Tvorba amyloidních fibril pomocí UIP400MTP Microplate Sonicator

Amyloidní fibrily, podobně jako krystaly, vznikají procesem nukleace a následného růstu. Vzhledem k vysoké bariéře nukleace volné energie však ke spontánní tvorbě amyloidních fibril dochází až po delší fázi zpoždění. Ultrazvuku se ukázalo jako mocný nástroj pro indukci nukleace amyloidu, čímž se výrazně urychluje tvorba fibril. V kombinaci se čtečkou mikrodestiček používající fluorescenci thioflavinu T (ThT) umožňuje ultrazvuku vysoce výkonnou detekci amyloidních fibril ve více vzorcích současně.

Ultrazvukem indukovaná tvorba amyloidních fibril pomocí UIP400MTP Microplate Sonicator

S UIP400MTP vícejamkovým destičkovým sonikátorem lze rychle syntetizovat amyloidní fibrily stejné kvality ve velkém množství pro výzkumné účely. Tento efektivní přístup umožňuje studovat proteinovou amyloidogenitu. Tato technika usnadňuje rychlou a reprodukovatelnou fibrilaci amyloidu, jak bylo prokázáno u β2-mikroglobulinu (β2-m), amyloidogenního proteinu spojeného s amyloidózou související s dialýzou.

Jednoduchý experimentální přístup: Ultrazvukem indukovaná fibrilace amyloidu

Aby se vyvolala tvorba fibril, byla do středu sonikátoru UIP400MTP vícejamkových destiček umístěna 96jamková mikrodestička, která zajišťuje rovnoměrnou ultrazvukovou expozici ve všech jamkách. Experimentální podmínky byly následující:

1. Každá jamka obsahovala 0,2 ml roztoku β2-mikroglobulinu (0,3 mg/ml, pH 2,5) doplněného o 5 μM ThT.
2. Deska byla podrobena ultrazvukovým cyklům, jako je 1-minutová ultrazvuku následovaná 9minutovou pauzou.
3. Po sonikaci byla fluorescence ThT měřena pomocí čtečky mikrodestiček.

(srov. So et al., 2011)

Srovnání s konvenčním mícháním

Ve srovnání s tradičními metodami míchání ultrazvuku drasticky snížila zpožděnou fázi tvorby fibril. Za konvenčních podmínek protřepávání mikrodestiček pouze 1 z 10 jamek vykazovala zvýšenou fluorescenci ThT po 20 hodinách. Naproti tomu při použití cyklické ultrazvuku (15 minut sonikace následované 5 minutami klidového stavu) bylo ihned po prvním ošetření sonikací zjištěno významné zvýšení fluorescence ThT.

Rychlé zrychlení kinetiky fibrilace

Výsledky získané od So et al. (2011) prokázaly, že spontánní tvorba fibril β2-mikroglobulinu při pH 2,5 může být ultrazvukem zrychlena z několika hodin na pouhých 10–15 minut.
Snímky z mikroskopie atomárních sil (AFM) potvrdily, že fibrily generované 10minutovou ultrazvukou každých 15 minut byly morfologicky nerozeznatelné od těch, které byly vytvořeny pomocí 1minutové ultrazvuku každých 10 minut. To zdůrazňuje reprodukovatelnost a robustnost ultrazvukem indukované fibrilace amyloidu.

AFM obrazy amyloidních fibril produkovaných 1-minutovou ultrazvukou každých 10 minut (i), 10-minutovou sonikací každých 15 minut (ii) a výsevní reakcí bez ultrazvuku (iii). Bílý pruh měřítka představuje 1 μm.
Studie a obrázky: ©So et al., 2011

Fibrilace při neutrálním pH

I za podmínek neutrálního pH bylo dosaženo tvorby fibril se zpožděním 1,5 hodiny, což dokazuje, že ultrazvuku významně snižuje energetickou bariéru pro nukleaci a růst. To dále podporuje hypotézu, že fibrilace amyloidu je primárně fyzikální reakcí, do značné míry omezenou bariérou nukleační energie, kterou ultrazvuku účinně snižuje.

Dopad na výzkum onemocnění souvisejících s amyloidem

Snadná a spolehlivá tvorba amyloidních fibril pomocí UIP400MTP sonikátoru mikrodestiček má významné důsledky pro výzkum Alzheimerovy choroby (AD) a dalších poruch souvisejících s amyloidem, jako je Parkinsonova choroba, diabetes typu II a systémové amyloidózy. U AD je agregace amyloid-β (Aβ) klíčovým patologickým znakem, přesto studium kinetiky jeho fibrilace zůstává náročné kvůli dlouhým zpožděným fázím a variabilitě v konvenčních metodách. Ultrazvukem řízená tvorba fibril urychluje nukleaci, zajišťuje vysokou reprodukovatelnost a sníženou variabilitu, což je zásadní pro screening potenciálních inhibitorů a pochopení amyloidogenních mechanismů. Vysoká propustnost UIP400MTP navíc umožňuje rozsáhlé vyšetřování chybného skládání a agregace proteinů, což usnadňuje objevování terapeutických látek, které mohou modulovat tvorbu fibril a potenciálně zmírnit neurodegenerativní progresi.

Tato studie zavádí ultrazvuku pomocí UIP400MTP vícejamkového deskového sonikátoru jako vysoce účinnou metodu pro urychlení tvorby amyloidních fibril. Mezi hlavní výhody tohoto přístupu patří:

• Dramatické zkrácení prodlevy fibrilace.
• Rovnoměrná ultrazvuková expozice ve všech jamkách, umožňující reprodukovatelnou tvorbu fibril.
• Vysoce výkonná screeningová schopnost, díky čemuž je vhodná pro celogenomové vyhledávání proteinové amyloidogenity.

Integrací ultrazvuku s fluorescenční detekcí ThT poskytuje tato metoda rychlou, škálovatelnou a spolehlivou platformu pro studium fibrilace amyloidu. Vzhledem ke své účinnosti a vysokému potenciálu propustnosti může tento přístup usnadnit snadnou syntézu amyloidních fibril pro biofyzikální a farmaceutický výzkum a nabízí slibný nástroj pro studie související s amyloidem a screening léků.