Biến đổi di truyền trong tế bào thực vật bằng cách sử dụng siêu âm

Chuyển đổi qua trung gian Agrobacterium hỗ trợ sonication (SAAT) là một phương pháp hiệu quả để lây nhiễm tế bào thực vật với các gen lạ sử dụng Agrobacterium làm chất vận chuyển. Siêu âm xâm thực gây ra sonoporation, có thể được mô tả là vết thương vi mô thực vật có mục tiêu. Thông qua những vết thương siêu âm này, DNA và vectơ DNA có thể được vận chuyển hiệu quả vào ma trận tế bào.

Sonoporation – Chuyển đổi tế bào tăng cường siêu âm

Khi siêu âm tần số thấp (khoảng 20kHz) được áp dụng cho huyền phù tế bào, tác động của xâm thực âm thanh gây ra sự thấm màng thoáng qua trên các mô tế bào. Hiệu ứng siêu âm này được gọi là sonoporation và được sử dụng để chuyển gen vào tế bào hoặc mô.
Ưu điểm của siêu âm là dựa trên nguyên lý làm việc cơ học không nhiệt của nó, làm cho quá trình siêu âm thường linh hoạt hơn và ít phụ thuộc vào các loại tế bào. Ứng dụng linh hoạt của sonoporation mở ra khả năng sử dụng các loại cây chuyển gen, có tiềm năng đáng kể trong sản xuất sinh học các protein điều trị phức tạp của con người. Các lò phản ứng sinh học có nguồn gốc thực vật như vậy có thể dễ dàng thao tác di truyền, ngăn ngừa khả năng nhiễm mầm bệnh ở người, không làm hỏng vi khuẩn trung gian biến đổi (ví dụ: Agrobacterium) và là một phương pháp tổng hợp sinh học không tốn kém, hiệu quả.

Chuyển đổi tế bào hỗ trợ siêu âm

Siêu âm là kỹ thuật áp dụng sóng siêu âm tần số thấp để khuấy động các hạt trong dung dịch, trộn dung dịch, từ đó làm tăng tốc độ truyền và hòa tan khối lượng. Đồng thời, siêu âm có thể loại bỏ khí hòa tan khỏi chất lỏng. Trong quá trình biến đổi thực vật, siêu âm sẽ gây ra sự hình thành các vết thương nhỏ trên mô thực vật và tăng cường việc cung cấp DNA trần vào nguyên sinh thực vật.

Đối với chuyển đổi gen, Biến đổi qua trung gian vi khuẩn nông nghiệp hỗ trợ Sonication (SAAT) là phương pháp được ưa thích và có hiệu quả cao hơn đáng kể so với siêu âm được sử dụng để chuyển DNA trần và vectơ DNA trực tiếp vào protoplast. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng quá trình biến đổi qua trung gian Agrobacterium hỗ trợ siêu âm (SAAT) có thể được sử dụng để gây ra sự gián đoạn cơ học và hình thành vết thương trên tế bào thực vật bằng sóng siêu âm và tạo ra sự xâm thực âm thanh. Điều trị siêu âm ngắn tạo ra các vết thương nhỏ trên bề mặt của ngoại trứng. Vì các tế bào bị thương sẽ cho phép Agrobacterium xâm nhập vào phần sâu hơn của mô thực vật, do đó làm tăng khả năng tế bào thực vật bị nhiễm bệnh. Ngoài ra, các hợp chất phenolic tiết ra tăng cường sự biến đổi. Các vết thương siêu âm được tạo ra bằng siêu âm làm cho sự xâm nhập của vi khuẩn cũng khả thi hơn. SAAT đã được sử dụng thành công để chuyển đổi gen ở các loài thực vật đặc biệt được coi là kháng Agrobacterium.
Là một phương pháp rất đơn giản và không tốn kém, cũng như tăng cường đáng kể chuyển gen qua trung gian Agrobacterium là những ưu điểm chính của SAAT. Ngoài việc ứng dụng thành công SAAT trong quá trình biến đổi Chenopodium rubrum L. và Beta vulgaris L., phương pháp này cũng đã được áp dụng trong sản xuất chất độc tố holotoxin không ổn định nhiệt kiểu hoang dã Escherichia coli tái tổ hợp và thuốc bổ trợ vắc-xin LT đột biến Escherichia coli ở Nicotiana tabacum, trong đó hiệu giá IgG đặc hiệu LT-B toàn thân cao nhất được phát hiện ở gia cầm.
(xem Laere và cộng sự, 2016; M. Klimek-Chodacka và R. Baranski, 2014)

Quy trình chung để chuyển gen thông qua sonoporation trong tế bào thực vật

1. Chuẩn bị vật liệu di truyền: Bắt đầu bằng cách chuẩn bị vật liệu di truyền mà bạn muốn đưa vào tế bào thực vật. Đây có thể là DNA plasmid, RNA hoặc các axit nucleic khác.
2. Phân lập tế bào thực vật: Cô lập các tế bào thực vật mà bạn muốn nhắm mục tiêu. Tùy thuộc vào thí nghiệm của bạn, các tế bào này có thể được phân lập từ các mô thực vật hoặc nuôi cấy.
3. Huyền phù tế bào: Treo các tế bào thực vật trong môi trường hoặc đệm thích hợp. Điều này là cần thiết để đảm bảo rằng các tế bào khỏe mạnh và ở trạng thái thuận lợi cho việc hấp thụ gen.
4. Thiết lập Bộ siêu âm của bạn: Chuẩn bị máy siêu âm loại đầu dò của bạn bằng cách siêu âm các thông số cài đặt trước như biên độ, thời gian, năng lượng và nhiệt độ. Nhúng đầu dò siêu âm vào huyền phù tế bào.
5. Sonication: Bắt đầu quy trình siêu âm. Sự dao động nhanh chóng của đầu dò tạo ra bọt xâm thực trong chất lỏng. Những bong bóng này giãn nở và sụp đổ do sóng siêu âm, tạo ra các lực cơ học và vi luồng trong hệ thống treo.
6. Sonoporation: Các lực cơ học và vi luồng được tạo ra bởi sự xâm thực tạo ra các lỗ rỗng và lỗ hổng tạm thời trên màng của tế bào thực vật. Vật liệu di truyền có trong huyền phù có thể xâm nhập vào tế bào thực vật thông qua các lỗ chân lông này.
7. Ấp ủ: Sau khi xử lý sonoporation, ủ các tế bào thực vật để chúng phục hồi và ổn định màng. Đây là một bước quan trọng để đảm bảo sự tồn tại của tế bào và chuyển gen thành công.

Chuyển gen qua Agrobacterium hoặc Liposome

Có hai dạng phổ biến để truyền tế bào thực vật. Họ sử dụng agrobacterium, một chi vi khuẩn Gram âm hoặc liposome làm chất mang vật liệu di truyền.

• Sonoporation qua trung gian Agrobacterium: Agrobacterium tumefaciens là một loại vi khuẩn thường được sử dụng trong kỹ thuật di truyền thực vật. Trong phương pháp này, DNA plasmid có chứa gen mong muốn được đưa vào Agrobacterium, sau đó được trộn với tế bào thực vật. Huyền phù tế bào được sonoporation bằng cách sử dụng máy siêu âm kiểu đầu dò. Năng lượng siêu âm tăng cường sự chuyển vật liệu di truyền từ Agrobacterium sang tế bào thực vật. Phương pháp này được sử dụng rộng rãi để biến đổi gen của cây trồng.
• Sonoporation qua trung gian liposome: Liposome là túi gốc lipid có thể mang vật liệu di truyền. Trong phương pháp này, liposome chứa DNA plasmid hoặc các axit nucleic khác được trộn với tế bào thực vật. Sonoporation sử dụng máy siêu âm kiểu đầu dò được sử dụng để tạo điều kiện thuận lợi cho sự hấp thụ liposome của các tế bào thực vật. Siêu âm phá vỡ các lớp kép lipid của liposome, giải phóng vật liệu di truyền vào tế bào thực vật. Cách tiếp cận này rất hữu ích cho các nghiên cứu biểu hiện gen thoáng qua trong tế bào thực vật.

Lợi ích đã được khoa học chứng minh của quá trình chuyển đổi qua trung gian Agrobacterium hỗ trợ Sonication (SAAT)

Chuyển đổi qua trung gian vi khuẩn nông nghiệp hỗ trợ sonication (SAAT) đã được áp dụng cho nhiều loài thực vật. Xử lý siêu âm ngắn và tương đối nhẹ đối với nuôi cấy tế bào thực vật gây ra sonoporation, sau đó cho phép Agrobacterium thâm nhập sâu như chất vận chuyển gen. Dưới đây bạn có thể đọc các nghiên cứu mẫu mực chứng minh tác dụng có lợi của SAAT.

Sự biến đổi hỗ trợ siêu âm của Ashwagandha

Để cải thiện hiệu quả biến đổi ở W. somnifera (được gọi là ashwagandha hoặc anh đào mùa đông), Dehdashti và các đồng nghiệp (2016) đã điều tra việc sử dụng acetosyringone (AS) và siêu âm.
Acetosyringone (AS) được thêm vào trong ba giai đoạn: nuôi cấy lỏng Agrobacterium, nhiễm Agrobacterium và đồng nuôi cấy ngoại cây với Agrobacterium. Việc bổ sung 75 μM AS vào nuôi cấy lỏng Agrobacterium được phát hiện là tối ưu cho việc cảm ứng các gen vir.
Ứng dụng bổ sung của sonication (SAAT) dẫn đến biểu hiện gen cao nhất. Biểu hiện gen gusA ở rễ lông được tìm thấy là tốt nhất khi lá và đầu chồi được sonicated lần lượt trong 10 và 20 giây. Hiệu quả chuyển đổi của giao thức cải tiến được ghi nhận lần lượt là 66,5% và 59,5% trong trường hợp đầu lá và đầu chồi. Khi so sánh với các giao thức khác, hiệu quả chuyển đổi của giao thức cải tiến này được tìm thấy cao hơn 2,5 lần đối với lá và gấp 3,7 lần đối với mẹo chụp. Các phân tích blot phía nam đã xác nhận 1-2 bản sao của gen chuyển gen gusA trong các dòng W1-W4, trong khi 1-4 bản sao chuyển gen được phát hiện trong dòng W5 được tạo ra bởi giao thức cải tiến.

Ảnh hưởng của thời gian chuyển đổi qua trung gian Agrobacterium (SAAT) có sự hỗ trợ siêu âm đối với tần suất biến đổi của lá W. somnifera (a) và đầu chồi (b) ngoại cây(nghiên cứu và đồ họa: © Dehdashti et al., 2016)

Biến đổi bông có sự hỗ trợ siêu âm

Hussain và cộng sự (2007) chứng minh những tác dụng có lợi của việc chuyển đổi bông hỗ trợ siêu âm. Sự xâm thực âm thanh do siêu âm tần số thấp tạo ra các vết thương nhỏ trên và dưới bề mặt mô thực vật (sonoporation) và cho phép Agrobacterium di chuyển sâu hơn và hoàn toàn khắp mô thực vật. Cách làm tổn thương này làm tăng khả năng lây nhiễm các tế bào thực vật nằm sâu hơn trong mô. Để đánh giá hiệu quả biến đổi của SAAT, biểu hiện gen GUS đã được đo. Hệ thống báo cáo GUS là một hệ thống gen báo cáo, đặc biệt hữu ích trong sinh học phân tử thực vật và vi sinh. Điều chỉnh các thông số SAAT khác nhau, biểu hiện thoáng qua GUS trong bông sử dụng phôi trưởng thành làm ngoại cây được tăng cường đáng kể. GUS được phát hiện lần đầu tiên 24 giờ sau khi ấp ngoại lai và đến 48 giờ, biểu hiện GUS rất mạnh, đóng vai trò là một chỉ số hữu ích về sự biến đổi thành công của ngoại cây bông sau khi siêu âm hỗ trợ chuyển đổi qua trung gian Agrobacterium (SAAT). So sánh các kỹ thuật chuyển đổi khác nhau (cụ thể là biolistic, Agro, BAAT, SAAT), chuyển đổi qua trung gian Agrobacterium hỗ trợ sonication (SAAT) cho thấy cho đến nay kết quả chuyển đổi tốt nhất.

Lựa chọn quy trình biến đổi trên cơ sở biểu hiện thoáng qua của GUS. Chuyển đổi qua trung gian Agrobacterium hỗ trợ sóng âm (SAAT) cho thấy biểu hiện thoáng qua cao hơn đáng kể.(nghiên cứu và đồ họa: © Hussain và cộng sự, 2007)

Giải pháp siêu âm hiệu suất cao cho Sonoporation và SAAT

Hielscher Ultrasonics có kinh nghiệm lâu năm trong việc phát triển và sản xuất máy siêu âm hiệu suất cao cho các phòng thí nghiệm, cơ sở nghiên cứu cũng như sản xuất công nghiệp với thông lượng rất cao. Đối với vi sinh và khoa học đời sống, Hielscher cung cấp các giải pháp khác nhau để đáp ứng các yêu cầu khác nhau cần thiết cho các mô cụ thể và phương pháp điều trị của chúng. Để siêu âm đồng thời nhiều mẫu, Hielscher cung cấp UIP400MTP cho các tấm đa giếng, VialTweeter để siêu âm lên đến 10 lọ (ví dụ: ống Eppendorf) hoặc siêu âm CupHorn. Máy siêu âm kiểu đầu dò có sẵn từ 50 đến 400 watt dưới dạng máy đồng nhất trong phòng thí nghiệm, trong khi các hệ thống công nghiệp bao gồm phạm vi công suất từ 500 watt đến 16kW.
Vui lòng liên hệ với chúng tôi và cho chúng tôi biết về các yêu cầu về đơn đăng ký và quy trình của bạn. Đội ngũ nhân viên giàu kinh nghiệm của chúng tôi sẽ sẵn lòng giới thiệu máy siêu âm phù hợp nhất cho quá trình sinh học của bạn.
Bảng dưới đây cung cấp cho bạn một dấu hiệu về khả năng xử lý gần đúng của ultrasonicators của chúng tôi: