Sonication cho ly giải tế bào: Phá vỡ tế bào và chiết xuất
Phá vỡ tế bào bằng sóng siêu âm là một kỹ thuật chuẩn bị mẫu được ứng dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm sinh học hiện đại. Mục đích chính của kỹ thuật này là phá vỡ màng tế bào hoặc toàn bộ tế bào để giải phóng các thành phần nội bào như protein, axit nucleic hoặc các bào quan. Trong công việc hàng ngày tại phòng thí nghiệm, điều này có nghĩa là siêu âm là phương pháp tiêu chuẩn để phá vỡ tế bào một cách có kiểm soát và chiết xuất hiệu quả các biomolecule. Ưu điểm chính của các thiết bị siêu âm nằm ở khả năng điều chỉnh chính xác các thông số quá trình quan trọng, bao gồm cường độ siêu âm, tần số xung và kiểm soát nhiệt độ. Sự kiểm soát này cho phép các nhà nghiên cứu đạt được quá trình phá vỡ tế bào đáng tin cậy đồng thời giảm thiểu tổn thương nhiệt hoặc cơ học đối với các biomolecule nhạy cảm, từ đó mang lại quá trình chiết xuất nhẹ nhàng nhưng vô cùng hiệu quả.
Phá vỡ tế bào bằng máy siêu âm
Phá vỡ tế bào bằng siêu âm sử dụng hiện tượng cavitation âm thanh để phá vỡ màng tế bào và giải phóng các phân tử nội bào. Hielscher Ultrasonics cung cấp máy siêu âm dạng đầu dò truyền thống cũng như máy siêu âm đa mẫu cho quá trình xử lý vô trùng: VialTweeter cho nhiều ống và lọ, và máy siêu âm cho đĩa 96 giếng UIP400MTP cho đĩa vi thể tiêu chuẩn.
Hielscher Ultrasonics cung cấp sonicators không tiếp xúc mạnh mẽ để chuẩn bị mẫu và phân tích lâm sàng. Máy siêu âm tấm đa giếng UIP400MTP, The VialTweeter, CupHorn và máy siêu âm dòng GDmini2 Xử lý các mẫu trong điều kiện vô trùng.
Máy đồng nhất siêu âm UP100H (100 watt) và UP400St (400 watt): Sonication để ly giải và chiết xuất tế bào.
Máy đồng nhất siêu âm để ly giải và chiết xuất tế bào
| Loại thiết bị siêu âm | Tập trung vào ứng dụng | Khối lượng mẫu | Trường hợp sử dụng điển hình | Lợi thế | Mẫu ví dụ |
|---|---|---|---|---|---|
| Sonicators loại đầu dò | Siêu âm đơn mẫu | 00,1 mL đến ~1.000 mL | Phá vỡ tế bào, chiết xuất protein, phân mảnh DNA/RNA | Điều khiển năng lượng chính xác; nhiều loại sonotrode; lý tưởng cho mẫu có kích thước nhỏ đến trung bình. | UP100H, UP200St, UP400ST |
| VialTweeter / Cốc Loa | Xử lý song song nhiều ống nghiệm đã được niêm phong | 8–10 lọ (~1–20 mL mỗi lọ) | Phá vỡ tế bào theo tiêu chuẩn cho nhiều hỗn hợp tế bào | Sonication đồng nhất; tránh nhiễm chéo; kết quả tái hiện được. | LọTweeter, Cuphorn |
| Máy siêu âm cho đĩa 96 giếng | Sonication của các đĩa đa giếng và đĩa vi giếng | Định dạng microplate | Màn hình sàng lọc quy mô lớn, phân tích protein, thử nghiệm tế bào | Siêu âm đồng thời, đều đặn trên tất cả các giếng; lý tưởng cho các quy trình làm việc với nhiều mẫu. | UIP400MTP |
| lò phản ứng tế bào dòng chảy | Sonication liên tục cho thể tích lớn hơn | >1 lít, có thể mở rộng | Phá vỡ tế bào quy mô công nghiệp, sản xuất chiết xuất | Xử lý liên tục; có khả năng mở rộng; kiểm soát toàn bộ quá trình (độ lớn, áp suất, nhiệt độ) | UIP1000hdt, UIP2000hdT + buồng dòng |
| Hệ thống siêu âm vô trùng / gián tiếp | Xử lý mẫu không bị nhiễm bẩn | Phụ thuộc vào ống nghiệm/ống/bảng vi giếng | Mẫu nhạy cảm, môi trường vô trùng, các quy định pháp lý. | Không tiếp xúc với đầu dò; tránh lây nhiễm chéo; nỗ lực vệ sinh tối thiểu. | LọTweeter, Cuphorn, UIP400MTP |
Ưu điểm của việc sử dụng Sonication để ly giải tế bào
So với các phương pháp ly giải tế bào và chiết xuất khác, ly giải tế bào siêu âm có một số ưu điểm:
- Tốc độ: Ly giải và chiết xuất tế bào siêu âm là một phương pháp nhanh chóng có thể phá vỡ các tế bào mở chỉ trong vài giây. Điều này nhanh hơn nhiều so với các phương pháp khác như đồng nhất, đông lạnh hoặc xay hạt.
- Hiệu quả: Phân giải và chiết xuất tế bào siêu âm có thể được sử dụng để xử lý các mẫu nhỏ, lớn hoặc nhiều mẫu cùng một lúc, làm cho nó hiệu quả hơn các phương pháp khác yêu cầu xử lý riêng các mẫu nhỏ.
- Không chứa hóa chất: Ly giải và chiết xuất tế bào siêu âm là một phương pháp không xâm lấn, không yêu cầu sử dụng các hóa chất hoặc enzyme mạnh. Điều này làm cho nó trở nên lý tưởng cho các ứng dụng cần duy trì tính toàn vẹn của nội dung tế bào. Có thể tránh được sự nhiễm bẩn không mong muốn của mẫu.
- Năng suất cao: Ly giải và chiết xuất tế bào siêu âm có thể chiết xuất năng suất cao các thành phần tế bào, bao gồm DNA, RNA và protein. Điều này là do sóng âm tần số cao phá vỡ thành tế bào và giải phóng các chất bên trong vào dung dịch xung quanh.
- Kiểm soát nhiệt độ: Máy siêu âm tinh vi cho phép kiểm soát nhiệt độ chính xác của mẫu. Máy siêu âm kỹ thuật số Hielscher được trang bị cảm biến nhiệt độ có thể cắm được và phần mềm giám sát nhiệt độ.
- Có thể tái tạo: Các giao thức ly giải tế bào siêu âm có thể dễ dàng tái tạo và thậm chí phù hợp với các thể tích mẫu lớn hơn hoặc nhỏ hơn khác nhau bằng cách mở rộng quy mô tuyến tính đơn giản.
- Linh hoạt: Ly giải và chiết xuất tế bào siêu âm có thể được sử dụng để chiết xuất nhiều loại tế bào, bao gồm vi khuẩn, nấm men, nấm, tế bào thực vật và động vật có vú. Nó cũng có thể được sử dụng để chiết xuất các loại phân tử khác nhau, bao gồm protein, DNA, RNA và lipid.
- Chuẩn bị đồng thời nhiều mẫu: Hielscher Ultrasonics cung cấp một số giải pháp để xử lý thoải mái nhiều mẫu trong cùng một điều kiện quy trình. Điều này làm cho bước chuẩn bị mẫu ly giải và chiết xuất hiệu quả cao và tiết kiệm thời gian.
- Dễ sử dụng: Thiết bị ly giải và chiết xuất tế bào siêu âm rất dễ sử dụng và yêu cầu đào tạo tối thiểu. Thiết bị này cũng tiết kiệm vì nó là một khoản đầu tư duy nhất mà không yêu cầu mua lại các sản phẩm xử lý. Điều này làm cho nó trở nên hấp dẫn đối với nhiều nhà nghiên cứu và phòng thí nghiệm.
Nhìn chung, ly giải và chiết xuất tế bào siêu âm là một phương pháp nhanh chóng, hiệu quả, có thể kiểm soát chính xác và linh hoạt để chiết xuất các nội dung tế bào. Ưu điểm của nó so với các phương pháp thay thế làm cho nó trở thành một lựa chọn hấp dẫn cho một loạt các ứng dụng nghiên cứu và công nghiệp.
Nguyên lý làm việc của ly giải tế bào siêu âm
Ly giải và chiết xuất tế bào siêu âm sử dụng sóng âm tần số cao để phá vỡ tế bào và chiết xuất nội dung của chúng. Sóng âm thanh tạo ra sự thay đổi áp suất trong chất lỏng xung quanh, khiến các bong bóng nhỏ hình thành và sụp đổ trong một quá trình được gọi là xâm thực. Những bong bóng này tạo ra các lực cơ học cường độ cao cục bộ có thể phá vỡ các tế bào mở và giải phóng nội dung của chúng vào dung dịch xung quanh.
Phân giải tế bào bằng máy siêu âm thường bao gồm các bước sau:
- Mẫu được đặt trong ống hoặc thùng chứa có dung dịch đệm lỏng.
- Một đầu dò siêu âm được đưa vào mẫu và các sóng âm thanh tần số cao với khoảng 20-30 kHz được áp dụng.
- Sóng siêu âm gây ra dao động và xâm thực trong chất lỏng xung quanh, tạo ra các lực cục bộ phá vỡ các tế bào mở và giải phóng nội dung của chúng.
- Mẫu được ly tâm hoặc lọc để loại bỏ bất kỳ mảnh vụn tế bào nào, và các nội dung chiết xuất được thu thập để phân tích hạ lưu.
Nhược điểm của các phương pháp ly giải thông thường
Trong quá trình làm việc trong phòng thí nghiệm, bạn có thể đã trải qua những rắc rối của việc ly giải tế bào bằng cách sử dụng các quy trình ly giải cơ học hoặc hóa học truyền thống.
- Ly giải cơ học: Các phương pháp ly giải cơ học, chẳng hạn như nghiền bằng vữa và chày hoặc đồng nhất bằng máy ép kiểu Pháp, máy nghiền hạt hoặc hệ thống rôto-stato thường thiếu các tùy chọn điều chỉnh và kiểm soát chính xác. Điều này có nghĩa là việc sử dụng phay và nghiền có thể nhanh chóng tạo ra nhiệt và lực cắt có thể làm hỏng mẫu và biến tính protein. Chúng cũng có thể tốn thời gian và yêu cầu một lượng lớn nguyên liệu ban đầu.
- Ly giải hóa học: Các phương pháp ly giải hóa học, chẳng hạn như ly giải dựa trên chất tẩy rửa, có thể làm hỏng mẫu bằng cách phá vỡ lớp kép lipid và biến tính protein. Chúng cũng có thể yêu cầu nhiều bước và có thể để lại các chất gây ô nhiễm còn sót lại cản trở các ứng dụng hạ lưu. Tìm liều lượng chất tẩy rửa tối ưu là một thách thức bổ sung.
- Chu kỳ đông lạnh: Chu kỳ đông lạnh-rã đông có thể khiến màng tế bào bị vỡ, nhưng các chu kỳ lặp đi lặp lại cũng có thể gây biến tính và thoái hóa protein. Phương pháp này cũng có thể yêu cầu nhiều chu kỳ, có thể tốn thời gian và thường dẫn đến năng suất thấp hơn.
- Ly giải enzym: Các phương pháp ly giải enzym có thể cụ thể cho một số loại tế bào nhất định và yêu cầu nhiều bước, khiến chúng tốn nhiều thời gian. Chúng cũng tạo ra chất thải và yêu cầu tối ưu hóa cẩn thận để tránh sự xuống cấp của mẫu. Bộ dụng cụ ly giải enzym thường đắt tiền. Nếu quy trình ly giải enzym hiện tại của bạn không cho kết quả đầy đủ, siêu âm như phương pháp hiệp đồng có thể được áp dụng để tăng cường sự phá vỡ tế bào.
Trái ngược với các phương pháp ly giải tế bào cơ học và hóa học thông thường, siêu âm là một công cụ rất hiệu quả và đáng tin cậy cho sự phân hủy tế bào cho phép kiểm soát hoàn toàn các thông số siêu âm. Điều này đảm bảo tính chọn lọc cao về việc giải phóng vật liệu và độ tinh khiết của sản phẩm. [xem Balasundaram và cộng sự, 2009]
Nó phù hợp với tất cả các loại tế bào và dễ dàng áp dụng trong quy mô nhỏ và lớn – luôn trong điều kiện được kiểm soát. Máy siêu âm rất dễ làm sạch. Máy đồng nhất siêu âm luôn có chức năng làm sạch tại chỗ (CIP) và khử trùng tại chỗ (SIP). Sonotrode bao gồm một chiếc sừng titan lớn có thể được lau hoặc xả trong nước hoặc dung môi (tùy thuộc vào môi trường làm việc). Việc duy trì máy siêu âm là do độ bền của chúng gần như không thể bỏ qua.
Ly giải siêu âm và phá vỡ tế bào
Nói chung, quá trình ly giải các mẫu trong phòng thí nghiệm sẽ mất từ 15 giây đến 2 phút. Vì cường độ siêu âm rất dễ điều chỉnh bằng cách thiết lập biên độ thời gian siêu âm cũng như bằng cách chọn thiết bị phù hợp, có thể phá vỡ màng tế bào rất nhẹ nhàng hoặc rất đột ngột, tùy thuộc vào cấu trúc tế bào và mục đích ly giải (ví dụ: chiết xuất DNA yêu cầu siêu âm mềm hơn, chiết xuất protein hoàn toàn của vi khuẩn đòi hỏi điều trị siêu âm cường độ cao hơn). Nhiệt độ trong quá trình có thể được theo dõi bằng cảm biến nhiệt độ tích hợp và có thể dễ dàng điều khiển bằng cách làm mát (bể đá hoặc tế bào dòng chảy với áo làm mát) hoặc bằng cách siêu âm ở chế độ xung. Trong quá trình siêu âm chế độ xung, các chu kỳ nổ siêu âm ngắn trong khoảng thời gian 1-15 giây cho phép tản nhiệt và làm mát trong thời gian gián đoạn dài hơn.
Tất cả các quy trình điều khiển bằng sóng siêu âm đều hoàn toàn có thể tái tạo và có thể mở rộng tuyến tính.
The VialTweeter là một máy đồng nhất siêu âm để chuẩn bị vô trùng đồng thời, đồng nhất và nhanh chóng của nhiều mẫu.
- Chuẩn bị huyền phù tế bào: Các viên tế bào phải được lơ lửng hoàn toàn trong dung dịch đệm bằng cách đồng nhất (chọn dung dịch đệm của bạn tương thích với phân tích sau, ví dụ như phương pháp sắc ký cụ thể). Thêm lysozyme và / hoặc các chất phụ gia khác, nếu cần (chúng cũng phải tương thích với các phương tiện tách/tinh chế). Trộn / đồng nhất dung dịch nhẹ nhàng dưới quá trình siêu âm nhẹ cho đến khi đạt được huyền phù hoàn toàn.
Tìm hiểu thêm về tác dụng hiệp đồng của lysozyme kết hợp với siêu âm! - Ly giải siêu âm: Đặt mẫu vào nồi cách thủy đá. Đối với sự gián đoạn tế bào, siêu âm huyền phù ở 60-90 giây bùng nổ (sử dụng chế độ xung của máy siêu âm của bạn).
- Tách: Ly tâm dung dịch ly giải (ví dụ: 10 phút ở 10.000 x g; ở 4 độ C). Tách phần nổi lên khỏi viên tế bào một cách cẩn thận. Nổi trên là toàn bộ dung dịch ly giải tế bào. Sau khi lọc phần nổi trên, bạn thu được một chất lỏng tinh khiết của protein tế bào hòa tan.
Các ứng dụng phổ biến nhất cho máy siêu âm trong sinh học và công nghệ sinh học là:
- Chuẩn bị chiết xuất tế bào
- Sự phá vỡ nấm men, vi khuẩn, tế bào thực vật, mô tế bào mềm hoặc cứng, vật liệu nucleic
- chiết xuất protein
- Chuẩn bị và phân lập enzyme
- Sản xuất kháng nguyên
- Chiết xuất DNA và / hoặc phân mảnh nhắm mục tiêu
- Chuẩn bị liposome
Phá vỡ tế bào bằng máy siêu âm kiểu đầu dò là một phương pháp chuẩn bị mẫu hiệu quả.
Các ứng dụng đa dạng của siêu âm phân nhánh trong các lĩnh vực công nghệ sinh học, kỹ thuật sinh học, vi sinh, sinh học phân tử, hóa sinh, miễn dịch học, vi khuẩn học, virus học, proteomics, di truyền học, sinh lý học, sinh học tế bào, huyết học và thực vật học.
Lysis: phá vỡ cấu trúc tế bào
Các tế bào được bảo vệ bởi một màng sinh chất bán thấm bao gồm một lớp kép phospho-lipid (cũng là lớp kép protein-lipid; được hình thành bởi lipid kỵ nước và các phân tử phốt pho ưa nước với các phân tử protein nhúng) và tạo ra một rào cản giữa bên trong tế bào (tế bào chất) và môi trường ngoại bào. Tế bào thực vật và tế bào nhân sơ được bao quanh bởi một thành tế bào. Do có nhiều lớp thành tế bào cellulose dày, tế bào thực vật khó ly giải hơn tế bào động vật. Bên trong tế bào, chẳng hạn như bào quan, nhân, ty thể, được ổn định bởi bộ xương tế bào.
Bằng cách ly giải các tế bào, nó nhằm mục đích chiết xuất và tách các bào quan, protein, DNA, mRNA hoặc các phân tử sinh học khác.
Các phương pháp ly giải tế bào thông thường và nhược điểm của chúng
Có một số phương pháp để ly giải tế bào, có thể được chia thành các phương pháp cơ học và hóa học, bao gồm sử dụng chất tẩy rửa hoặc dung môi, áp dụng áp suất cao hoặc sử dụng máy nghiền hạt hoặc máy ép kiểu Pháp. Nhược điểm khó khăn nhất của các phương pháp này là khó kiểm soát và điều chỉnh các thông số quy trình và do đó tác động.
Bảng dưới đây hiển thị những nhược điểm chính của các phương pháp ly giải phổ biến:
Bảng: Các phương pháp ly giải tế bào thông thường có những nhược điểm lớn
Quy trình ly giải
Ly giải là một quá trình nhạy cảm. Trong quá trình ly giải, sự bảo vệ của màng tế bào bị phá hủy, tuy nhiên phải ngăn chặn sự bất hoạt, biến tính và thoái hóa các protein được chiết xuất bởi môi trường phi sinh lý (sai lệch so với giá trị pH). Do đó, nói chung, ly giải được thực hiện trong dung dịch đệm. Hầu hết các khó khăn phát sinh từ sự phá vỡ tế bào không kiểm soát được dẫn đến giải phóng không nhắm mục tiêu tất cả vật liệu nội bào hoặc / và biến tính của sản phẩm đích.
Các câu hỏi thường gặp về Sonication và ly giải tế bào
- Bạn có thể ly giải tế bào bằng siêu âm? Có, siêu âm ly giải tế bào hiệu quả bằng cách sử dụng sóng siêu âm tần số cao gây ra xâm thực, một hiện tượng trong đó các bong bóng hơi nhỏ hình thành và sụp đổ dữ dội trong huyền phù tế bào. Các lực cơ học kết quả phá vỡ màng tế bào và tạo điều kiện giải phóng các thành phần nội bào vào chất lỏng.
- Làm thế nào để sử dụng máy siêu âm để ly giải tế bào? Sử dụng máy siêu âm để ly giải tế bào liên quan đến việc nhúng đầu dò siêu âm vào huyền phù tế bào và điều chỉnh các thông số như biên độ và thời lượng xung. Quá trình này cần được theo dõi chặt chẽ để tối ưu hóa sự phá vỡ tế bào đồng thời giảm thiểu sự biến tính protein và bất hoạt enzyme.
- Nguyên tắc siêu âm để ly giải tế bào là gì? Sonication hoạt động theo nguyên tắc xâm thực âm thanh. Năng lượng siêu âm được truyền vào môi trường lỏng, gây ra sự dao động áp suất nhanh dẫn đến sự hình thành và nổ các bong bóng nhỏ. Những vụ nổ này tạo ra lực cắt mạnh và nhiệt độ cao cục bộ, phá vỡ cấu trúc tế bào và tăng cường tính đồng nhất của ly giải.
- Quá trình siêu âm ly giải tế bào mất bao lâu? Thời gian siêu âm để ly giải tế bào có thể thay đổi đáng kể tùy thuộc vào các yếu tố như loại tế bào, mật độ tế bào, công suất siêu âm và giao thức cụ thể được sử dụng. Các quy trình điển hình có thể dao động từ vài giây đến vài phút, thường được thực hiện theo chu kỳ để quản lý sự sinh nhiệt và đảm bảo sự gián đoạn tế bào đồng đều.
- Mục đích của quá trình siêu âm trong chiết xuất protein là gì? Trong chiết xuất protein, siêu âm phục vụ cho việc phá vỡ màng tế bào và hòa tan protein một cách hiệu quả. Phương pháp này đặc biệt hữu ích để giải phóng protein từ bên trong các ngăn tế bào, làm cho nó cần thiết để điều chế chất ly giải mà từ đó protein sẽ được tinh chế hoặc phân tích.
- Tại sao siêu âm được sử dụng để chiết xuất? Sonication được ưa chuộng để chiết xuất do hoạt động nhanh chóng và khả năng áp dụng năng lượng mục tiêu, phá vỡ cấu trúc tế bào để giải phóng các phân tử hoạt tính sinh học mà không cần sử dụng các phương pháp xử lý hóa học khắc nghiệt, do đó duy trì tính toàn vẹn chức năng của các hợp chất chiết xuất.
- Quá trình siêu âm có làm gián đoạn tương tác protein-protein không? Mặc dù siêu âm có thể phá vỡ màng tế bào một cách hiệu quả, nhưng nó cũng có thể phá vỡ các tương tác protein-protein. Mức độ gián đoạn phụ thuộc vào cường độ siêu âm và thời gian tiếp xúc, có khả năng dẫn đến biến tính hoặc phân ly các phức hợp protein, có thể ảnh hưởng đến các nghiên cứu phân tích hoặc chức năng tiếp theo.
- Siêu âm có thể được sử dụng để ly giải E. coli không? Máy siêu âm Hielscher đặc biệt hiệu quả để ly giải các tế bào vi khuẩn như E. coli, có thành tế bào mạnh mẽ. Kỹ thuật này cung cấp một phương pháp vật lý để cắt thành tế bào và màng, làm cho nó trở thành một phương pháp ưa thích để điều chế chất ly giải vi khuẩn trong các phòng thí nghiệm sinh học phân tử và hóa sinh.
- Các bước tiếp theo sau bước siêu âm là gì?
Các bước tiếp theo sau quá trình ly giải bằng siêu âm thường bao gồm phân tách dịch ly giải, tách chiết có chọn lọc các bào quan và chiết xuất hoặc tinh chế protein tiếp theo.
Dịch chiết đã được xử lý sau đó được tách ra và chuẩn bị cho các ứng dụng phân tích hoặc chức năng, chẳng hạn như proteomics độ phân giải cao, transcriptomics hoặc nghiên cứu liên kết thụ thể.
Văn học/Tài liệu tham khảo
- Balasundaram, B.; Harrison, S.; Bracewell, D. G. (2009): Advances in product release strategies and impact on bioprocess design. Trends in Biotechnology 27/8, 2009. pp. 477-485.
- Vilkhu, K.; Manasseh, R.; Mawson, R.; Ashokkumar, M. (2011): Ultrasonic Recovery and Modification of Food ingredients. In: Feng/ Barbosa-Cánovas/ Weiss (2011): Ultrasound Technologies for Food and Bioprocessing. New York: Springer, 2011. pp. 345-368.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
- Brandy Verhalen, Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.