Vakcine na bazi ćelijskih kultura – efikasna dezintegracija ćelija sonikacijom
Hielscher sonikatori olakšavaju dezintegraciju i solubilizaciju ćelijskih kultura inficiranih virusom (npr. Vero) radi žetve virusa u proizvodnji vakcina. Iskoristite prednosti pouzdane, efikasne lize ćelijskih kultura pomoću visokoučinkovite sonikacije!
Dezintegracija ćelija za žetvu virusa kod vakcina na bazi ćelijskih kultura
Proizvodnja vakcina na bazi ćelijskih kultura, npr. u ćelijskim linijama Vero, MDCK, EB66, CHO ili PER.C6, zahtijeva izdvajanje virusa iz kulture na kraju ciklusa infekcije. Ovisno o virusu, veliki dio prikupljenog virusa vezan je za ćelije, bilo unutar ćelije ili za ćelijsku membranu. Potpuna i nježna žetva stoga ovisi o efikasnoj dezintegraciji i solubilizaciji ćelijske mase. Ultrazvučna liza je pouzdana i odavno uspostavljena metoda za razaranje ćelija i naknadno oslobađanje virusa, virusnih proteina, DNK i RNK. Pri obradi ćelijskih kultura inficiranih virusom, sonikacija – primjena ultrazvuka visokog intenziteta – otvara ćelije, odvaja virusne čestice od membrana i ćelijskog debrisa te homogenizira žetvu u suspenziju niskog viskoziteta koja se može pumpati i koja se može direktno dovesti na bistrenje, centrifugiranje i hromatografiju.
Kako funkcioniše sonikacija?
Ultrazvučna dezintegracija ćelija temelji se isključivo na mehaničkim silama. Akustična kavitacija stvara intenzivno lokalno smicanje i mikrostrujanje koji razaraju ćelijske membrane i potiču prijenos mase između unutrašnjosti ćelije i okolnog medija.
Sistem za ultrazvučnu proizvodnju vakcina: Industrijski sonikator UIP2000hdT s reaktorom od nehrđajućeg čelika
Koje su prednosti ultrazvučne dezintegracije ćelija?
Ovaj radni mehanizam daje sonikaciji odlučujuću prednost u odnosu na hemijsku lizu: nisu potrebni deterdženti, lizozim, proteinaza K niti drugi reagensi za lizu koji mogu promijeniti lizat, ometati naknadno prečišćavanje ili se moraju ukloniti prije daljnje obrade. Enzimska dezintegracija, nasuprot tome, zahtijeva dugo vrijeme inkubacije i često daje neponovljive rezultate. Budući da se intenzitet ultrazvučnog tretmana može tačno prilagoditi biološkom uzorku, izbjegavaju se prekomjerna obrada, degradacija i gubitak prinosa.
Primijenite sonikaciju kako biste:
- dezintegrirali i lizirali ćelije inficirane virusom u adherentnim i suspenzijskim kulturama
- oslobodili intracelularne i s membranom povezane virusne čestice
- solubilizirali ćelijsku masu i smanjili viskozitet žetve
- homogenizirali i deaglomerirali ćelijski debris radi lakšeg bistrenja
- dispergirali nakupine virusa u ujednačenu suspenziju
- inaktivirali patogene pri definiranoj amplitudi, pritisku i vremenu izlaganja
- pojačali korake lize zasnovane na deterdžentima ili enzimima tamo gdje su oni potrebni
Ultrazvučna dezintegracija ćelija u industrijskim razmjerima: Sonikator UIP6000hdT s protočnom ćelijom od nehrđajućeg čelika za kontinuiranu obradu ćelijskih kultura inficiranih virusom.
Sonikator UP400St s protočnom ćelijom FC22K za inline dezintegraciju ćelija
Zašto bih koristio sonikaciju za žetvu virusa?
Dijagram inline obrade monovalentne rasute rotavirusne mase. Rasuta masa obrađena je aseptički direktno iz posude za kulturu (CF-10), prebačena peristaltičkom pumpom kroz protočnu ćeliju sonikatora radi razaranja preostalog ćelijskog debrisa. Sonikacijom obrađena masa zatim je filtracijom pročišćena prije smještanja u posredni spremnik radi stabilizacije.
Studija i slika: Langston et al., 2026.
Prednosti
- precizno podesivo prema procesu
- čista mehanička liza bez hemikalija
- čista i higijenska obrada, protočne ćelije kompatibilne s CIP/SIP
- visoka ponovljivost uz automatsko bilježenje podataka
- linearno povećanje razmjera od laboratorije do proizvodnje
- jednostavan i siguran rad, daljinsko upravljanje putem preglednika
- pouzdana i robusna oprema za rad 24/7
- visoka energetska efikasnost, oko 80–90% od utičnice do tečnosti
Tipična postavka procesa za žetvu virusa
- Žetva i koncentriranje. Izdvojite inficiranu ćelijsku kulturu (kulturni bujon, ostrugane ćelije iz bioreaktora s nepokretnim slojem ili za jednokratnu upotrebu, ili centrifugirani ćelijski talog resuspendiran u puferu).
- Priprema. Podesite pufer, pH i temperaturu. Sonikacija također poboljšava miješanje i otapanje komponenti pufera za lizu ako se koristi korak uz pufer ili deterdžent.
- Ultrazvučna dezintegracija. Provedite suspenziju kroz protočnu ćeliju s omotačem i praćenjem temperature (recirkulacija za šaržni rad, jednokratni ili višekratni prolaz za kontinuiranu inline obradu). Podesite amplitudu i vrijeme zadržavanja na minimum kojim se postiže ciljana stopa dezintegracije, kako bi se virusni antigeni očuvali.
- Opcionalna inaktivacija. Primijenite višu amplitudu, povišen pritisak i duže izlaganje, ili termosonikaciju, za inaktivaciju patogena u skladu sa strategijom vakcine.
- Daljnja obrada. Izbistrite, centrifugirajte i/ili filtrirajte sada niskoviskozni, homogeni lizat, nakon čega slijede hromatografija, koncentriranje i formulacija.
Nakon žetve: formulacija pomoću iste tehnologije
Ista Hielscher platforma koja dezintegrira ćelije obavlja i korake formulacije vakcine. Ultrazvučna disperzija i deaglomeracija stvaraju ujednačene suspenzije antigena, uključujući fragmente ćelija i proteinske antigene, u polimerima ili liposomalnim inkapsulacijama. Adjuvansi na bazi aluminija, kao što je Alhydrogel™, sastoje se od sitnih primarnih čestica koje se lako agregiraju; ultrazvučna disperzija daje homogenu raspodjelu antigena i adjuvansa koja je neophodna za uspješnu integraciju. Hielscher sonikatori se dalje koriste za formulaciju lijekova i vakcina u liposome i nanostrukturirane nosače poput čvrstih lipidnih nanočestica, uz preciznu kontrolu veličine nosača, poboljšano punjenje lijekom i povećanu stabilnost. Degasiranje gotove suspenzije prije punjenja u bočice ili šprice još je jedan standardni ultrazvučni korak.
Više detalja ovdje: Ultrazvuk za proizvodnju vakcina.
Siguran, čist i spreman za reguliranu proizvodnju
- Dijelovi u kontaktu s medijem od titana ili nehrđajućeg čelika, mogu se autoklavirati
- Dostupni su reaktori s protočnom ćelijom kompatibilni s CIP/SIP
- Kućišta od antibakterijske plastike ili nehrđajućeg čelika za instalaciju u čistim prostorijama
- Automatska dokumentacija procesa s otkrivanjem manipulacije na SD/USB kartici
- Kontinuirani rad 24/7, malo održavanja, bez prisilnog hlađenja
- Bez potrošnih kuglica, bez komora za mljevenje, bez unakrsne kontaminacije između šarži
Dizajn, proizvodnja i konsalting – kvalitet napravljen u Njemačkoj
Hielscher ultrazvučni uređaji poznati su po svom najvišem kvalitetu i standardima dizajna. Robusnost i jednostavan rad omogućavaju nesmetano integriranje naših ultrazvučnih uređaja u industrijska postrojenja. Hielscher ultrazvučni uređaji lako se nose s teškim uvjetima i zahtjevnim okruženjima.
Hielscher Ultrasonics je ISO certificirana kompanija i poseban naglasak stavlja na visokoučinkovite ultrazvučne uređaje s najsavremenijom tehnologijom i jednostavnošću korištenja. Naravno, Hielscher ultrazvučni uređaji u skladu su s CE i ispunjavaju zahtjeve UL, CSA i RoHs.
Instalacija 2 uređaja UIP1000hdT (svaki 1kW, 20kHz) za proizvodnju farmaceutskih proizvoda
Često postavljana pitanja o ultrazvučnoj dezintegraciji ćelija za proizvodnju vakcina na bazi virusa
Šta je ultrazvučna dezintegracija ćelija?
Ultrazvučna dezintegracija ćelija koristi ultrazvuk visokog intenziteta, tipično u rasponu od 20 do 30 kHz, da razbije ćelijske membrane i oslobodi intracelularni materijal. Ultrazvučni valovi velike snage stvaraju kavitacijske mjehuriće u tečnosti. Kada ti mjehurići kolabiraju, stvaraju intenzivne lokalne sile smicanja i mikrostrujanje koji mehanički razaraju ćelije i potiču prijenos mase između unutrašnjosti ćelije i okolnog medija. U proizvodnji vakcina ovo se koristi za lizu ćelijskih kultura inficiranih virusom i za oslobađanje intracelularnih i s membranom povezanih virusnih čestica u žetvu.
Zašto koristiti sonikaciju umjesto hemijske ili enzimske lize za žetvu virusa?
Sonikacija radi isključivo s mehaničkim silama. Nisu potrebni deterdženti, lizozim, proteinaza K niti drugi reagensi za lizu koji mogu promijeniti lizat, ometati naknadno prečišćavanje ili se moraju ukloniti prije daljnje obrade. Hemijski reagensi obično zahtijevaju dugotrajnu višestepenu pripremu kako bi se spriječila inhibicija naknadnih analiza i drugih koraka naknadne obrade. Enzimska dezintegracija zahtijeva dugo vrijeme inkubacije i često daje neponovljive rezultate. Ultrazvučna liza također spaja korake resuspendiranja, dezintegracije i ekstrakcije u jednu kontinuiranu operaciju. Tamo gdje vaš proces zahtijeva korak uz deterdžent ili enzim, sonikacija ga pojačava umjesto da ga zamjenjuje: kavitacija slabi membrane i poboljšava ujednačeno izlaganje svih ćelija reagensu.
Kako se sonikacija poredi s metodama mehaničke homogenizacije?
Sonikatori sa sondom prenose ultrazvučnu energiju direktno i efikasno jer je sonotroda u direktnom kontaktu s uzorkom. Tehnike homogenizacije s mehaničkim pogonom često dovode do manje efikasnosti prijenosa energije. Ultrazvučna obrada ne zahtijeva potrošne kuglice za mljevenje niti rotirajuće brtve u toku proizvoda, niti mlaznice ili komore koje se mogu začepiti viskoznom ćelijskom masom, a nema ni unakrsne kontaminacije između šarži.
Može li sonikacija oštetiti virus ili antigen?
Ovo je ključni zadatak optimizacije i on je kontrolisan. Podešavanjem parametara ultrazvučne obrade učinci sonikacije mogu se precizno kontrolisati: niska amplituda i kratka sonikacija imaju vrlo blag učinak, dok visoke amplitude, povišen pritisak i duže trajanje sonikacije dovode do intenzivne obrade. Budući da se intenzitet može tačno prilagoditi biološkom uzorku, izbjegavaju se prekomjerna obrada, degradacija i gubitak prinosa. U praksi se amplituda, vrijeme zadržavanja i broj prolaza podešavaju na minimum kojim se postiže ciljana stopa dezintegracije, uz kontinuirano praćenje temperature i hlađenje.
Smanjuje li ultrazvučni tretman viskozitet žetve?
Da. Guste žetve visoke gustoće ćelija su viskozne i teško se pumpaju zbog oslobođene, nefragmentirane DNK ćelija domaćina. Ultrazvučni tretman smicanjem fragmentira DNK i RNK, solubilizira ćelijsku masu i deaglomerira ćelijski debris. Rezultat je homogena suspenzija pogodna za pumpanje koja efikasnije napaja bistrenje, centrifugiranje i hromatografiju. Fragmentacija DNK i RNK kontrolisanom sonikacijom dobro je utvrđena laboratorijska primjena iste tehnologije.
Mogu li proces voditi u kontinuiranom inline načinu rada?
Da. Hielscher sonikatori projektovani su za kontinuirani rad 24/7 u industrijskom okruženju i mogu se konfigurirati s protočnim ćelijama i reaktorima za kontinuiranu inline sonikaciju, recirkulacijske petlje ili integraciju u proizvodne module i linije za obradu. Mogući su i jednokratni i višekratni prolaz.
Kako da pređem iz laboratorije u proizvodnju?
Linearno, na osnovu mjerljivog unosa energije. Svi rezultati sonikacije dobiveni Hielscher ultrazvučnim homogenizatorom mogu se linearno povećati na veće protoke u industrijskoj proizvodnji; parametri sonikacije razvijeni sa stolnim sonikatorom mogu se direktno prenijeti na veće Hielscher sisteme. Kriterij povećanja razmjera je specifični unos energije po jedinici zapremine, zajedno s amplitudom, vremenom zadržavanja i temperaturom. Hielscher procesno savjetovanje uključuje preporuke za optimizaciju parametara (amplituda, specifična energija E/V, vrijeme zadržavanja, kontrola temperature i pritiska) vezane za mjerljivi unos energije.
Je li ultrazvučna dezintegracija ćelija prikladna za čiste prostorije i proizvodnju u stilu GMP?
Hielscher ultrazvučni uređaji mogu se lako instalirati u laboratorijima i proizvodnim pogonima s čistim prostorijama. Kućišta su izrađena od antibakterijske plastike ili nehrđajućeg čelika. Svi dijelovi u kontaktu s medijem, kao što su sonotrode i protočne ćelije, izrađeni su od titana ili nehrđajućeg čelika i mogu se autoklavirati. Dostupni su posebni reaktori s protočnom ćelijom koji ispunjavaju napredne zahtjeve CIP (čišćenje na mjestu) i SIP (sterilizacija na mjestu). Pretvarač industrijske UIP serije ima stepen zaštite IP64 i može se instalirati u zahtjevnim okruženjima dok je generator postavljen daljinski. Budući da Hielscher sonikatori pretvaraju električnu energiju u mehaničke oscilacije s vrlo visokom efikasnošću od otprilike 80–90% od utičnice do tečnosti, pretvarač se može ugraditi u zatvorena kućišta bez žaluzina, a nije potrebno ni prisilno hlađenje, poput komprimiranog zraka ili vode. To također znači da rashladni medij ne dolazi u kontakt s procesom. Automatska dokumentacija procesa podržava sljedivost i ponovljivost u reguliranoj proizvodnji.
Može li sonikacija također inaktivirati virus za inaktiviranu vakcinu?
Da. Ultrazvuk velike snage nalazi primjenu u inaktivaciji patogena poput bakterija i virusa. Uz odgovarajuću dozu i intenzitet sonikacije, ćelije i mikrobi mogu se tretirati u skladu s ciljem procesa, tako da ista platforma služi za lizu pri žetvi i za inaktivaciju. Kombinacija sonikacije i toplote, poznata kao termosonikacija, nudi bržu stopu sterilizacije uz znatno smanjen termički intenzitet i trajanje, što je prednost za očuvanje termoosjetljivih spojeva poput proteina i antigena. Ultrazvučna inaktivacija se obično koristi u kombinaciji s uspostavljenom hemijom inaktivacije, a puna kinetika inaktivacije mora biti validirana za svaki pojedinačni virus.
Može li se isti sistem koristiti za korake formulacije nakon žetve?
Da. Ista platforma obavlja disperziju antigena u suspenzije, polimere ili liposomalne inkapsulacije, deaglomeraciju i ujednačenu raspodjelu antigena i adjuvansa na bazi aluminija poput Alhydrogel™, formulaciju vakcina u liposome i čvrste lipidne nanočestice uz preciznu kontrolu veličine nosača, kao i korak degasiranja prije punjenja u bočice ili šprice.
Literatura / reference
- Langston J. W.; Carroll M.; Whalen M. M.; Jaw, T. M.; Rojas L. V.; Hertel C. C.; Gote V., Balasundaram W.; Serbzhinzhskiy D.; Kapre S.; Olave, I. A. (2026): Novel non-aqueous rotavirus vaccine: Formulated for thermostability and easy administration. Human Vaccines & Immunotherapeutics, 22(1), 2026.
- Mohsen, M.O., Rothen, D., Balke, I. et al. (2021): Neutralization of MERS coronavirus through a scalable nanoparticle vaccine. npj Vaccines 6, 107 (2021).
- Mohsen M.O., Balke I., Zinkhan S. et al. (2022): A scalable and highly immunogenic virus-like particle-based vaccine against SARS-CoV-2. Allergy Vol 77, Issue 1; 2022. 243–257.
- Brittney Mott; Sanjay Thamake; Jamboor Vishwanatha; Harlan P. Jones (2013): Intranasal delivery of nanoparticle-based vaccine increases protection against S. pneumoniae. J Nanopart Res (2013) 15:1646.
Hielscher Ultrasonics proizvodi visokoučinkovite ultrazvučne homogenizatore od laboratorijske do industrijske veličine.