Genetická transformace v rostlinných buňkách pomocí ultrazvuku

Sonikation-Assisted Agrobacterium-Mediated Transformation (SAAT) je účinná metoda infikování rostlinných buněk cizími geny pomocí Agrobacterium jako transportéru. Ultrazvuková kavitace způsobuje sonoporaci, kterou lze popsat jako cílené mikroporanění rostlinného pletiva. Prostřednictvím těchto ultrazvukem vytváří mikrorány, DNA a DNA vektory mohou být efektivně transportovány do buněčné matrice.

sonoporace – Ultrazvukem vylepšená buněčná transformace

Když je nízkofrekvenční ultrazvuk (cca 20 kHz) aplikován na buněčné suspenze, účinky akustické kavitace způsobují přechodnou permeabilizaci membrány na buněčných tkáních. Tento ultrazvukový efekt je známý jako sonoporace a používá se pro přenos genů do buněk nebo tkání.
Výhody ultrazvuku jsou založeny na jeho netepelném mechanickém pracovním principu, díky kterému je sonikace často univerzálnější a méně závislá na typech buněk. Všestranné využití sonoporace otevírá možnosti využití transgenních rostlin, které mají významný potenciál v bioprodukci komplexních lidských terapeutických proteinů. Takové rostlinné bioreaktory mohou být snadno geneticky manipulovatelné, zabraňují potenciální kontaminaci lidskými patogeny, nepoškozují bakterie zprostředkovávající transformaci (např. Agrobacterium) a jsou levnou a účinnou metodou biosyntézy.

Ultrazvukem asistovaná buněčná transformace

Sonikace je technika, která aplikuje nízkofrekvenční ultrazvukové vlny k míchání částic v roztoku, ke smíchání roztoků, čímž se zvyšuje rychlost přenosu a rozpouštění hmoty. Současně může sonikace odstranit rozpuštěné plyny z kapalin. Při transformaci rostlin způsobí sonikace tvorbu mikroran na rostlinné tkáni a zvýší dodávku nahé DNA do rostlinného protoplastu.

Pro genetickou transformaci je upřednostňovanou metodou transformace zprostředkovaná Sonikací asistovaná agrobakteriemi (SAAT) a má výrazně vyšší účinnost než sonikace používaná k přenosu nahé DNA a vektorů DNA přímo do protoplastu. Četné studie prokázaly, že sonikací asistovaná transformace zprostředkovaná Agrobacterium (SAAT) může být použita k vyvolání mechanického narušení a tvorby ran na rostlinných buňkách ultrazvukovými vlnami a výslednou akustickou kavitací. Krátké ultrazvukové ošetření vytváří na povrchu explantátů mikroranky. Protože poraněné buňky umožní pronikání Agrobacterium do hlubší části rostlinných tkání, čímž se zvyšuje pravděpodobnost infikování rostlinných buněk. Sekretované fenolické sloučeniny navíc zvyšují transformaci. Díky ultrazvukem generovaným mikroranám je také pronikání bakterií do explantátu proveditelnější. SAAT byl úspěšně použit pro genetickou transformaci u rostlinných druhů, které jsou zvláště považovány za rezistentní vůči Agrobacterium.
Hlavními výhodami SAAT je to, že se jedná o velmi jednoduchou a levnou metodu, stejně jako významné zlepšení přenosu genů zprostředkovaného Agrobacterium. Kromě úspěšné aplikace SAAT při přeměně Chenopodium rubrum L. a Beta vulgaris L. byl tento přístup aplikován také při produkci rekombinantních adjuvans Escherichia coli divokého typu tepelně labilního holotoxinu a Escherichia coli mutantních LT adjuvans u Nicotiana tabacum, ve kterých byly u ptáků detekovány nejvyšší systémové LT-B-specifické titry IgG.
(srov. Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka a R. Baranski, 2014)

Obecný postup přenosu genů sonoporací v rostlinných buňkách

1. Příprava genetického materiálu: Začněte tím, že si připravíte genetický materiál, který chcete zavést do rostlinných buněk. Může to být plazmidová DNA, RNA nebo jiné nukleové kyseliny.
2. Izolace rostlinných buněk: Izolujte rostlinné buňky, na které se chcete zaměřit. V závislosti na vašem experimentu mohou být tyto buňky izolovány z rostlinných tkání nebo kultur.
3. Buněčná suspenze: Rostlinné buňky zavěste do vhodného média nebo pufru. To je nezbytné pro zajištění toho, aby buňky byly zdravé a ve stavu příznivém pro vychytávání genů.
4. Nastavte si Sonikator: Připravte si sonikátor typu sondy přednastavením parametrů sonikace, jako je amplituda, čas, energie a teplota. Ponořte ultrazvukovou sondu do buněčné suspenze.
5. Sonikace: Spusťte postup sonikace. Rychlá oscilace hrotu sondy vytváří v kapalině kavitační bubliny. Tyto bubliny se rozpínají a kolabují v důsledku ultrazvukových vln, vytvářejí mechanické síly a mikroproudění v suspenzi.
6. Zvuk: Mechanické síly a mikroproudění generované kavitací vytvářejí dočasné póry a díry v membránách rostlinných buněk. Genetický materiál přítomný v suspenzi může vstoupit do rostlinných buněk těmito póry.
7. Inkubace: Po sonoporační léčbě inkubujte rostlinné buňky, aby se mohly zotavit a stabilizovat své membrány. To je zásadní krok k zajištění přežití buněk a úspěšného přenosu genů.

Přenos genů prostřednictvím agrobakterií nebo liposomů

Existují dvě běžné formy transfekce rostlinné buňky. Jako nosič genetického materiálu používají buď agrobacterium, rod gramnegativních bakterií, nebo liposomy.

• Sonoporace zprostředkovaná agrobakteriemi: Agrobacterium tumefaciens je bakterie běžně používaná v genetickém inženýrství rostlin. Při této metodě se do Agrobacterium zavede plazmidová DNA obsahující požadovaný gen, která se pak smíchá s rostlinnými buňkami. Buněčná suspenze je podrobena sonoporaci pomocí sonikátoru typu sondy. Ultrazvuková energie zvyšuje přenos genetického materiálu z Agrobacterium do rostlinných buněk. Tato metoda je široce používána pro genetickou modifikaci rostlin.
• Sonoporace zprostředkovaná liposomy: Liposomy jsou vezikuly na bázi lipidů, které mohou nést genetický materiál. Při této metodě se liposomy naložené plazmidovou DNA nebo jinými nukleovými kyselinami mísí s rostlinnými buňkami. Sonoporace pomocí sonikátoru typu sondy se používá k usnadnění vychytávání liposomů rostlinnými buňkami. Ultrazvuk narušuje lipidové dvojvrstvy lipozomů a uvolňuje genetický materiál do rostlinných buněk. Tento přístup je užitečný pro přechodné studie genové exprese v rostlinných buňkách.

Vědecky prokázané výhody transformace zprostředkované agrobakteriemi za pomoci ultrazvuku (SAAT)

Sonikation-Assisted Agrobacterium-Mediated Transformation (SAAT) byla aplikována na mnoho rostlinných druhů. Krátké a relativně mírné ultrazvukové ošetření rostlinných buněčných kultur způsobuje sonoporaci, která následně umožňuje hluboké proniknutí Agrobacterium jako genového transportéru. Níže si můžete přečíst příkladné studie, které prokazují příznivé účinky SAAT.

Ultrazvukem asistovaná transformace Ashwagandha

Aby se zlepšila účinnost transformace u W. somnifera (známá jako ashwagandha nebo zimní třešeň), Dehdashti a kolegové (2016) zkoumali použití acetosyringonu (AS) a sonikace.
Acetosyringon (AS) byl přidán ve třech fázích: tekutá kultura Agrobacterium, infekce Agrobacterium a kokultivace explantátů s Agrobacterium. Bylo zjištěno, že přidání 75 μM AS do tekuté kultury Agrobacterium je optimální pro indukci virových genů.
Další aplikace sonikace (SAAT) vedla k nejvyšší genové expresi. Bylo zjištěno, že genová exprese gusA ve vlasatých kořenech je nejlepší, když jsou listy a špičky výhonků sonikovány po dobu 10 a 20 sekund. Transformační efektivita vylepšeného protokolu byla zaznamenána 66,5 % v případě explantátů s listovými a špičatými výhonky. Ve srovnání s jinými protokoly bylo zjištěno, že transformační účinnost tohoto vylepšeného protokolu je 2,5krát vyšší pro listy a 3,7krát vyšší pro špičky výhonků. Analýzy Southern blot potvrdily 1–2 kopie transgenu gusA v liniích W1-W4, zatímco 1–4 kopie transgenu byly detekovány v linii W5 generované vylepšeným protokolem.

Vliv doby trvání sonikací asistované transformace zprostředkované Agrobacterium (SAAT) na frekvenci transformace explantátů listu W. somnifera (a) a špičky výhonku (b)
(studie a grafika: © Dehdashti et al., 2016)

Ultrazvukem asistovaná transformace bavlny

Hussain et al. (2007) demonstrují příznivé účinky transformace bavlny za pomoci sonikace. Akustická kavitace způsobená nízkofrekvenčním ultrazvukem vytváří mikrorány na a pod povrchem rostlinného pletiva (sonoporace) a umožňuje Agrobacterium cestovat hlouběji a úplně skrz rostlinnou tkáň. Tento zraňující způsob zvyšuje pravděpodobnost infikování rostlinných buněk ležících hlouběji v tkáni. Aby bylo možné vyhodnotit transformační účinnost SAAT, byla měřena exprese genu GUS. Reportérový systém GUS je reportérový genový systém, který je zvláště užitečný v molekulární biologii a mikrobiologii rostlin. Úpravou různých parametrů SAAT se významně zvýšila přechodná exprese GUS v bavlně s použitím zralých embryí jako explantátu. GUS byl poprvé detekován 24 hodin po inkubaci explantátů a do 48 hodin byla exprese GUS velmi intenzivní, což sloužilo jako užitečný indikátor úspěšné transformace bavlníkového explantátu po sonikací asistované transformaci zprostředkované Agrobacterium (SAAT). Porovnání různých transformačních technik (jmenovitě biolistické, Agro, BAAT, SAAT), sonikací asistované transformace zprostředkované Agrobacterium (SAAT) ukázalo zdaleka nejlepší výsledky transformace.

Volba transformačního postupu na základě přechodné exprese GUS. Sonikací asistovaná transformace zprostředkovaná agrobakteriemi (SAAT) vykazuje výrazně vyšší přechodnou expresi.
(studie a grafika: © Hussain et al., 2007)

Vysoce výkonná ultrazvuková řešení pro sonoporaci a SAAT

Hielscher Ultrasonics má dlouholeté zkušenosti s vývojem a výrobou vysoce výkonných ultrazvukových přístrojů pro laboratoře, výzkumná zařízení i průmyslovou výrobu s velmi vysokou propustností. Pro mikrobiologii a vědy o živé přírodě nabízí Hielscher různá řešení, která vyhovují různým požadavkům nezbytným pro konkrétní tkáně a jejich léčbu. Pro současné ultrazvuku mnoha vzorků Hielscher nabízí UIP400MTP pro vícejamkové desky, VialTweeter pro sonikaci až 10 lahviček (např. Eppendorf zkumavky) nebo ultrazvukový CupHorn. Ultrazvukové přístroje typu sondy jsou k dispozici od 50 do 400 wattů jako laboratorní homogenizátory, zatímco průmyslové systémy pokrývají výkonový rozsah od 500 wattů do 16 kW.
Spojte se s námi a sdělte nám své požadavky na aplikaci a proces. Náš zkušený personál vám rád doporučí nejvhodnější ultrasonikátor pro váš biologický proces.
Níže uvedená tabulka vám poskytuje přibližný přehled o zpracovatelské kapacitě našich ultrasonicators: