Sonikasiya lizisi: Hüceyrələrin pozulması və çıxarılması

Cell ayrışması və ya liziz biotexniki laboratoriyalarda gündəlik nümunə hazırlığının ümumi bir hissəsidir. Lizəyin məqsədi bioloji molekulların sərbəst buraxılması üçün hüceyrə divarının və ya tam hüceyrənin parçalanmasını pozmaqdır. Sözdə lizat məsələn plazmid, reseptor testləri, proteinlər, DNT, RNK və s. Ibarətdir. Lizisin aşağıdakı addımları fraksiya, organelle izolyasiya və ya protein çıxarılması və təmizlənməsidır. Ekstraksiya olunan material (= lizat) ayrılmalıdır və proteomik tədqiqatlar üçün, məsələn, daha çox istintaq və ya tətbiqlərə tabedir. Ultrasonik homogenizatorlar müvəffəqiyyətli hüceyrəli liziz üçün ümumi bir vasitədir. Proses parametrlərini düzəldərək ultrasəs intensivliyi düzəldilə biləcəyi üçün, çox yumşaqdan çox ağırlığa qədər optimal sonikasiya intensivliyi hər bir maddə və mühit üçün fərdi tətbiq tələbinə cavab vermək üçün fərdi olaraq təyin edilə bilər.

Cell strukturu

Cells bir phospho-lipid ikiqatlı (həmçinin protein-lipid ikiqatlı, hidrofob lipid və əlaqədar zülal molekulları ilə hydrophilic fosfor molekulları ilə formalaşır) ibarət olan yarı keçirici plazma membran qorunur və mobil daxili arasında bir sədd (cytoplasm) yaradır və extracellular mühit. Plant hüceyrələri və prokariot hüceyrələrin mobil divar ilə əhatə olunur. Due neçə qat sellüloza qalın mobil divar, bitki hüceyrələri heyvan hüceyrələri daha Lyse zordur. Belə orqanoidləri, nüvə, mitoxondri kimi mobil daxili, cytoskeleton ilə sabitləşib.
hüceyrələri təsviri, bu çıxarılması və orqanoid, zülal, DNT, mRNA və ya digər biomolecules ayıran yönəlmişdir.

Bitki hüceyrələrindən ultrasəs çıxarılması: mikroskopik transvers bölmə (TS) hüceyrələrdən ultrasonik ekstraksiya zamanı tədbirlərin mexanizmini göstərir (büyütme 2000x) [kaynak: Vilkhu et al. 2011]

üsulları

yuyucu və ya həlledicilər istifadə, yüksək təzyiq tətbiqi və ya bead dəyirman və ya bir Fransız mətbuat istifadə daxildir mexaniki və kimyəvi üsullarla, bölünə bilər hüceyrələri lysate üçün bir neçə üsulları var. Bu üsulların ən problemli əlverişsiz çətin nəzarət və proses parametrlərinin tənzimlənməsi və bununla da təsir edir.
ümumi lizisi üsulları əsas mənfi cəhətləri:

Cədvəl: mobil lizisi ənənəvi üsulları əsas mənfi cəhətləri var

Əksinə, sonication sonication parametrləri üzərində tam nəzarət üçün imkan verir mobil dağılması üçün çox səmərəli və etibarlı vasitədir. Bu materiallar azad və təmizlik yüksək selektivlik təmin edir. [Balasundaram et al. 2009] Bu, bütün mobil növ uyğun və kiçik və böyük miqyasda asanlıqla tətbiq edilir. Ultrasonicators təmiz asandır. Bir ultrasəs homogenizer həmişə təmiz-in-yer (İSP) və sterilizə-in-yer (SIP) funksiyası edir. sonotrode silinmiş və ya (iş orta asılı olaraq) su və ya solvent ilə flushed edilə bilər bir böyük titan buynuz ibarətdir. ultrasonicators saxlanılması demək olar ki, neglectable onların sağlamlığına ilə bağlıdır.

lizisi

Lizisi həssas prosesdir. lizisi zamanı mobil membran qorunması bir unphysiological mühitdə (pH dəyərinin sapma) tərəfindən hasil zülalların lakin ləğvi, denaturation və deqradasiyası qarşısı alınmalıdır, məhv edilir. Buna görə də, ümumi lizisi bir bufer həll həyata keçirilir. Ən çətinliklər bütün hüceyrədaxili maddi və / və ya hədəf məhsulun denaturation bir hədəfsiz azad nəticəsində nəzarətsiz hüceyrə pozulması yaranır.

Ultrasonik lizisi

Ümumiyyətlə, laboratoriyada nümunələrin ləğv edilməsi 15 saniyə ilə 2 dəqiqə arasında aparılacaqdır. Sonication intensivliyi amplituda bir sonikasiya müddəti və doğru avadanlıq seçilməsi ilə tənzimləmək üçün çox asandır, çünki hüceyrə strukturuna və lizis məqsədinə görə hüceyrə membranlarını çox yumşaq və ya çox ani bir şəkildə pozmaq mümkündür ( məsələn, DNT hasilatı daha yumşaq sonikasiya tələb edir, bakteriyaların tam protein çıxarılması daha sıx bir ultrasəs müalicəsi tələb edir). Proses zamanı temperatur bir inteqrasiya temperatur sensoru ilə izlənə və asanlıqla soyutma (buzlu hamam və soyuducu gödəkcikli axın hüceyrələri) və ya pulsed rejimdə sonikasiya ilə nəzarət edilə bilər. Pulse-rejimi sonication zamanı, 1-15 saniyəlik qısa sonication burst dövrü, daha uzun aralıklı dövrlərdə istilik yayılması və soyutma üçün imkan verir.
Bütün ultrasəs idarə prosesləri tamamilə reproducible və xətti genişlənən edir.

Ultrasonik Homogenizers

müxtəlif növ Ultrasonik Cihazlar nümunə hazırlanması məqsədə uyğun imkan və istifadəçi dostu və əməliyyat rahatlıq təmin etmək üçün. Probe tipli ultrasonicators laboratoriya ən ümumi cihazlardır. Onlar 1000ml qədər 0.1mL həcmi kiçik və orta ölçülü nümunələri hazırlanması üçün ən uyğun. Müxtəlif güc ölçü və sonotrodes nümunə həcmi və ən effektiv və səmərəli sonicating nəticələr üçün gəmi ultrasonicator uyğunlaşmağa imkan verir. tək nümunələri hazırlanır zaman ultrasəs probe cihaz ən yaxşı seçimdir.

Daha çox nümunə hazırlanmalıdırsa, məsələn, 8 ədəd hüceyrə çözeltisi, VialTweeter və ya ultrasonik kabin kimi qurğular liziz üçün ən uyğun homogenizatorlardır. Bir neçə flakon eyni zamanda, eyni sıxlıqla sonicated olunur. Bu, sadəcə vaxt deyil, həm də nümunələr arasında etibarlı və müqayisə edilə bilən nəticələr verən bütün nümunələrin eyni müalicəsini təmin edir. Bundan əlavə, ultrasonik sonotrode (ultrasəs probu, buynuz, ucu və ya barmaq kimi tanınan) batıraraq çirklənmiş çirklənmələrdən çəkinir. Tüpürcələrdən istifadə edildikdən sonra, gəmilərin boşaldılmasına görə vaxt aparan təmizlənmə və nümunə itkisi nəzərə alınmır.
ali həcmdə, məsələn mobil çıxarışların kommersiya istehsalı üçün, bir axın mobil reaktoru ilə fasiləsiz ultrasəs sistemləri ən uygundur. emal material davamlı və hətta axını daha sonication təmin edir. ultrasəs dağılma prosesinin bütün parametrləri optimize və tətbiqi və xüsusi mobil material tələblərinə düzəlişlər edilə bilər.
bakterial hüceyrələri ultrasəs təsviri üçün nümunəvi qaydası:

• mobil dayandırılması hazırlanması: Cell qranullar tamamilə (aşağıdakı analiz, məsələn xüsusi xromatoqrafiya üsulu ilə uyğun sizin bufer həll seçin) homogenizing bir bufer həll dayandırılıb olmalıdır. lazım gələrsə lysozymes və / və ya digər əlavələri əlavə, (onlar ayrılması / təmizləyici vasitələrlə də uyğun olmalıdır). / Mix tam dayandırılması əldə qədər mülayim sonication altında yumşaq həll homogenize.
• Ultrasonik lizisi: buz vanna nümunə qoyun. mobil pozulması üçün (sizin ultrasonicator nin pulse rejimi istifadə edərək,) 60-90 ikinci bursts da dayandırılması sonicate.
• (. Məsələn 10 min 10,000 x g; 4degC at): Separation Centrifuge lysate. diqqətlə mobil kürəcik olan supernatant ayırın. supernatant ümumi hüceyrə lysate edir. supernatant süzülmə sonra, həll mobil protein aydınlıq maye almaq.

biologiya və biotexnologiya ultrasonicators üçün ən ümumi applications var:

• Cell çıxarış hazırlanması
• Mayanın, bakteriyaların, bitki hüceyrələrinin, yumşaq və ya sərt hüceyrə toxumasının, nuklein materialın pozulması
• zülal hasilatı
• Hazırlanması və fermentlərin təcrid
• antigenləri istehsalı
• və / və ya hədəf parçalanma DNA hasilatı
• liposom hazırlanması