Tvorba amyloidních fibril pomocí mikrodestičkového sonikátoru UIP400MTP

Amyloidní fibrily vznikají podobně jako krystaly procesem nukleace a následného růstu. Kvůli vysoké bariéře volné energie nukleace však ke spontánní tvorbě amyloidních fibril dochází až po prodloužené lag fázi. Sonikace se ukázala jako účinný nástroj k indukci amyloidní nukleace, čímž výrazně urychluje tvorbu fibril. Ve spojení se čtečkou mikrodestiček využívající fluorescenci thioflavinu T (ThT) umožňuje sonikace vysokokapacitní detekci amyloidních fibril ve více vzorcích současně.

Ultrazvukem indukovaná tvorba amyloidních fibril pomocí mikrodestičkového sonikátoru UIP400MTP

Se sonikátorem pro vícejamkové destičky UIP400MTP lze pro výzkumné účely rychle syntetizovat velká množství amyloidních fibril stejné kvality. Tento efektivní přístup umožňuje studium amyloidogenity proteinů. Tato technika usnadňuje rychlou a reprodukovatelnou amyloidní fibrilaci, jak bylo prokázáno na β2-mikroglobulinu (β2-m), amyloidogenním proteinu spojeném s amyloidózou související s dialýzou.

Jednoduchý experimentální přístup: ultrazvukem indukovaná amyloidní fibrilace

K indukci tvorby fibril byla 96jamková mikrodestička umístěna do středu sonikátoru pro vícejamkové destičky UIP400MTP, který zajišťuje rovnoměrné působení ultrazvuku ve všech jamkách. Experimentální podmínky byly následující:

1. Každá jamka obsahovala 0,2 ml roztoku β2-mikroglobulinu (0,3 mg/ml, pH 2,5) s přídavkem 5 μM ThT.
2. Destička byla podrobena cyklům sonikace, například 1minutové sonikaci následované 9 minutami pauzy.
3. Po sonikaci byla fluorescence ThT měřena pomocí čtečky mikrodestiček.

(srov. So et al., 2011)

Srovnání s konvenčním mícháním

Ve srovnání s tradičními metodami míchání sonikace drasticky zkrátila lag fázi tvorby fibril. Za podmínek konvenčního třepání mikrodestiček vykazovala po 20 hodinách zvýšenou fluorescenci ThT pouze 1 z 10 jamek. Naproti tomu při cyklické sonikaci (15 minut sonikace následovaných 5 minutami klidu) byl významný nárůst fluorescence ThT zjištěn ihned po prvním sonikačním ošetření.

Prudké zrychlení kinetiky fibrilace

Výsledky, které získali So et al. (2011), prokázaly, že spontánní tvorbu fibril β2-mikroglobulinu při pH 2,5 lze pomocí sonikace urychlit z několika hodin na pouhých 10–15 minut.
Snímky z mikroskopie atomárních sil (AFM) potvrdily, že fibrily vytvořené 10minutovou sonikací každých 15 minut byly morfologicky nerozlišitelné od fibril vytvořených 1minutovou sonikací každých 10 minut. To zdůrazňuje reprodukovatelnost a robustnost ultrazvukem indukované amyloidní fibrilace.

Snímky AFM amyloidních fibril vytvořených 1min sonikací každých 10 min (i), 10min sonikací každých 15 min (ii) a očkovací (seeding) reakcí bez sonikace (iii). Bílé měřítko odpovídá 1 μm.
Studie a snímky: ©So et al., 2011

Fibrilace za neutrálního pH

I za neutrálního pH bylo tvorby fibril dosaženo po lag fázi trvající 1,5 hodiny, což ukazuje, že sonikace výrazně snižuje energetickou bariéru nukleace a růstu. To dále podporuje hypotézu, že amyloidní fibrilace je primárně fyzikální reakcí, do značné míry omezenou energetickou bariérou nukleace, kterou sonikace účinně snižuje.

Význam pro výzkum onemocnění souvisejících s amyloidem

Snadná a spolehlivá tvorba amyloidních fibril pomocí mikrodestičkového sonikátoru UIP400MTP má významné důsledky pro výzkum Alzheimerovy choroby (AD) a dalších onemocnění souvisejících s amyloidem, jako je Parkinsonova choroba, diabetes II. typu a systémové amyloidózy. U AD je agregace amyloidu-β (Aβ) klíčovým patologickým znakem, studium kinetiky jeho fibrilace však zůstává náročné kvůli dlouhým lag fázím a variabilitě konvenčních metod. Tvorba fibril řízená sonikací urychluje nukleaci a zajišťuje vysokou reprodukovatelnost a sníženou variabilitu, což je zásadní pro screening potenciálních inhibitorů a pochopení amyloidogenních mechanismů. Vysokokapacitní schopnost UIP400MTP navíc umožňuje rozsáhlé studie chybného skládání a agregace proteinů, což usnadňuje objevování terapeutických látek, které mohou modulovat tvorbu fibril a potenciálně zmírnit neurodegenerativní progresi.

Tato studie prokazuje, že sonikace pomocí sonikátoru pro vícejamkové destičky UIP400MTP je vysoce účinnou metodou pro urychlení tvorby amyloidních fibril. Mezi hlavní výhody tohoto přístupu patří:

• Dramatické zkrácení lag fáze fibrilace.
• Rovnoměrné působení ultrazvuku ve všech jamkách, umožňující reprodukovatelnou tvorbu fibril.
• Schopnost vysokokapacitního screeningu, díky níž je metoda vhodná pro celogenomové vyhledávání amyloidogenity proteinů.

Díky integraci sonikace s detekcí fluorescence ThT poskytuje tato metoda rychlou, škálovatelnou a spolehlivou platformu pro studium amyloidní fibrilace. Vzhledem ke své účinnosti a vysokokapacitnímu potenciálu může tento přístup usnadnit jednoduchou syntézu amyloidních fibril pro biofyzikální a farmaceutický výzkum a nabídnout slibný nástroj pro studie související s amyloidem a screening léčiv.