Lizis üçün sonikasiya: Hüceyrələrin pozulması və çıxarılması

Hüceyrə parçalanması və ya lizisi biotexnoloji laboratoriyalarda gündəlik nümunənin hazırlanmasının ümumi hissəsidir. Lizisin məqsədi bioloji molekulları buraxmaq üçün hüceyrə divarının hissələrini və ya tam hüceyrəni pozmaqdır. Ultrasəs homojenizatorları uğurlu hüceyrə lizisi üçün geniş istifadə olunur. Mürəkkəb ultrasəs aparatlarının əsas üstünlüyü intensivlik və temperatur kimi proses parametrlərinə dəqiq nəzarətdir ki, bu da hüceyrənin yumşaq, lakin yüksək effektiv şəkildə pozulmasına və çıxarılmasına imkan verir.

Ultrasəs istifadə edərək hüceyrə lizisi

Ultrasonik hüceyrə parçalanması və çıxarılması yüksək tezlikli səs dalğalarından, yəni ultrasəsdən istifadə edərək açıq hüceyrələri sındırmaq və içindəkiləri çıxarmaq üçün istifadə edilən bir üsuldur. Sonikasiya, hüceyrənin parçalanması və hüceyrədaxili materialın çıxarılmasının müəyyən edilmiş və etibarlı üsulları kimi geniş istifadə olunan bir liziz üsuludur. Ultrasəs lizis, məsələn, plazmid, reseptor analizləri, zülallar, DNT, RNT və s. ehtiva edən lizat hazırlamaq üçün etibarlı bir texnikadır. Ultrasəs intensivliyi proses parametrlərini tənzimləməklə düzəldilə bildiyi üçün, çox yumşaqdan intensivə qədər optimal sonikasiya intensivliyi fərdi olaraq təyin edilə bilər. xüsusi tətbiq tələblərinə cavab vermək üçün hər bir maddə və mühit. Lizisin sonrakı mərhələləri fraksiyalaşdırma, orqanellərin izolyasiyası və/və ya zülalın çıxarılması və təmizlənməsidir. Çıxarılan material (= lizat) ayrılmalıdır və əlavə araşdırmalara və ya tətbiqlərə, məsələn, proteomik tədqiqatlara məruz qalır.

Digər hüceyrə lizisi və ekstraksiya üsulları ilə müqayisədə ultrasəs hüceyrə lizisi bir sıra üstünlüklərə malikdir:

1. Sürət: Ultrasonik hüceyrə lizisi və çıxarılması bir neçə saniyə ərzində açıq hüceyrələri qıra bilən sürətli bir üsuldur. Bu, homogenləşdirmə, dondurma və ya muncuq frezeleme kimi digər üsullardan çox daha sürətlidir.
2. səmərəlilik: Ultrasəs hüceyrə lizisi və çıxarılması kiçik, böyük və ya çoxlu nümunələri bir anda müalicə etmək üçün istifadə edilə bilər ki, bu da kiçik nümunələrin fərdi işlənməsini tələb edən digər üsullardan daha səmərəlidir.
3. Kimyəvi tərkibsiz: Ultrasonik hüceyrə lizisi və çıxarılması sərt kimyəvi maddələrin və ya fermentlərin istifadəsini tələb etməyən qeyri-invaziv bir üsuldur. Bu, onu hüceyrə məzmununun bütövlüyünün qorunub saxlanılması lazım olan tətbiqlər üçün ideal hala gətirir. Nümunələrin arzuolunmaz çirklənməsinin qarşısını almaq olar.
4. Yüksək produktivlik: Ultrasonik hüceyrə lizisi və çıxarılması DNT, RNT və zülallar da daxil olmaqla yüksək məhsuldar hüceyrə məzmununu çıxara bilər. Bunun səbəbi yüksək tezlikli səs dalğalarının hüceyrə divarlarını qıraraq ətrafdakı məhlulun içinə buraxmasıdır.
5. Temperatur nəzarət: Mürəkkəb ultrasəs cihazları nümunənin temperaturunu dəqiq idarə etməyə imkan verir. Hielscher rəqəmsal ultrasəs qoşula bilən temperatur sensoru və temperatur monitorinqi proqramı ilə təchiz edilmişdir.
6. Təkrarlana bilən: Ultrasəs hüceyrə lizisi üçün protokollar asanlıqla çoxaldıla bilər və hətta sadə xətti miqyaslı böyütmə ilə müxtəlif daha böyük və ya daha kiçik nümunə həcmlərinə uyğunlaşdırıla bilər.
7. Çox yönlü: Ultrasonik hüceyrə lizisi və ekstraksiyası bakteriya, maya, göbələk, bitki və məməli hüceyrələri də daxil olmaqla geniş çeşidli hüceyrə növlərini çıxarmaq üçün istifadə edilə bilər. O, həmçinin zülallar, DNT, RNT və lipidlər də daxil olmaqla müxtəlif növ molekulları çıxarmaq üçün istifadə edilə bilər.
8. Çoxsaylı nümunələrin eyni vaxtda hazırlanması: Hielscher Ultrasonics eyni proses şərtləri altında çoxsaylı nümunələri rahat şəkildə emal etmək üçün bir neçə həll təklif edir. Bu, lizis və ekstraksiya nümunəsinin hazırlanması mərhələsini yüksək səmərəli və vaxta qənaət edir.
9. İstifadəsi asan: Ultrasəs hüceyrə lizisi və ekstraksiya avadanlığından istifadə etmək asandır və minimal təlim tələb edir. Avadanlıq həm də qənaətcildir, çünki o, təkrar satınalma tələb olunmayan tək investisiyadır. Bu, onu geniş tədqiqatçılar və laboratoriyalar üçün cəlbedici edir.

Ümumiyyətlə, ultrasəs hüceyrə lizisi və çıxarılması hüceyrə məzmununu çıxarmaq üçün sürətli, səmərəli, dəqiq idarə olunan və çox yönlü bir üsuldur. Alternativ üsullarla müqayisədə üstünlükləri onu geniş tədqiqat və sənaye tətbiqləri üçün cəlbedici seçim edir.

Ultrasonik Hüceyrə Lizisinin İş Prinsipi

Ultrasəs hüceyrə lizisi və çıxarılması hüceyrələri pozmaq və onların məzmununu çıxarmaq üçün yüksək tezlikli səs dalğalarından istifadə edir. Səs dalğaları ətrafdakı mayedə təzyiq dəyişiklikləri yaradır, kiçik baloncukların əmələ gəlməsinə və kavitasiya kimi tanınan prosesdə çökməsinə səbəb olur. Bu qabarcıqlar açıq hüceyrələri sındıra və onların məzmununu ətrafdakı məhlula buraxa bilən lokallaşdırılmış yüksək intensiv mexaniki qüvvələr yaradır.

Bir ultrasəs cihazı istifadə edərək hüceyrə lizisi adətən aşağıdakı addımları əhatə edir:

• Nümunə maye tamponu olan bir boruya və ya konteynerə yerləşdirilir.
• Nümunəyə ultrasəs zondu və təqribən yüksək tezlikli səs dalğaları daxil edilir. 20-30 kHz tətbiq olunur.
• Ultrasəs dalğaları ətrafdakı mayedə salınım və kavitasiyaya səbəb olur, açıq hüceyrələri qıran və onların məzmununu buraxan lokallaşdırılmış qüvvələr yaradır.
• Nümunə hər hansı hüceyrə zibilini çıxarmaq üçün sentrifuqalanır və ya süzülür və çıxarılan məzmun aşağı axın analizi üçün toplanır.

Güclü ultrasəs dalğaları bioloji strukturların hüceyrə matrisini pozur və bioaktiv birləşmələri buraxır. Bitki materialı ilə həlledici (məsələn, tampon) arasında kütlə ötürülməsi güclənir. (qrafik: ©Vilkhu et al., 2006)

Ümumi Lizis Metodlarının Dezavantajları

Laboratoriyalarda işlədiyiniz müddətdə ənənəvi mexaniki və ya kimyəvi lizis protokollarından istifadə edərək hüceyrə lizisi problemini artıq yaşamış ola bilərsiniz.

• Mexanik parçalanma: Mexaniki lizis üsulları, məsələn, havan və havan ilə üyütmə və ya fransız presi, muncuq dəyirmanı və ya rotor-stator sistemindən istifadə edərək homogenləşdirmə çox vaxt dəqiq nəzarət və tənzimləmə seçimlərindən məhrumdur. Bu o deməkdir ki, frezeləmə və üyütmə üsulu tez bir zamanda nümunəyə zərər verə bilən və zülalları denatürasiya edə bilən istilik və kəsmə qüvvələri yarada bilər. Onlar həmçinin vaxt apara bilər və böyük miqdarda başlanğıc material tələb edə bilər.
• Kimyəvi liziz: Kimyəvi lizis üsulları, məsələn, yuyucu vasitələrə əsaslanan lizis, lipid iki qatını pozaraq və zülalları denaturasiya edərək nümunəyə zərər verə bilər. Onlar həmçinin bir neçə addım tələb edə bilər və aşağı axın tətbiqlərinə mane olan qalıq çirkləndiriciləri tərk edə bilər. Yuyucu vasitənin optimal dozasını tapmaq əlavə problemdir.
• Dondurma-ərimə dövrləri: Dondurma-ərimə dövrləri hüceyrə membranlarının qırılmasına səbəb ola bilər, lakin təkrar dövrlər də zülalın denatürasiyasına və deqradasiyasına səbəb ola bilər. Bu üsul həm də bir neçə dövrə tələb edə bilər ki, bu da vaxt apara bilər və tez-tez aşağı məhsuldarlıqla nəticələnir.
• Enzimatik lizis: Enzimatik lizis üsulları müəyyən hüceyrə növlərinə xas ola bilər və bir neçə addım tələb edir, bu da onları vaxt aparan edir. Onlar həmçinin tullantı yaradır və nümunənin deqradasiyasının qarşısını almaq üçün diqqətli optimallaşdırma tələb edir. Enzimatik lizis dəstləri çox vaxt bahadır. Mövcud enzimatik lizis prosedurunuz qeyri-kafi nəticələr verirsə, hüceyrənin pozulmasını gücləndirmək üçün sinergik metod kimi sonikasiya tətbiq oluna bilər.

Adi mexaniki və kimyəvi hüceyrə lizis üsullarından fərqli olaraq, sonication sonikasiya parametrləri üzərində tam nəzarət etməyə imkan verən hüceyrə parçalanması üçün çox səmərəli və etibarlı bir vasitədir. Bu, materialların buraxılması və məhsulun saflığı üzrə yüksək seçiciliyi təmin edir. [müq. Balasundaram və başqaları, 2009]
Bütün hüceyrə tiplərinə uyğundur və kiçik və böyük miqyasda asanlıqla tətbiq olunur – həmişə nəzarət altında olan şəraitdə. Ultrasonikatorları təmizləmək asandır. Ultrasəs homojenizatoru həmişə təmiz yerində (CIP) və yerində sterilizasiya (SIP) funksiyasına malikdir. Sonotrode, suda və ya həlledicidə (iş mühitindən asılı olaraq) silinə və ya yuyula bilən böyük bir titan buynuzundan ibarətdir. Ultrasonicators saxlanılması demək olar ki, laqeyd onların möhkəmlik bağlıdır.

Ultrasonik lizis və hüceyrə pozulması

Ümumiyyətlə, laboratoriyada nümunələrin ləğv edilməsi 15 saniyə ilə 2 dəqiqə arasında aparılacaqdır. Sonication intensivliyi amplituda bir sonikasiya müddəti və doğru avadanlıq seçilməsi ilə tənzimləmək üçün çox asandır, çünki hüceyrə strukturuna və lizis məqsədinə görə hüceyrə membranlarını çox yumşaq və ya çox ani bir şəkildə pozmaq mümkündür ( məsələn, DNT hasilatı daha yumşaq sonikasiya tələb edir, bakteriyaların tam protein çıxarılması daha sıx bir ultrasəs müalicəsi tələb edir). Proses zamanı temperatur bir inteqrasiya temperatur sensoru ilə izlənə və asanlıqla soyutma (buzlu hamam və soyuducu gödəkcikli axın hüceyrələri) və ya pulsed rejimdə sonikasiya ilə nəzarət edilə bilər. Pulse-rejimi sonication zamanı, 1-15 saniyəlik qısa sonication burst dövrü, daha uzun aralıklı dövrlərdə istilik yayılması və soyutma üçün imkan verir.
Bütün ultrasəs idarə prosesləri tamamilə reproducible və xətti genişlənən edir.

Hüceyrə lizisi və çıxarılması üçün ultrasəs homojenizatorları

Müxtəlif növ ultrasəs cihazları nümunə hazırlamaq məqsədinə uyğun gəlməyə və istifadəçinin rahatlığını və əməliyyat rahatlığını təmin etməyə imkan verir. Prob tipli ultrasəs cihazları laboratoriyada ən çox yayılmış cihazlardır. Onlar həcmi 0,1 ml-dən 1000 ml-ə qədər olan kiçik və orta ölçülü nümunələrin hazırlanması üçün ən uyğundur. Müxtəlif güc ölçüləri və sonotrodlar ultrasonikatoru nümunə həcminə və ən effektiv və səmərəli sonikləşdirmə nəticələrinə görə gəmiyə uyğunlaşdırmağa imkan verir. Ultrasəs zond cihazı tək nümunələr hazırlanmalı olduqda ən yaxşı seçimdir.

Daha çox nümunə hazırlamaq lazımdırsa, məsələn, 8-10 flakon hüceyrə məhlulu, VialTweeter və ya ultrasəs kuboku kimi ultrasəs sistemləri ilə intensiv dolayı sonikasiya effektiv lizis üçün ən uyğun homojenləşdirmə üsuludur. Bir neçə flakon eyni vaxtda, eyni intensivlikdə səslənir. Bu, nəinki vaxta qənaət edir, həm də bütün nümunələrin eyni işlənməsini təmin edir ki, bu da nümunələr arasında nəticələri etibarlı və müqayisə edilə bilən edir. Bundan əlavə, ultrasəs sonotrodu (həmçinin ultrasəs zond, buynuz, uc və ya barmaq kimi tanınır) batırmaqla dolayı sonikasiya zamanı çarpaz çirklənmənin qarşısı alınır. Ayrı-ayrılıqda nümunə ölçüsünə uyğun flakonlar istifadə edildiyi üçün, vaxt aparan təmizləmə və qabların boşaldılması nəticəsində nümunə itkisi nəzərə alınmır. Multiwell və ya mikrotiter plitələrin vahid sonikasiyası üçün Hielscher UIP400MTP təklif edir.
ali həcmdə, məsələn mobil çıxarışların kommersiya istehsalı üçün, bir axın mobil reaktoru ilə fasiləsiz ultrasəs sistemləri ən uygundur. emal material davamlı və hətta axını daha sonication təmin edir. ultrasəs dağılma prosesinin bütün parametrləri optimize və tətbiqi və xüsusi mobil material tələblərinə düzəlişlər edilə bilər.
 
 
bakterial hüceyrələri ultrasəs təsviri üçün nümunəvi qaydası:

• mobil dayandırılması hazırlanması: Cell qranullar tamamilə (aşağıdakı analiz, məsələn xüsusi xromatoqrafiya üsulu ilə uyğun sizin bufer həll seçin) homogenizing bir bufer həll dayandırılıb olmalıdır. lazım gələrsə lysozymes və / və ya digər əlavələri əlavə, (onlar ayrılması / təmizləyici vasitələrlə də uyğun olmalıdır). / Mix tam dayandırılması əldə qədər mülayim sonication altında yumşaq həll homogenize.
• Ultrasonik lizisi: buz vanna nümunə qoyun. mobil pozulması üçün (sizin ultrasonicator nin pulse rejimi istifadə edərək,) 60-90 ikinci bursts da dayandırılması sonicate.
• (. Məsələn 10 min 10,000 x g; 4degC at): Separation Centrifuge lysate. diqqətlə mobil kürəcik olan supernatant ayırın. supernatant ümumi hüceyrə lysate edir. supernatant süzülmə sonra, həll mobil protein aydınlıq maye almaq.

 
 
biologiya və biotexnologiya ultrasonicators üçün ən ümumi applications var:

• Cell çıxarış hazırlanması
• Mayanın, bakteriyaların, bitki hüceyrələrinin, yumşaq və ya sərt hüceyrə toxumasının, nuklein materialın pozulması
• zülal hasilatı
• Hazırlanması və fermentlərin təcrid
• antigenləri istehsalı
• və / və ya hədəf parçalanma DNA hasilatı
• liposom hazırlanması