PMCA pro vysokokapacitní detekci prionů pomocí sonikátoru UIP400MTP

Sonikátor pro multi-well plotny UIP400MTP nabízí výkonné řešení pro vysokokapacitní přípravu vzorků při cyklické amplifikaci nesprávně složených proteinů (PMCA). Díky rovnoměrné distribuci energie do více jamek a zachování precizních parametrů sonikace umožňuje tento systém současné zpracování velkého počtu vzorků s výjimečnou reprodukovatelností. Tyto schopnosti jsou klíčové pro optimalizaci PMCA při detekci prionů v nízkých koncentracích v obtížných biologických vzorcích, jako jsou sliny, kde inhibitory testu mohou zastírat výsledky.

Prionová onemocnění, jako je chronické chřadnutí (CWD) u jelenovitých a Creutzfeldtova-Jakobova nemoc (CJD) u lidí, jsou neurodegenerativní poruchy způsobené nesprávně složenými prionovými proteiny (PrP^Sc). Tato onemocnění často zahrnují nízké hladiny infekčních prionů v tělních tekutinách, jako jsou sliny, krev a moč, což komplikuje diagnostiku a výzkum. Horizontální přenos CWD prostřednictvím prionů vylučovaných do složek prostředí má zvláště významné důsledky pro management volně žijících zvířat a ekologické zdraví. Podobně je u onemocnění, jako je Creutzfeldtova-Jakobova nemoc, spolehlivá amplifikace nesprávně složených prionových proteinů z lidských vzorků klíčová pro pokrok v diagnostice a porozumění progresi onemocnění.

Usnadněte testy MBEC spolehlivým a rychlým uvolňováním biofilmu pomocí sonikátoru pro mikroplotny UIP400MTP. UIP400MTP zvládne jakoukoli standardní testovací plotnu a účinně odděluje buňky a biofilmy.

Použití modifikovaného protokolu PMCA umožňuje obejít běžné inhibitory testu (např. muciny ve slinách) a dosáhnout vysoké citlivosti při detekci prionů, které by jinak byly nedetekovatelné nebo jejichž detekce by byla nejednoznačná při použití technik, jako je konverze indukovaná třepáním v reálném čase (RT-QuIC). Tyto pokroky zlepšují detekci prionů u různých onemocnění, čímž se PMCA stává nepostradatelným nástrojem pro výzkum a diagnostiku prionů. Sonikátor pro multi-well plotny UIP400MTP usnadňuje vysokokapacitní PMCA sonikací velkého počtu vzorků v mikroplotnách (např. 6-, 24- nebo 96jamkových plotnách) nebo ve vialkách v stojánku na zkumavky.

Protokol pro vysokokapacitní cyklickou amplifikaci nesprávně složených proteinů (PMCA)

Následující protokol umožňuje efektivní zpracování vysokého počtu vzorků za přesně stejných podmínek pro robustní výsledky výzkumu.

Příprava vzorků

Výchozí materiál:
Vzorky připravte takto:

Resuspendování peletů ze sarkosylové extrakce v substrátu pro PMCA.
Přímé obohacení mozkových homogenátů nebo vzorků krve prionovými zárodky.

Substrát:

Použijte 10% (hmot./obj.) mozkový homogenát připravený z transgenních myší nadměrně exprimujících PrP^C (např. Tg myši).
Mozkovou tkáň homogenizujte v:
– 1× PBS.
– 150 mM NaCl.
– 1% Triton X-100.
Substrát uchovávejte do použití při -80 ºC.

Uspořádání vzorků v mikroplotně nebo zkumavkách:
Zkumavky:

Přidejte 90 μL substrátu z mozkového homogenátu a naočkujte 10 μL vzorku (např. krev, mozkový homogenát nebo sarkosylový pelet).
Do každé zkumavky o objemu 0,2 mL vložte 3 teflonové kuličky (o průměru 1,59 mm nebo 2,38 mm).
Zkumavky umístěte do stojánku kompatibilního se sonikátorem UIP400MTP.

6jamková mikroplotna:

Přidejte 5 mL substrátu z mozkového homogenátu a naočkujte 500 μL vzorku do každé jamky.
Do každé jamky přidejte 3 teflonové kuličky.

Postup PMCA

Umístění:
Stojánek na zkumavky nebo 6jamkovou mikroplotnu umístěte do sonikátoru UIP400MTP podle pokynů výrobce.

Cyklovací program:
Proveďte 144 cyklů PMCA následovně:

Inkubace: 29 minut a 30 sekund při 37 °C.
Sonikace: 30 sekund při 60% amplitudě.
Sledujte teplotu: Pomocí připojitelného teplotního senzoru sledujte teplotu vzorku a naprogramujte UIP400MTP na max. teplotu 48–50 °C.

Následující kola:
Po dokončení prvního kola 144 cyklů přeneste alikvot amplifikovaného materiálu:

Zřeďte 10× ve čerstvém substrátu z mozkového homogenátu transgenní myši.
Pro následující kola proveďte 96 cyklů PMCA se zachováním stejných parametrů sonikace.
Pokračujte požadovaným počtem kol (typicky až 5).

Detekce PrP^Sc

Digesce proteinázou K:
– Vzorky ošetřete proteinázou K (50 μg/mL) při 37 °C po dobu 1 hodiny.
– Digesci ukončete přidáním SDS vzorkovacího pufru a varem po dobu 10 minut.
Analýza metodou Western blot:
– Digerované vzorky analyzujte pomocí:
– anti-PrP protilátek 6H4 nebo PRC1.
– Proveďte SDS-PAGE a přeneste na PVDF membrány pro detekci.

Hielscher UIP400MTP je nejuniverzálnější sonikátor pro vaše vícejamkové destičky, PCR destičky nebo zkumavky se vzorky. Díky nepřetržitému sonikačnímu výkonu 400 wattů je určen pro aplikace, jako jsou lýza buněk, emulgace, extrakce proteinů, fragmentace DNA / RNA, deaglomerace, extrakce ze vzorků FFPE, uvolňování buněk a biofilmů nebo emulgace. UIP400MTP není ultrazvuková lázeň. Jedná se o vysoce intenzivní sonikátor s miskovou sonotrodou pro soustředěnou sonikaci. Tento výkonný bezkontaktní sonikátor zajišťuje rovnoměrnou sonikaci ve všech jamkách standardní mikrotitrační destičky. Umožňuje přesné řízení amplitudy, výkonu a pulzního režimu. Vestavěný časovač a teplotní sonda zajišťují konzistentní výsledky. Destičkový sonikátor UIP400MTP chladí vzorky pomocí vodní lázně (volitelně s externím chladičem).

Zpracujte více vzorků pro robustnější výsledky

Sonikátor pro multi-well plotny UIP400MTP výrazně zvyšuje efektivitu a škálovatelnost cyklické amplifikace nesprávně složených proteinů (PMCA) a řeší tradičně časově náročnou povahu tohoto postupu. Díky možnosti současného zpracování až 96 vzorků v 96jamkové plotně systém zefektivňuje pracovní postupy PMCA při zachování přesných a rovnoměrných podmínek sonikace ve všech jamkách. Tato vysokokapacitní schopnost minimalizuje manuální manipulaci, snižuje počet pracně náročných kroků a zajišťuje reprodukovatelnost, čímž se stává nepostradatelným nástrojem pro výzkum prionů. Ať už se zkoumá chronické chřadnutí nebo Creutzfeldtova-Jakobova nemoc, UIP400MTP usnadňuje rozsáhlé studie s vyšší efektivitou a umožňuje výzkumníkům vyhovět požadavkům moderních diagnostických a vědeckých aplikací.

Související témata

Literatura / Odkazy

FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.

Často kladené otázky

Co jsou priony?

Priony jsou nesprávně složené proteiny schopné vyvolat abnormální složení normálních, buněčných proteinů, zejména v mozku. Na rozdíl od bakterií nebo virů priony neobsahují nukleové kyseliny a šíří se mechanismem sebepředlohování, což vede k progresivním neurodegenerativním onemocněním, jako je Creutzfeldtova-Jakobova nemoc, bovinní spongiformní encefalopatie (nemoc šílených krav) a scrapie u ovcí. Jejich odolnost vůči standardním sterilizačním procesům podtrhuje jejich jedinečnou patogenitu a představuje významné výzvy v medicínském a výzkumném prostředí.

Co je technika PMCA?

Cyklická amplifikace nesprávně složených proteinů (PMCA) je laboratorní technika používaná k amplifikaci nesprávně složených prionových proteinů (PrP^Sc) in vitro. Napodobuje konverzi normálního buněčného prionového proteinu (PrP^C) na jeho nesprávně složenou infekční formu (PrP^Sc), která je charakteristickým znakem prionových onemocnění. Proces zahrnuje cykly inkubace a sonikace k zrychlení agregace PrP^Sc, což z něj činí výkonný nástroj pro detekci nízkých hladin prionů.

Které nesprávné složení proteinu způsobuje Creutzfeldtovu Jakobovu nemoc?

Creutzfeldtova-Jakobova nemoc (CJD) je způsobena nesprávným složením prionového proteinu (PrP). Normální izoforma (PrP^C) přijímá abnormální konformaci bohatou na β-skládané listy (PrP^Sc), která se stává infekční a vytváří v mozku amyloidní agregáty, což vede k neurodegeneraci.

Co je cyklická amplifikace nesprávně složených proteinů infekčních prionů?

Cyklická amplifikace nesprávně složených proteinů (PMCA) je metoda amplifikace infekční formy prionů (PrP^Sc) opakovanou inkubací normálního PrP^C s malým množstvím PrP^Sc. Během každého cyklu PrP^Sc katalyzuje nesprávné složení PrP^C, a sonikace fragmentuje agregáty, čímž vytváří více nukleačních míst. To napodobuje replikaci prionů in vivo a umožňuje citlivou detekci prionů v biologických vzorcích.

Co způsobuje nesprávné složení PrP?

Nesprávné složení PrP do patogenní formy PrP^Sc může být vyvoláno:

Spontánním nesprávným složením u sporadických prionových onemocnění.
Genetickými mutacemi v genu PRNP (např. familiární prionová onemocnění).
Expozicí infekčnímu PrP^Sc prostřednictvím kontaminované potravy, medicínských procedur nebo jinými způsoby.
Environmentálními nebo strukturními faktory, jako je pH, kovové ionty nebo kofaktory, které destabilizují PrP^C.

Co je test RT-QuIC?

Konverze indukovaná třepáním v reálném čase (RT-QuIC) je vysoce citlivý diagnostický test pro prionová onemocnění. Detekuje PrP^Sc amplifikací jeho schopnosti konvertovat rekombinantní PrP^C na nesprávně složené agregáty. Test využívá fluorescenční detekci tvorby amyloidních fibril, což jej činí užitečným pro diagnostiku onemocnění, jako je CJD, v mozkomíšní tekutině (CSF) nebo jiných tkáních.