. Účinnost transformace zlepšeného protokolu byla zaznamenána 66,5 a 59,5% v případě listových explantátů a explantátů vrcholů výhonů, v tomto pořadí. Ve srovnání s jinými protokoly byla účinnost transformace tohoto zlepšeného protokolu 2,5krát vyšší u listů a 3,7krát více u vrcholů výhonů. Analýzy metodou Southern blot potvrdily 1–2 kopie transgenu gusA v liniích W1-W4, zatímco v linii W5 vytvořené zlepšeným protokolem byly detekovány 1–4 kopie transgenu.

Vliv doby trvání sonikací podporované transformace mediované Agrobacterium (SAAT) na frekvenci transformace listových explantátů (a) a explantátů vrcholů výhonů (b) W. somnifera
(studie a grafika: © Dehdashti et al., 2016)

Ultrazvukem podporovaná transformace bavlny

Hussain et al. (2007) prokazují příznivé účinky sonikací podporované transformace bavlny. Akustická kavitace vyvolaná nízkofrekvenčním ultrazvukem vytváří mikroporanění na povrchu rostlinné tkáně i pod ním (sonoporace) a umožňuje Agrobacterium pronikat hlouběji a úplně celou rostlinnou tkání. Tento způsob poranění zvyšuje pravděpodobnost infikování rostlinných buněk ležících hlouběji v tkáni. Pro vyhodnocení účinnosti transformace SAAT byla měřena exprese genu GUS. Reportérový systém GUS je systém reportérových genů, zvláště užitečný v molekulární biologii rostlin a v mikrobiologii. Úpravou různých parametrů SAAT byla přechodná exprese GUS v bavlně s použitím zralých embryí jako explantátu významně zvýšena. GUS byl poprvé detekován 24h po inkubaci explantátů a po 48h byla exprese GUS velmi intenzivní, což posloužilo jako užitečný indikátor úspěšné transformace explantátu bavlny po sonikací podporované transformaci mediované Agrobacterium (SAAT). Při srovnání různých transformačních technik (konkrétně biolistické, Agro, BAAT, SAAT) vykázala sonikací podporovaná transformace mediovaná Agrobacterium (SAAT) zdaleka nejlepší výsledky transformace.

Volba transformačního postupu na základě přechodné exprese GUS. Sonikací podporovaná transformace mediovaná Agrobacterium (SAAT) vykazuje významně vyšší přechodnou expresi.
(studie a grafika: © Hussain et al., 2007)

Vysoce výkonná ultrazvuková řešení pro sonoporaci a SAAT

Hielscher Ultrasonics má dlouholeté zkušenosti s vývojem a výrobou vysoce výkonných ultrasonikátorů pro laboratoře, výzkumná pracoviště i průmyslovou produkci s velmi vysokou propustností. Pro mikrobiologii a vědy o živé přírodě nabízí Hielscher různá řešení vyhovující odlišným požadavkům nezbytným pro konkrétní tkáně a jejich ošetření. Pro současnou ultrasonikaci mnoha vzorků nabízí Hielscher UIP400MTP pro multiwell plotny, VialTweeter pro sonikaci až 10 vialek (např. zkumavek Eppendorf) nebo ultrazvukový CupHorn. Ultrasonikátory sondového typu mají výkon od 50 do 400 wattů pro laboratorní homogenizátory a od 500 wattů do 16 kW pro průmyslové systémy.
Kontaktujte nás prosím a sdělte nám své požadavky na aplikaci a proces. Náš zkušený tým vám rád doporučí nejvhodnější ultrasonikátor pro váš biologický proces.
Níže uvedená tabulka vám poskytuje představu o přibližné kapacitě zpracování našich ultrasonikátorů: