Sonication cho Lysis: Phá vỡ tế bào và khai thác

Tan rã tế bào hoặc ly giải là một phần phổ biến của việc chuẩn bị mẫu hàng ngày trong các phòng thí nghiệm công nghệ sinh học. Mục tiêu của ly giải là phá vỡ các bộ phận của thành tế bào hoặc tế bào hoàn chỉnh để giải phóng các phân tử sinh học. Siêu âm homogenizers được sử dụng rộng rãi để ly giải tế bào thành công. Ưu điểm chính của ultrasonicators tinh vi là kiểm soát chính xác các thông số quá trình như cường độ và nhiệt độ, cho phép một sự gián đoạn tế bào nhẹ nhàng, nhưng hiệu quả cao và khai thác.

Lysis tế bào bằng siêu âm

Ly giải và khai thác tế bào siêu âm là một phương pháp được sử dụng để phá vỡ các tế bào mở và trích xuất các nội dung bằng sóng âm thanh tần số cao, tức là siêu âm. Sonication là một kỹ thuật ly giải, được sử dụng rộng rãi như một phương pháp được thiết lập và đáng tin cậy để phá vỡ tế bào và khai thác vật liệu nội bào. Ly giải siêu âm là một kỹ thuật đáng tin cậy để chuẩn bị lysate ccontaining ví dụ như plasmid, xét nghiệm thụ thể, protein, DNA, RNA vv Vì cường độ siêu âm có thể được san bằng bằng cách điều chỉnh các thông số quá trình, cường độ sonication tối ưu từ rất mềm đến cường độ cao có thể được thiết lập riêng cho từng chất và phương tiện để đáp ứng các yêu cầu ứng dụng cụ thể. Theo các bước ly giải là phân đoạn, phân lập bào quan hoặc / và chiết xuất và thanh lọc protein. Vật liệu được chiết xuất (= lysate) phải được tách ra và phải được điều tra hoặc ứng dụng thêm, ví dụ như cho nghiên cứu proteomic.

So với các phương pháp ly giải và chiết xuất tế bào khác, ly giải tế bào siêu âm có một số ưu điểm:

1. Tốc độ: Ly giải và khai thác tế bào siêu âm là một phương pháp nhanh chóng có thể phá vỡ các tế bào mở trong vài giây. Điều này nhanh hơn nhiều so với các phương pháp khác như đồng nhất hóa, rã đông freez hoặc phay hạt.
2. Hiệu quả: Ly giải và khai thác tế bào siêu âm có thể được sử dụng để điều trị các mẫu nhỏ, lớn hoặc nhiều mẫu cùng một lúc, làm cho nó hiệu quả hơn các phương pháp khác yêu cầu xử lý riêng lẻ các mẫu nhỏ.
3. Không có hóa chất: Ly giải và chiết xuất tế bào siêu âm là một phương pháp không xâm lấn không yêu cầu sử dụng các hóa chất hoặc enzyme khắc nghiệt. Điều này làm cho nó trở nên lý tưởng cho các ứng dụng mà tính toàn vẹn của nội dung ô cần được duy trì. Có thể tránh được ô nhiễm không mong muốn của mẫu.
4. Năng suất cao: Ly giải tế bào siêu âm và khai thác có thể trích xuất một năng suất cao của nội dung tế bào, bao gồm DNA, RNA, và protein. Điều này là do sóng âm thanh tần số cao phá vỡ các bức tường tế bào và giải phóng các nội dung vào dung dịch xung quanh.
5. Kiểm soát nhiệt độ: Ultrasonciators tinh vi cho phép kiểm soát nhiệt độ chính xác của mẫu. Siêu âm kỹ thuật số Hielscher được trang bị một cảm biến nhiệt độ pluggable và phần mềm giám sát nhiệt độ.
6. Có thể tái tạo: Các giao thức cho ly giải tế bào siêu âm có thể dễ dàng tái tạo và thậm chí phù hợp với khối lượng mẫu lớn hơn hoặc nhỏ hơn khác nhau bằng cách mở rộng tuyến tính đơn giản.
7. Linh hoạt: Ly giải và khai thác tế bào siêu âm có thể được sử dụng để trích xuất một loạt các loại tế bào, bao gồm vi khuẩn, nấm men, nấm, tế bào thực vật và động vật có vú. Nó cũng có thể được sử dụng để chiết xuất các loại phân tử khác nhau, bao gồm protein, DNA, RNA và lipid.
8. Chuẩn bị đồng thời nhiều mẫu: Hielscher Ultrasonics cung cấp một số giải pháp để thoải mái xử lý nhiều mẫu trong cùng điều kiện quy trình. Điều này làm cho bước chuẩn bị mẫu của lysis và chiết xuất có hiệu quả cao và tiết kiệm thời gian.
9. Dễ sử dụng: Thiết bị ly giải và khai thác tế bào siêu âm rất dễ sử dụng và yêu cầu đào tạo tối thiểu. Thiết bị cũng tiết kiệm vì đây là một khoản đầu tư duy nhất mà không yêu cầu mua lại các vật liệu xử lý. Điều này làm cho nó hấp dẫn đối với một loạt các nhà nghiên cứu và phòng thí nghiệm.

Nhìn chung, ly giải và khai thác tế bào siêu âm là một phương pháp nhanh chóng, hiệu quả, có thể kiểm soát chính xác và linh hoạt để trích xuất nội dung tế bào. Ưu điểm của nó so với các phương pháp thay thế làm cho nó trở thành một lựa chọn hấp dẫn cho một loạt các ứng dụng nghiên cứu và công nghiệp.

Nguyên lý làm việc của ly giải tế bào siêu âm

Ly giải và khai thác tế bào siêu âm sử dụng sóng âm thanh tần số cao để phá vỡ các tế bào và trích xuất nội dung của chúng. Các sóng âm thanh tạo ra sự thay đổi áp suất trong chất lỏng xung quanh, làm cho các bong bóng nhỏ hình thành và sụp đổ trong một quá trình được gọi là xâm thực. Những bong bóng này tạo ra các lực cơ học cục bộ, cường độ cao có thể phá vỡ các tế bào mở và giải phóng nội dung của chúng vào dung dịch xung quanh.

Ly giải tế bào bằng cách sử dụng một ultrasonicator thường bao gồm các bước sau:

• Mẫu được đặt trong một ống hoặc thùng chứa có đệm chất lỏng.
• Một đầu dò siêu âm được đưa vào mẫu và sóng âm thanh tần số cao với khoảng 20-30 kHz được áp dụng.
• Các sóng siêu âm gây ra dao động và xâm thực trong chất lỏng xung quanh, tạo ra các lực cục bộ phá vỡ các tế bào mở và giải phóng nội dung của chúng.
• Mẫu được ly tâm hoặc lọc để loại bỏ bất kỳ mảnh vụn tế bào nào và nội dung được chiết xuất được thu thập để phân tích hạ lưu.

Sóng siêu âm mạnh mẽ phá vỡ ma trận tế bào của các cấu trúc sinh học và giải phóng các hợp chất hoạt tính sinh học. Sự chuyển giao khối lượng giữa nguyên liệu thực vật và dung môi (ví dụ: dung dịch đệm) được tăng cường. (đồ họa: ©Vilkhu và cộng sự, 2006)

Nhược điểm của phương pháp ly giải thông thường

Trong quá trình làm việc trong các phòng thí nghiệm, bạn có thể đã gặp phải rắc rối khi ly giải tế bào bằng cách sử dụng các giao thức ly giải cơ học hoặc hóa học truyền thống.

• Ly giải cơ học: Các phương pháp ly giải cơ học, chẳng hạn như mài bằng vữa và chày hoặc đồng nhất hóa bằng máy ép, máy nghiền hạt hoặc hệ thống stato của Pháp thường thiếu các tùy chọn điều khiển và điều chỉnh trước. Điều này có nghĩa là việc sử dụng phay và nghiền có thể nhanh chóng tạo ra nhiệt và lực cắt có thể làm hỏng mẫu và làm biến tính protein. Chúng cũng có thể tốn thời gian và đòi hỏi một lượng lớn nguyên liệu ban đầu.
• Ly giải hóa học: Các phương pháp ly giải hóa học, chẳng hạn như ly giải dựa trên chất tẩy rửa, có thể làm hỏng mẫu bằng cách phá vỡ lớp kép lipid và biến tính protein. Chúng cũng có thể yêu cầu nhiều bước và có thể để lại các chất gây ô nhiễm còn sót lại gây trở ngại cho các ứng dụng hạ nguồn. Tìm ra liều lượng chất tẩy rửa tối ưu là một thách thức bổ sung.
• Chu kỳ đóng băng-tan băng: Chu kỳ đóng băng-tan băng có thể khiến màng tế bào bị vỡ, nhưng chu kỳ lặp đi lặp lại cũng có thể gây ra sự biến tính và thoái hóa protein. Phương pháp này cũng có thể yêu cầu nhiều chu kỳ, có thể tốn thời gian và thường dẫn đến năng suất thấp hơn.
• Ly giải enzyme: Các phương pháp ly giải enzyme có thể đặc hiệu cho một số loại tế bào nhất định và yêu cầu nhiều bước, khiến chúng tốn thời gian. Chúng cũng tạo ra chất thải và yêu cầu tối ưu hóa cẩn thận để tránh sự xuống cấp của mẫu. Bộ dụng cụ ly giải enzyme thường đắt tiền. Nếu thủ tục ly giải enzyme hiện tại của bạn cho kết quả không đủ, sonication như phương pháp hiệp đồng có thể được áp dụng để tăng cường sự gián đoạn tế bào.

Trái ngược với các phương pháp ly giải tế bào cơ học và hóa chất thông thường, sonication là một công cụ rất hiệu quả và đáng tin cậy cho sự tan rã tế bào cho phép kiểm soát hoàn toàn các thông số sonication. Điều này đảm bảo tính chọn lọc cao về việc phát hành vật liệu và độ tinh khiết của sản phẩm. [cf. Balasundaram và cộng sự, 2009]
Nó phù hợp với tất cả các loại tế bào và dễ dàng áp dụng ở quy mô nhỏ và lớn – luôn trong điều kiện được kiểm soát. Ultrasonicators rất dễ dàng để làm sạch. Một homogenizer siêu âm luôn có chức năng làm sạch tại chỗ (CIP) và khử trùng tại chỗ (SIP). Sonotrode bao gồm một sừng titan khổng lồ có thể được lau hoặc xả trong nước hoặc dung môi (tùy thuộc vào môi trường làm việc). Việc duy trì ultrasonicators là do sức mạnh của họ gần như bỏ bê.

Siêu âm Lysis và sự gián đoạn tế bào

Nói chung, việc lysis mẫu trong phòng thí nghiệm sẽ mất từ 15 giây đến 2 phút. Khi cường độ của sonication là rất dễ dàng để điều chỉnh bằng cách thiết lập một sonication thời gian, cũng như cách chọn các thiết bị phù hợp, có thể phá vỡ màng tế bào rất nhẹ nhàng hoặc rất đột ngột, tùy thuộc vào cấu trúc tế bào và mục đích của lysis ( Ví dụ như chiết xuất DNA đòi hỏi sonication mềm hơn, khai thác hoàn toàn protein của vi khuẩn đòi hỏi phải điều trị siêu âm mạnh hơn). Nhiệt độ trong quá trình có thể được theo dõi bởi một cảm biến nhiệt độ tích hợp và có thể dễ dàng kiểm soát bằng cách làm mát (tắm nước đá hoặc các tế bào dòng chảy với áo khoác làm mát) hoặc bằng sonication trong chế độ xung. Trong quá trình sonication xung chế độ, chu kỳ bùng nổ sonication ngắn 1-15 giây thời gian cho phép tản nhiệt và làm mát trong thời gian dài liên tục.
Tất cả các quá trình siêu âm-driven là hoàn toàn tái sản xuất và tuyến tính có thể mở rộng.

Siêu âm homogenizers cho lysis tế bào và khai thác

Các loại thiết bị siêu âm khác nhau cho phép phù hợp với mục tiêu chuẩn bị mẫu và đảm bảo sự thân thiện với người dùng và sự thoải mái khi vận hành. Ultrasonicators loại thăm dò là các thiết bị phổ biến nhất trong phòng thí nghiệm. Chúng phù hợp nhất để chuẩn bị các mẫu vừa và nhỏ với thể tích 0,1mL lên đến 1000mL. Kích thước năng lượng khác nhau và sonotrodes cho phép thích ứng ultrasonicator với khối lượng mẫu và tàu cho kết quả sonicating hiệu quả và hiệu quả nhất. Thiết bị thăm dò siêu âm là sự lựa chọn tốt nhất khi các mẫu đơn lẻ phải được chuẩn bị.

Nếu nhiều mẫu phải được chuẩn bị, ví dụ như 8-10 lọ dung dịch tế bào, sonication gián tiếp cường độ cao với các hệ thống siêu âm như VialTweeter hoặc cuphorn siêu âm là phương pháp đồng nhất phù hợp nhất để ly giải hiệu quả. Một số lọ được sonicated cùng một lúc, ở cùng cường độ. Điều này không chỉ tiết kiệm thời gian, mà còn đảm bảo xử lý giống nhau của tất cả các mẫu, làm cho kết quả giữa các mẫu đáng tin cậy và có thể so sánh được. Hơn nữa, trong quá trình lây nhiễm chéo sonication gián tiếp bằng cách ngâm sonotrode siêu âm (còn được gọi là đầu dò siêu âm, sừng, đầu hoặc ngón tay) được tránh. Vì các lọ phù hợp với kích thước riêng lẻ đến mẫu được sử dụng, việc dọn dẹp tốn thời gian và mất mẫu do gạn tàu được bỏ qua. Đối với sonication đồng nhất của tấm multiwell hoặc microtiter, Hielscher cung cấp UIP400MTP.
Đối với khối lượng cao hơn, ví dụ như cho việc sản xuất thương mại của tế bào, Hệ thống siêu âm liên tục với một lò phản ứng tế bào dòng chảy là phù hợp nhất. Dòng chảy liên tục và thậm chí của vật liệu chế biến đảm bảo một sonication thậm chí. Tất cả các thông số của quá trình tan rã siêu âm có thể được tối ưu hóa và điều chỉnh theo yêu cầu của ứng dụng và vật liệu tế bào cụ thể.
 
 
Thủ tục mẫu mực cho siêu âm lysing của tế bào vi khuẩn:

• Chuẩn bị đình chỉ tế bào: viên pin phải được hoàn toàn bị đình chỉ trong một giải pháp đệm bằng cách đồng nhất (chọn giải pháp đệm của bạn tương thích với phân tích sau, ví dụ như phương pháp sắc ký cụ thể). Thêm lysozyme và/hoặc các chất phụ gia khác, nếu cần thiết (chúng cũng phải tương thích với các phương tiện tách/lọc). Trộn/đồng nhất các giải pháp nhẹ nhàng dưới sonication nhẹ cho đến khi hệ thống treo hoàn toàn đạt được.
• Siêu âm lysis: nơi mẫu trong một bồn tắm nước đá. Đối với sự gián đoạn tế bào, sonicate đình chỉ ở 60-90 thứ hai nổ (sử dụng chế độ xung của ultrasonicator của bạn).
• Ly thân: máy ly tâm lysate (ví dụ 10 phút tại 10.000 x g; tại 4degC). Tách các supernatant từ các miếng tế bào cẩn thận. Supernatant là tổng lysate tế bào. Sau khi lọc của supernatant, bạn có được một chất lỏng làm rõ của protein tế bào hòa tan.

 
 
Các ứng dụng phổ biến nhất cho ultrasonicators trong sinh học và công nghệ sinh học là:

• Chuẩn bị chiết xuất tế bào
• Sự gián đoạn của nấm men, vi khuẩn, tế bào thực vật, mô tế bào mềm hoặc cứng, vật liệu hạt nhân
• Chiết xuất protein
• Chuẩn bị và cô lập enzym
• Sản xuất kháng nguyên
• Chiết xuất DNA và/hoặc phân mảnh nhắm mục tiêu
• chuẩn bị liposome