PMCA pro vysoce výkonnou detekci prionů pomocí UIP400MTP Sonicator

UIP400MTP vícejamkový destičkový sonikátor nabízí výkonné řešení pro vysoce výkonnou přípravu vzorků v cyklické amplifikaci proteinů (PMCA). Tím, že poskytuje rovnoměrnou distribuci energie ve více jamkách a udržuje přesné parametry sonikace, umožňuje tento systém současné zpracování mnoha vzorků s výjimečnou reprodukovatelností. Tyto schopnosti jsou rozhodující pro optimalizaci PMCA pro detekci prionů v nízkých koncentracích v náročných biologických vzorcích, jako jsou sliny, kde inhibitory testu mohou zakrýt výsledky.

Prionová onemocnění, jako je chronické chřadnutí (CWD) u jelenovitých a Creutzfeldt-Jakobova choroba (CJD) u lidí, jsou neurodegenerativní poruchy způsobené chybně složenými prionovými proteiny (PrP^Sc). Tato onemocnění často zahrnují nízké hladiny infekčních prionů v tělesných tekutinách, jako jsou sliny, krev a moč, což komplikuje diagnostiku a výzkum. Horizontální přenos CWD prostřednictvím prionů vylučovaných v environmentálních matricích má zvláště významné důsledky pro management volně žijících živočichů a ekologické zdraví. Podobně u onemocnění, jako je Creutzfeldt-Jakobova choroba, je spolehlivá amplifikace chybně složených prionových proteinů z lidských vzorků zásadní pro pokrok v diagnostice a pochopení progrese onemocnění.

Použití modifikovaného protokolu PMCA umožňuje obejít běžné inhibitory testů (např. muciny ve slinách) a dosáhnout vysoké citlivosti při detekci prionů, které by jinak byly nedetekovatelné nebo nejednoznačné pomocí technik, jako je konverze vyvolaná zemětřesením v reálném čase (RT-QuIC). Tyto pokroky zlepšují detekci prionů u různých onemocnění, díky čemuž je PMCA nepostradatelným nástrojem pro výzkum a diagnostiku prionů. Vícejamkový sonikátor desek UIP400MTP usnadňuje vysoce výkonné PMCA sonikování mnoha vzorků v mikrodestičkách (např. 6-, 24- nebo 96-jamkových destičkách) nebo lahvičkách ve stojánku na zkumavky.

Protokol pro cyklickou amplifikaci chybného skládání proteinů s vysokou propustností (PMCA)

Následující protokol umožňuje efektivní zpracování vysokého počtu vzorků za přesně stejných podmínek pro robustní výsledky výzkumu.

Příprava vzorku

Výchozí materiál:
Připravte vzorky takto:

• Resuspendující extrakční pelety sarkosylu v PMCA substrátu.
• Přímé obohacování mozkových homogenátů nebo krevních vzorků prionovými semeny.

Substrát:

• Použijte 10% (hm/obj.) mozkový homogenát připravený z transgenních myší s nadměrnou expresí PrP^C (např. myši Tg).
• Homogenizovat mozkovou tkáň v:
  – 1× PBS.
  – 150 mM NaCl.
  – 1% Triton X-100.
• Substrát skladujte až do použití při teplotě -80ºC.

Nastavení vzorku v mikrodestičce nebo zkumavkách:
Trubky:

• Přidejte 90 μl substrátu pro homogenát mozku a osivo s 10 μl vzorku (např. krve, homogenátu mozku nebo sarkosylové pelety).
• Do každé 0,2ml zkumavky vložte 3 teflonové kuličky (průměr 1,59 mm nebo 2,38 mm).
• Namontujte trubice do stojanu kompatibilního s UIP400MTP sonikátorem.

6-jamková mikrodestička:

• Přidejte 5 ml substrátu pro homogenát v mozku a osivo s 500 μl vzorku na jamku.
• Do každé jamky přidejte 3 teflonové kuličky.

Postup PMCA

Umístění:
Umístěte stojánek na zkumavky nebo 6-jamkovou mikrodestičku do UIP400MTP sonikátoru podle pokynů výrobce.

Cyklistický program:
Proveďte 144 cyklů PMCA následovně:

• Inkubace: 29 minut a 30 sekund při 37 °C.
• Sonikace: 30 sekund při 60% amplitudě.
• Sledujte teplotu: Pomocí zásuvného teplotního senzoru sledujte teplotu vzorku a naprogramujte UIP400MTP na max. teplota 48–50 °C.

Další kola:
Po dokončení prvního kola 144 cyklů se převede poměrná část amplifikovaného materiálu:

• Zřeďte 10krát na čerstvý transgenní substrát homogenátu myšího mozku.
• Proveďte 96 cyklů PMCA pro následující kola při zachování stejných parametrů sonikace.
• Pokračujte po požadovaný počet kol (obvykle až 5).

Detekce PrP^Sc

1. Trávení proteinázy K:
   – Ošetřete vzorky proteinázou K (50 μg/ml) při 37 °C po dobu 1 hodiny.
   – Trávení se ukončí přidáním SDS-sample pufru a vaří se 10 minut.
2. Western Blot analýza:
   – Analyzujte natrávené vzorky pomocí:
   – 6H4 nebo PRC1 anti-PrP protilátky.
   – Proveďte SDS-PAGE a přeneste na PVDF membrány pro detekci.

 

 

Zpracujte více vzorků pro spolehlivější výsledky

UIP400MTP vícejamkový destičkový sonikátor významně zvyšuje účinnost a škálovatelnost cyklické amplifikace chybného skládání proteinů (PMCA), čímž řeší tradičně časově náročnou povahu postupu. Tím, že umožňuje současné zpracování až 96 vzorků na 96jamkové destičce, systém zefektivňuje pracovní postupy PMCA při zachování přesných a jednotných podmínek sonikace ve všech jamkách. Tato schopnost vysoké propustnosti minimalizuje ruční manipulaci, snižuje pracné kroky a zajišťuje reprodukovatelnost, což z něj činí nepostradatelný nástroj pro výzkum prionů. Ať už se jedná o zkoumání chronického chřadnutí nebo Creutzfeldt-Jakobovy choroby, UIP400MTP usnadňuje rozsáhlé studie s vyšší efektivitou, což umožňuje výzkumníkům splnit požadavky moderních diagnostických a vědeckých aplikací.

---

---

Literatura / Reference

• FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
• De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
• Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
• Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
• Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
• Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.