Biến nạp di truyền vào tế bào thực vật bằng siêu âm

Biến nạp qua trung gian Agrobacterium có hỗ trợ siêu âm (SAAT) là một phương pháp hiệu quả để đưa gen ngoại lai vào tế bào thực vật bằng cách sử dụng Agrobacterium làm tác nhân vận chuyển. Hiện tượng xâm thực do siêu âm gây ra sự tạo lỗ bằng siêu âm, có thể được mô tả là quá trình tạo các vi tổn thương có chủ đích trên mô thực vật. Thông qua các vi tổn thương do siêu âm tạo ra này, DNA và các vectơ DNA có thể được vận chuyển hiệu quả vào chất nền tế bào.

Tạo lỗ bằng siêu âm – Biến nạp tế bào được tăng cường bằng siêu âm

Khi siêu âm tần số thấp (khoảng 20kHz) được áp dụng cho huyền phù tế bào, tác động của hiện tượng xâm thực âm gây ra sự tăng tính thấm tạm thời của màng trong các mô tế bào. Hiệu ứng siêu âm này được gọi là tạo lỗ bằng siêu âm và được sử dụng để chuyển gen vào tế bào hoặc mô.
Các ưu điểm của xử lý siêu âm bắt nguồn từ nguyên lý hoạt động cơ học phi nhiệt, khiến xử lý siêu âm thường linh hoạt hơn và ít phụ thuộc hơn vào loại tế bào. Khả năng ứng dụng đa dạng của phương pháp tạo lỗ bằng siêu âm mở ra khả năng sử dụng thực vật chuyển gen, vốn có tiềm năng đáng kể trong sản xuất sinh học các protein phức tạp dùng để điều trị cho người. Các hệ phản ứng sinh học dựa trên thực vật như vậy có thể dễ dàng được thao tác di truyền, ngăn ngừa nguy cơ nhiễm các tác nhân gây bệnh ở người, không gây tổn hại cho vi khuẩn làm trung gian biến nạp (ví dụ: Agrobacterium), đồng thời là một phương pháp tổng hợp sinh học có chi phí thấp và hiệu quả.

Biến nạp tế bào có hỗ trợ siêu âm

Xử lý siêu âm là kỹ thuật sử dụng sóng siêu âm tần số thấp để khuấy động các hạt trong dung dịch và trộn các dung dịch, qua đó làm tăng tốc độ truyền khối và hòa tan. Đồng thời, xử lý siêu âm có thể loại bỏ khí hòa tan khỏi chất lỏng. Trong biến nạp thực vật, xử lý siêu âm sẽ tạo ra các vi tổn thương trên mô thực vật và tăng cường đưa DNA trần vào tế bào trần thực vật.

Đối với biến nạp di truyền, biến nạp qua trung gian Agrobacterium có hỗ trợ siêu âm (SAAT) là phương pháp được ưu tiên và có hiệu quả cao hơn đáng kể so với việc sử dụng siêu âm để chuyển trực tiếp DNA trần và các vectơ DNA vào tế bào trần. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng biến nạp qua trung gian Agrobacterium có hỗ trợ siêu âm (SAAT) có thể được sử dụng để gây phá vỡ cơ học và tạo tổn thương trên tế bào thực vật nhờ sóng siêu âm và hiện tượng xâm thực âm phát sinh. Một đợt xử lý siêu âm ngắn tạo ra các vi tổn thương trên bề mặt mẫu cấy. Các tế bào bị tổn thương sẽ cho phép Agrobacterium xâm nhập vào phần sâu hơn của mô thực vật, qua đó làm tăng khả năng tế bào thực vật bị nhiễm. Ngoài ra, các hợp chất phenolic được tiết ra giúp tăng cường biến nạp. Các vi tổn thương do siêu âm tạo ra cũng giúp vi khuẩn dễ xâm nhập vào mẫu cấy hơn. SAAT đã được sử dụng thành công để biến nạp di truyền ở các loài thực vật được xem là đặc biệt kháng Agrobacterium.
Tính đơn giản, chi phí thấp và khả năng tăng cường đáng kể quá trình chuyển gen qua trung gian Agrobacterium là những ưu điểm chính của SAAT. Ngoài việc ứng dụng thành công SAAT trong biến nạp Chenopodium rubrum L. và Beta vulgaris L., phương pháp này còn được áp dụng để sản xuất độc tố toàn phần không bền nhiệt tái tổ hợp của Escherichia coli kiểu dại và các tá dược vắc-xin LT đột biến của Escherichia coli trong Nicotiana tabacum; trong đó, hiệu giá IgG đặc hiệu với LT-B toàn thân cao nhất đã được phát hiện ở chim.
(xem Laere và cộng sự, 2016; M. Klimek-Chodacka và R. Baranski, 2014)

Quy trình chung để chuyển gen vào tế bào thực vật thông qua tạo lỗ bằng siêu âm

1. Chuẩn bị vật liệu di truyền: Bắt đầu bằng việc chuẩn bị vật liệu di truyền bạn muốn đưa vào tế bào thực vật. Vật liệu này có thể là DNA plasmid, RNA hoặc các axit nucleic khác.
2. Phân lập tế bào thực vật: Phân lập các tế bào thực vật mà bạn muốn nhắm đến. Tùy thuộc vào thí nghiệm của bạn, các tế bào này có thể được phân lập từ mô thực vật hoặc mẫu nuôi cấy.
3. Huyền phù tế bào: Tạo huyền phù tế bào thực vật trong môi trường hoặc dung dịch đệm phù hợp. Điều này là thiết yếu để đảm bảo các tế bào khỏe mạnh và ở trạng thái thuận lợi cho việc tiếp nhận gen.
4. Thiết lập máy siêu âm của bạn: Chuẩn bị máy siêu âm dạng đầu dò bằng cách cài đặt trước các thông số xử lý siêu âm như biên độ, thời gian, năng lượng và nhiệt độ. Nhúng đầu dò siêu âm vào huyền phù tế bào.
5. Xử lý siêu âm: Bắt đầu quy trình xử lý siêu âm. Dao động nhanh của đầu dò tạo ra các bọt khí xâm thực trong chất lỏng. Các bọt khí này giãn nở và sụp đổ do sóng siêu âm, tạo ra lực cơ học và các dòng chảy vi mô trong huyền phù.
6. Tạo lỗ bằng siêu âm: Lực cơ học và các dòng chảy vi mô do hiện tượng xâm thực tạo ra hình thành các lỗ và khe hở tạm thời trên màng tế bào thực vật. Vật liệu di truyền có trong huyền phù có thể đi vào tế bào thực vật qua các lỗ này.
7. Ủ: Sau khi xử lý tạo lỗ bằng siêu âm, ủ các tế bào thực vật để chúng phục hồi và ổn định màng tế bào. Đây là bước then chốt để đảm bảo tế bào sống sót và chuyển gen thành công.

Chuyển gen thông qua Agrobacterium hoặc liposome

Có hai hình thức phổ biến để chuyển nạp gen vào tế bào thực vật. Các hình thức này sử dụng agrobacterium, một chi vi khuẩn Gram âm, hoặc liposome làm chất mang vật liệu di truyền.

• Tạo lỗ bằng siêu âm qua trung gian Agrobacterium: Agrobacterium tumefaciens là một loài vi khuẩn thường được sử dụng trong kỹ thuật di truyền thực vật. Trong phương pháp này, DNA plasmid chứa gen mong muốn được đưa vào Agrobacterium, sau đó vi khuẩn được trộn với các tế bào thực vật. Huyền phù tế bào được xử lý tạo lỗ bằng siêu âm bằng máy siêu âm dạng đầu dò. Năng lượng siêu âm tăng cường sự chuyển vật liệu di truyền từ Agrobacterium vào tế bào thực vật. Phương pháp này được sử dụng rộng rãi để biến đổi di truyền ở thực vật.
• Tạo lỗ bằng siêu âm qua trung gian liposome: Liposome là các túi có cấu tạo từ lipid, có thể mang vật liệu di truyền. Trong phương pháp này, các liposome chứa DNA plasmid hoặc các axit nucleic khác được trộn với tế bào thực vật. Kỹ thuật tạo lỗ bằng siêu âm sử dụng máy siêu âm dạng đầu dò được áp dụng để tạo thuận lợi cho tế bào thực vật tiếp nhận liposome. Siêu âm phá vỡ các lớp kép lipid của liposome, giải phóng vật liệu di truyền vào tế bào thực vật. Cách tiếp cận này hữu ích cho các nghiên cứu biểu hiện gen tạm thời trong tế bào thực vật.

Lợi ích đã được khoa học chứng minh của phương pháp chuyển gen qua trung gian Agrobacterium có hỗ trợ siêu âm (SAAT)

Phương pháp chuyển gen qua trung gian Agrobacterium có hỗ trợ siêu âm (SAAT) đã được áp dụng cho nhiều loài thực vật. Việc xử lý các mẫu nuôi cấy tế bào thực vật bằng siêu âm trong thời gian ngắn và với cường độ tương đối nhẹ gây ra hiện tượng tạo lỗ bằng siêu âm, sau đó cho phép Agrobacterium thâm nhập sâu với vai trò là tác nhân vận chuyển gen. Dưới đây, bạn có thể đọc các nghiên cứu tiêu biểu chứng minh những tác động có lợi của SAAT.

Chuyển gen ở Ashwagandha có hỗ trợ siêu âm

Nhằm cải thiện hiệu suất chuyển gen ở W. somnifera (được biết đến với tên gọi ashwagandha hoặc anh đào mùa đông), Dehdashti và cộng sự (2016) đã nghiên cứu việc sử dụng acetosyringone (AS) và xử lý siêu âm.
Acetosyringone (AS) được bổ sung ở ba giai đoạn: nuôi cấy Agrobacterium trong môi trường lỏng, gây nhiễm Agrobacterium và đồng nuôi cấy mẫu cấy với Agrobacterium. Việc bổ sung 75 μM AS vào môi trường nuôi cấy lỏng Agrobacterium được xác định là tối ưu để cảm ứng các gen vir.
Việc áp dụng thêm xử lý siêu âm (SAAT) mang lại mức biểu hiện gen cao nhất. Biểu hiện gen gusA ở rễ tơ được xác định là tốt nhất khi lá và đỉnh chồi được xử lý siêu âm lần lượt trong 10 và 20s. Hiệu suất chuyển gen của quy trình cải tiến được ghi nhận lần lượt là 66,5 và 59,5% đối với mẫu cấy lá và đỉnh chồi. Khi so sánh với các quy trình khác, hiệu suất chuyển gen của quy trình cải tiến này được xác định là cao gấp 2,5 lần đối với lá và 3,7 lần đối với đỉnh chồi. Các phân tích Southern blot xác nhận có 1–2 bản sao của gen chuyển gusA trong các dòng W1-W4, trong khi 1–4 bản sao gen chuyển được phát hiện trong dòng W5 được tạo ra bằng quy trình cải tiến.

Ảnh hưởng của thời gian chuyển gen qua trung gian Agrobacterium có hỗ trợ siêu âm (SAAT) đến tần suất chuyển gen của mẫu cấy lá (a) và đỉnh chồi (b) của W. somnifera
(nghiên cứu và hình minh họa: © Dehdashti và cộng sự, 2016)

Chuyển gen ở cây bông có hỗ trợ siêu âm

Hussain và cộng sự (2007) chứng minh những tác động có lợi của việc chuyển gen ở cây bông có hỗ trợ siêu âm. Hiện tượng xâm thực âm do siêu âm tần số thấp gây ra tạo các vi tổn thương trên và dưới bề mặt mô thực vật (tạo lỗ màng bằng siêu âm), đồng thời cho phép Agrobacterium di chuyển sâu hơn và xuyên khắp toàn bộ mô thực vật. Cách tạo tổn thương này làm tăng khả năng gây nhiễm các tế bào thực vật nằm sâu hơn trong mô. Để đánh giá hiệu suất chuyển gen của SAAT, biểu hiện gen GUS đã được đo. Hệ thống chỉ thị GUS là một hệ thống gen chỉ thị, đặc biệt hữu ích trong sinh học phân tử thực vật và vi sinh học. Khi điều chỉnh các thông số SAAT khác nhau, biểu hiện tạm thời của GUS ở cây bông sử dụng phôi trưởng thành làm mẫu cấy đã được tăng cường đáng kể. GUS được phát hiện lần đầu sau khi ủ mẫu cấy 24h và đến 48h, biểu hiện GUS rất mạnh, đóng vai trò là một chỉ dấu hữu ích cho việc chuyển gen thành công ở mẫu cấy bông sau khi chuyển gen qua trung gian Agrobacterium có hỗ trợ siêu âm (SAAT). Khi so sánh các kỹ thuật chuyển gen khác nhau (cụ thể là bắn gen, Agro, BAAT, SAAT), chuyển gen qua trung gian Agrobacterium có hỗ trợ siêu âm (SAAT) cho kết quả chuyển gen tốt nhất, vượt xa các kỹ thuật còn lại.

Lựa chọn quy trình chuyển gen dựa trên biểu hiện tạm thời của GUS. Chuyển gen qua trung gian Agrobacterium có hỗ trợ siêu âm (SAAT) cho thấy mức biểu hiện tạm thời cao hơn đáng kể.
(nghiên cứu và hình minh họa: © Hussain và cộng sự, 2007)

Các giải pháp siêu âm hiệu suất cao để tạo lỗ màng bằng siêu âm và thực hiện SAAT

Hielscher Ultrasonics có kinh nghiệm lâu năm trong việc phát triển và sản xuất các thiết bị siêu âm hiệu suất cao cho phòng thí nghiệm, cơ sở nghiên cứu cũng như sản xuất công nghiệp với năng suất xử lý rất cao. Trong lĩnh vực vi sinh học và khoa học sự sống, Hielscher cung cấp nhiều giải pháp để đáp ứng các yêu cầu khác nhau đối với từng loại mô cụ thể và phương pháp xử lý tương ứng. Để xử lý siêu âm đồng thời nhiều mẫu, Hielscher cung cấp UIP400MTP cho đĩa đa giếng, VialTweeter để xử lý siêu âm tối đa 10 lọ (ví dụ: ống Eppendorf) hoặc CupHorn siêu âm. Các thiết bị siêu âm dạng đầu dò có công suất từ 50 đến 400 watt được cung cấp làm máy đồng nhất mẫu trong phòng thí nghiệm, trong khi các hệ thống công nghiệp có dải công suất từ 500 watt đến 16kW.
Vui lòng liên hệ với chúng tôi và cho chúng tôi biết về ứng dụng cũng như các yêu cầu quy trình của bạn. Đội ngũ nhân viên giàu kinh nghiệm của chúng tôi rất sẵn lòng đề xuất thiết bị siêu âm phù hợp nhất cho quy trình sinh học của bạn.
Bảng dưới đây cho biết năng lực xử lý gần đúng của các thiết bị siêu âm của chúng tôi: