Nâng cao phân tích HPLC thông qua việc chuẩn bị mẫu đáng tin cậy
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu suất cao (HPLC) vẫn là một trong những kỹ thuật phân tích quan trọng nhất để xác định và định lượng các hợp chất trong các ma trận phức tạp. Từ kiểm soát chất lượng dược phẩm đến giám sát môi trường và phân tích thực phẩm, các phương pháp HPLC được đánh giá cao nhờ độ nhạy, độ chọn lọc và độ tái lập. Tuy nhiên, độ tin cậy của dữ liệu sắc ký phụ thuộc rất lớn vào một bước quan trọng: chuẩn bị mẫu HPLC.
Research and sample prep routines demonstrate that sonication-assisted extraction and sample preparation significantly improve the efficiency, accuracy, and speed of HPLC analysis. By using ultrasonic energy to disrupt matrices and enhance analyte transfer into solvents, laboratories can obtain higher recoveries, shorter extraction times, and more reproducible analytical results.
Tại sao việc chuẩn bị mẫu lại quan trọng trong HPLC?
Trong nhiều quy trình phân tích, ma trận mẫu – chẳng hạn như vật liệu thực vật, mô sinh học, đất hoặc nước – Chứa các hỗn hợp phức tạp của các hợp chất có thể gây cản trở quá trình tách sắc ký. Do đó, việc chuẩn bị mẫu hiệu quả là cần thiết để tách các chất phân tích, loại bỏ các chất gây cản trở và tập trung các hợp chất mục tiêu trước khi đưa vào hệ thống HPLC.
Các kỹ thuật chiết xuất truyền thống thường đòi hỏi các quy trình phức tạp, sử dụng lượng lớn dung môi hữu cơ và nhiều bước làm sạch. Các phương pháp này có thể gây ra sự biến động, tăng chi phí vận hành và kéo dài thời gian phân tích tổng thể.
Chuẩn bị mẫu bằng siêu âm cung cấp một giải pháp hiệu quả. Quá trình siêu âm đưa năng lượng âm thanh tần số cao vào môi trường lỏng, tạo ra các bong bóng cavitation vi mô. Khi các bong bóng này vỡ tung, chúng tạo ra lực cắt cục bộ và hiệu ứng trộn vi mô, làm phá vỡ ma trận rắn và tăng tốc quá trình chuyển khối. Quá trình này làm tăng đáng kể hiệu suất chiết xuất.
UIP400MTP máy siêu âm thông lượng cao Với giá đỡ ống cho ống tự động lấy mẫu
Bằng chứng khoa học: Siêu âm cải thiện hiệu suất phân tích
Một số nghiên cứu được đánh giá ngang hàng đã chứng minh những ưu điểm của phương pháp chiết xuất siêu âm trong quy trình HPLC.
Ví dụ, một phương pháp được phát triển để theo dõi dư lượng thuốc trừ sâu trong mẫu nước đã sử dụng kỹ thuật siêu âm kết hợp với phân tích LC–MS/MS để xác định nồng độ thuốc trừ sâu carbaryl. Trong phương pháp này, các mẫu nước được chiết xuất bằng acetonitrile dưới tác động của siêu âm trước khi tiến hành phân tích sắc ký. Phương pháp này đạt được hiệu suất phân tích cao, bao gồm tỷ lệ thu hồi từ 89,53% đến 101,72%, xác nhận độ chính xác và độ tin cậy của quy trình chuẩn bị mẫu bằng siêu âm.
Bước chiết xuất bằng siêu âm đã cho phép chuyển giao hiệu quả các chất phân tích từ ma trận nước sang dung môi hữu cơ, giảm lượng dung môi tiêu thụ và loại bỏ nhu cầu thực hiện các quy trình làm sạch phức tạp. Phương pháp phân tích đã được xác nhận cho thấy độ tuyến tính, độ chính xác và giới hạn định lượng xuất sắc, nhấn mạnh hiệu quả của siêu âm trong các quy trình sắc ký hiện đại. (xem Roudani et al., 2018)
Một nghiên cứu khác đã giới thiệu phương pháp phân tán pha rắn hỗ trợ siêu âm (UA-MSPD) để xác định oleuropein trong lá ô liu bằng phân tích HPLC. Trong kỹ thuật này, bột thực vật và vật liệu hấp phụ được trộn lẫn và sau đó được tiếp xúc với sóng siêu âm trong giai đoạn rửa giải. Siêu âm giúp tăng cường quá trình giải hấp chất phân tích khỏi bề mặt vật liệu hấp phụ đồng thời cải thiện quá trình chiết xuất từ ma trận mẫu. (xem Rashidipour và Heydari, 2018)
Quy trình siêu âm được tối ưu hóa đã mang lại những cải thiện đáng kể về mặt phân tích, bao gồm:
- Đường cong hiệu chuẩn tuyến tính với R² = 0.9979
- Giới hạn phát hiện thấp nhất là 0,03 µg/mL
- Tỷ lệ phục hồi dao động từ 90,2% đến 96,7%
Các kết quả này xác nhận rằng phương pháp chiết xuất hỗ trợ bằng siêu âm không chỉ giúp tăng tốc quá trình chuẩn bị mẫu mà còn tăng hiệu suất chiết xuất so với các kỹ thuật phân tán pha rắn truyền thống.
Máy sonicator kiểu đầu dò UP200St Để chuẩn bị mẫu cho HPLC
Những ưu điểm chính của phương pháp chuẩn bị mẫu bằng siêu âm cho HPLC
Sự gia tăng việc áp dụng công nghệ chiết xuất siêu âm trong các phòng thí nghiệm phân tích được thúc đẩy bởi nhiều lợi ích có thể đo lường được.
- Hiệu suất chiết xuất cao hơn
Hiện tượng cavitation âm thanh phá vỡ ma trận rắn và cải thiện khả năng thâm nhập của dung môi. Điều này giúp tăng cường quá trình giải phóng chất phân tích và nâng cao tỷ lệ thu hồi, đặc biệt đối với các hợp chất ở nồng độ thấp trong các mẫu phức tạp. - Giảm thời gian chuẩn bị mẫu
Chiết xuất siêu âm thường có thể hoàn thành quá trình chuẩn bị mẫu trong vài giây hoặc vài phút. Ví dụ, các thông số chiết xuất siêu âm được tối ưu hóa trong UA-MSPD đã đạt được hiệu suất thu hồi chất phân tích cao trong khoảng 30 giây siêu âm, cho thấy mức độ tăng tốc đáng kể của quy trình phân tích. - Giảm lượng dung môi sử dụng
Vì siêu âm tăng cường quá trình chuyển khối, thường chỉ cần sử dụng lượng dung môi nhỏ hơn. Việc giảm lượng dung môi sử dụng giúp nâng cao tính bền vững của phòng thí nghiệm và giảm chi phí vận hành. - Cải thiện độ tái hiện
Phân phối năng lượng siêu âm đồng đều đảm bảo sự phá vỡ và chiết xuất mẫu nhất quán giữa các mẫu thử, dẫn đến độ chính xác cao hơn trong các phép đo phân tích. - Tương thích với các phương pháp sắc ký hiện đại
Phương pháp chiết xuất siêu âm tích hợp dễ dàng với các hệ thống HPLC, UHPLC và LC-MS, khiến nó phù hợp cho các môi trường phân tích có năng suất cao.
Sắc ký HPLC của các hợp chất phenolic từ chiết xuất siêu âm cô lập của lá Annona muricata bằng cách sử dụng ultrasonicator UP400S.
(Nghiên cứu và đồ họa: ©Nolasco-González và cộng sự, 2022)
Giải pháp siêu âm thực tiễn cho chuẩn bị mẫu HPLC
For laboratories implementing ultrasonic extraction, Hielscher sonicators provide precise control over parameters such as amplitude, time, and pulse mode. Therefore, Hielscher lab sonicators are particularly suitable for analytical laboratories.
Chọn máy siêu âm phòng thí nghiệm phù hợp nhất cho mẫu HPLC của bạn.
| Máy siêu âm Model | Ưu điểm của HPLC | Ứng dụng tốt nhất trong chuẩn bị mẫu cho HPLC |
| Máy siêu âm đa ống VialTweeter |
• Siêu âm đồng thời lên đến 10 ống nghiệm đóng kín với năng lượng siêu âm tương đương. • Vô trùng: Không có sự lây nhiễm chéo vì các mẫu được giữ kín. • Điều kiện chiết xuất có độ tái hiện cao giữa các mẻ. • Tạo bọt khí hiệu quả cho các mẫu phân tích có thể tích nhỏ |
• Chuẩn bị mẫu với năng suất cao cho các mẫu môi trường, thực phẩm hoặc dược phẩm. • Chiết xuất chất phân tích trước khi phân tích bằng HPLC, UHPLC hoặc LC-MS. • Quy trình làm việc tiêu chuẩn hóa yêu cầu xử lý đồng nhất cho nhiều mẫu. |
| Máy siêu âm tấm siêu âm UIP400MTP |
• Siêu âm không tiếp xúc cho toàn bộ microplate (định dạng 96 giếng, 384 giếng) • Phân phối năng lượng siêu âm đồng đều trên tất cả các giếng. • Cho phép tự động hóa và tích hợp robot cho các quy trình phân tích. • Công suất cao với khả năng điều khiển chính xác biên độ và thời gian siêu âm. |
• Quy trình sàng lọc UHPLC có năng suất cao • Thư viện hợp chất dược phẩm và chuẩn bị mẫu cho phân tích chuyển hóa • Phương pháp chiết xuất dựa trên đĩa cho các quy trình phân tích LC-MS hoặc UHPLC |
| Máy siêu âm phòng thí nghiệm có đầu dò vi mô (siêu âm trực tiếp) |
• Cường độ siêu âm tối đa để phá vỡ ma trận hiệu quả • Chiết xuất rất nhanh các chất phân tích từ các mẫu rắn, nhớt hoặc không đồng nhất. • Thông số biên độ và xung có thể điều chỉnh để tối ưu hóa điều kiện chiết xuất. • Năng lượng cavitation cao giúp cải thiện hiệu suất thu hồi và năng suất chiết xuất của chất phân tích. |
• Chiết xuất từ các ma trận phức tạp như mô thực vật, mẫu thực phẩm hoặc polymer. • Hòa trộn đồng nhất trước khi thực hiện SPE, lọc hoặc chiết xuất pha lỏng–pha lỏng. • Phát triển phương pháp chuẩn bị mẫu bằng siêu âm cho HPLC |
| Cuphorn (“Tắm nước nóng cường độ cao” cho cốc và ống) |
• Siêu âm gián tiếp ngăn ngừa ô nhiễm đầu dò. • Trường siêu âm đồng nhất cho nhiều ống cùng lúc • Phù hợp cho các mẫu vô trùng, nguy hiểm hoặc dễ bay hơi cần được giữ kín. • Giúp việc xử lý trở nên đơn giản hơn mà vẫn duy trì năng lượng cavitation mạnh mẽ. |
• Chiết xuất đồng thời nhiều mẫu HPLC trong ống ly tâm được đóng kín. • Chuẩn bị mẫu sinh học, dược phẩm hoặc môi trường • Quy trình làm việc yêu cầu siêu âm gián tiếp không gây nhiễm bẩn. |
Ý nghĩa khoa học đối với Hóa học phân tích
Khi hóa học phân tích hướng tới các phương pháp phòng thí nghiệm nhanh hơn và bền vững hơn, chuẩn bị mẫu bằng siêu âm đã trở thành một công nghệ hỗ trợ mạnh mẽ. Siêu âm hỗ trợ phát triển các phương pháp phân tích nhanh với tiêu thụ dung môi thấp hơn, hiệu suất chiết xuất được cải thiện và các thông số xác nhận đáng tin cậy.
Số lượng ngày càng tăng các nghiên cứu về chiết xuất siêu âm cho thấy rằng việc chuẩn bị mẫu HPLC với sự hỗ trợ của siêu âm không chỉ đơn thuần là một phương pháp tiện lợi. – Đây là một phương pháp được khoa học chứng minh giúp nâng cao hiệu suất phân tích. Bằng cách kết hợp kỹ thuật chiết xuất siêu âm với các kỹ thuật sắc ký hiện đại, các phòng thí nghiệm có thể đạt được việc phát hiện đáng tin cậy các chất phân tích hàm lượng thấp trong các ma trận mẫu ngày càng phức tạp.
Quy trình HPLC được tăng cường bằng siêu âm
Với những tiến bộ liên tục trong công nghệ thiết bị phân tích và chuẩn bị mẫu, kỹ thuật chiết xuất siêu âm có khả năng sẽ đóng vai trò quan trọng hơn nữa trong các phòng thí nghiệm sắc ký. Khả năng tối ưu hóa quy trình làm việc, nâng cao chất lượng dữ liệu và giảm tác động đến môi trường của kỹ thuật này hoàn toàn phù hợp với những yêu cầu ngày càng cao của khoa học phân tích hiện đại.
Đối với các nhà hóa học phân tích và phòng thí nghiệm công nghiệp đang tìm cách tối ưu hóa quy trình chuẩn bị mẫu cho HPLC, phương pháp chiết xuất bằng siêu âm cung cấp một giải pháp đã được chứng minh, có khả năng mở rộng và khoa học vững chắc. Bằng cách tích hợp siêu âm vào các quy trình chuẩn bị mẫu thông thường, các phòng thí nghiệm có thể nâng cao đáng kể cả hiệu quả và độ tin cậy của phân tích sắc ký.
Thiết kế, sản xuất và tư vấn – Chất lượng Sản xuất tại Đức
Hielscher ultrasonicators nổi tiếng với chất lượng cao nhất và tiêu chuẩn thiết kế của họ. Mạnh mẽ và hoạt động dễ dàng cho phép tích hợp trơn tru của ultrasonicators của chúng tôi vào các cơ sở công nghiệp. Điều kiện khắc nghiệt và môi trường đòi hỏi dễ dàng được xử lý bởi Hielscher ultrasonicators.
Hielscher Ultrasonics là một công ty được chứng nhận ISO và đặc biệt nhấn mạnh vào ultrasonicators hiệu suất cao có công nghệ tiên tiến và thân thiện với người dùng. Tất nhiên, Hielscher ultrasonicators là CE tuân thủ và đáp ứng các yêu cầu của UL, CSA và RoHs.
Văn học / Tài liệu tham khảo
- M. Rashidipour and R. Heydari (2018): Ultrasonic-Assisted Matrix Solid-Phase Dispersion and High-Performance Liquid Chromatography as an Improved Methodology for Determination of Oleuropein from Olive Leaves. Analytical and Bioanalytical Chemistry Research 52, 2018. 307-316.
- Roudani, A.; Rachid, Mamouni; Nabil, Saffaj; Laknifli, A.; Gharby, Said; Noureddine, El Baraka; Bakka, Abdelhamid; Abdellah, Faouzi (2018): Method validation in the determination of Carbaryl pesticide in water samples using sonication and liquid chromatography-tandem mass spectrometry. JMES 8 (7), 2017. 2409-2420.
- Bimakr M., Ganjloo A., Zarringhalami S., Ansarian E. (2017): Ultrasound-assisted extraction of bioactive compounds from Malva sylvestris leaves and its comparison with agitated bed extraction technique. Food Science and Biotechnology 2017 Nov 30;26(6):1481-1490.
Các câu hỏi thường gặp
HPLC là gì?
Phân tích sắc ký lỏng hiệu suất cao (HPLC) là một kỹ thuật phân tách phân tích được sử dụng để xác định, định lượng và tinh chế các thành phần trong một hỗn hợp. Trong HPLC, pha động lỏng mang các chất phân tích đã hòa tan qua cột được nhồi bằng pha tĩnh dưới áp suất cao. Sự khác biệt trong tương tác giữa các chất phân tích, pha tĩnh và pha động gây ra sự phân tách các hợp chất khi chúng di chuyển qua cột. Các cảm biến như UV-Vis, huỳnh quang hoặc phổ khối đo các hợp chất đã tách, cho phép phân tích định tính và định lượng chính xác.
Các loại sắc ký lỏng là gì?
Sắc ký lỏng có thể được phân loại dựa trên cơ chế tách biệt được sử dụng giữa chất phân tích, pha tĩnh và pha động. Các loại phổ biến nhất bao gồm sắc ký pha đảo, trong đó pha tĩnh không phân cực tách các hợp chất dựa trên tương tác kỵ nước; sắc ký pha thường, sử dụng pha tĩnh phân cực và tách các hợp chất theo độ phân cực; sắc ký trao đổi ion, trong đó pha tĩnh mang điện tích tách các chất phân tích dựa trên tương tác ion; và sắc ký loại trừ kích thước, tách các phân tử theo kích thước thủy động học và trọng lượng phân tử. Các phương pháp chuyên biệt khác bao gồm sắc ký tương tác ái lực và sắc ký tương tác ưa nước (HILIC), nhắm vào các tương tác phân tử cụ thể hoặc các hợp chất phân cực.
Các ống nghiệm nào được sử dụng trong HPLC?
Phân tích HPLC thường sử dụng các ống thủy tinh hoặc polymer nhỏ được thiết kế để chứa mẫu đã chuẩn bị trước khi tiêm vào hệ thống sắc ký. Định dạng phổ biến nhất là ống tự động lấy mẫu 2 mL, tương thích với hầu hết các hệ thống tự động lấy mẫu HPLC. Các ống này thường được làm từ thủy tinh borosilicat để đảm bảo khả năng chống hóa chất và tương tác tối thiểu với dung môi và chất phân tích. Tùy thuộc vào loại mẫu, ống có thể bao gồm các bộ phận chèn cho mẫu thể tích nhỏ, nắp vặn hoặc nắp ép, và màng chắn làm từ các vật liệu như PTFE/silicone để duy trì tính toàn vẹn của mẫu.
Autosampler Vials là gì?
Ống chứa mẫu tự động (Autosampler vials) là các container mẫu chuyên dụng được thiết kế cho hệ thống tiêm tự động trong các thiết bị HPLC và UHPLC. Chúng chứa dung dịch mẫu đã chuẩn bị và được đặt vào khay chứa mẫu tự động của thiết bị, nơi hệ thống tự động rút một thể tích đã định trước để tiêm vào cột sắc ký. Ống chứa mẫu tự động được sản xuất với kích thước chính xác để đảm bảo tương thích với kim lấy mẫu robot và giảm thiểu sự bay hơi, ô nhiễm hoặc hấp phụ của mẫu. Thiết kế của chúng cho phép phân tích có độ chính xác cao và năng suất cao trong các phòng thí nghiệm sắc ký hiện đại.
Các bước trong HPLC là gì?
Quy trình làm việc tiêu chuẩn của sắc ký lỏng hiệu suất cao (HPLC) bao gồm một số bước liên tiếp đảm bảo tách và phát hiện các chất phân tích một cách đáng tin cậy.
- Đầu tiên, quá trình chuẩn bị mẫu được thực hiện để hòa tan chất phân tích, loại bỏ các hạt rắn và thường tách chiết hoặc cô đặc các hợp chất mục tiêu từ ma trận mẫu. Bước này có thể bao gồm các kỹ thuật như lọc, pha loãng hoặc tách chiết, chẳng hạn như tách chiết bằng sóng siêu âm, tách chiết pha rắn hoặc tách chiết pha lỏng.
- Tiếp theo, mẫu đã chuẩn bị được đặt vào ống HPLC và đưa vào bộ nạp mẫu tự động. Bộ nạp mẫu tự động sẽ tiêm một thể tích chính xác của mẫu vào pha động đang chảy.
- Giai đoạn cung cấp pha động sau đó vận chuyển mẫu đã được tiêm qua hệ thống bằng bơm áp suất cao. Pha động vận chuyển các chất phân tích qua cột sắc ký với tốc độ dòng chảy được kiểm soát.
- Bên trong cột sắc ký, quá trình tách biệt diễn ra. Cột sắc ký chứa pha tĩnh, thường là các hạt được đóng gói có tính chất hóa học xác định. Khi các chất phân tích di chuyển qua cột, chúng tương tác khác nhau với pha tĩnh và pha động, dẫn đến việc chúng được rửa giải vào các thời điểm khác nhau.
- Sau khi tách biệt, các hợp chất đi qua một bộ cảm biến, chẳng hạn như bộ cảm biến UV-Vis, bộ cảm biến huỳnh quang hoặc bộ cảm biến phổ khối. Bộ cảm biến đo lường sự hiện diện và nồng độ của các hợp chất được rửa giải và chuyển đổi tín hiệu thành dữ liệu điện tử.
- Cuối cùng, việc thu thập và phân tích dữ liệu được thực hiện bằng phần mềm sắc ký. Hệ thống tạo ra một đồ thị sắc ký, trong đó các đỉnh tương ứng với các hợp chất riêng lẻ. Thời gian lưu giữ của các đỉnh giúp xác định các chất phân tích, trong khi diện tích hoặc chiều cao của các đỉnh cho phép xác định định lượng nồng độ của chúng.
Hielscher Ultrasonics sản xuất homogenizers siêu âm hiệu suất cao từ phòng thí nghiệm đến quy mô công nghiệp.