Sonication-Assisted Agrobacterium-Mediated Transformation (SAAT) là một phương pháp hiệu quả để lây nhiễm tế bào thực vật với các gen lạ sử dụng Agrobacterium làm chất vận chuyển. Siêu âm cavitation gây ra sonoporation, mà có thể được mô tả như là mục tiêu vết thương vi mô của thực vật. Thông qua các ultrasonically tạo ra vết thương vi mô, DNA và DNA vectors có thể được vận chuyển hiệu quả vào ma trận tế bào.

sonoporation – Ultrasonically tăng cường biến đổi tế bào

Khi siêu âm tần số thấp (khoảng 20kHz) được áp dụng cho huyền phù tế bào, ảnh hưởng của cavitation âm thanh gây ra sự thẩm thấu màng thoáng qua trên các mô tế bào. Hiệu ứng siêu âm này được gọi là sonoporation và được sử dụng để chuyển gen vào các tế bào hoặc mô.
Ưu điểm của ultrasonication dựa trên nguyên tắc làm việc cơ học không nhiệt của nó, mà làm cho sonication thường linh hoạt hơn và ít phụ thuộc vào các loại tế bào. Ứng dụng linh hoạt của sonoporation mở ra khả năng sử dụng thực vật biến đổi gen, có tiềm năng đáng kể trong sản xuất sinh học của các protein trị liệu phức tạp của con người. Các lò phản ứng sinh học dựa trên thực vật như vậy có thể dễ dàng thao túng di truyền, ngăn ngừa ô nhiễm tiềm ẩn với mầm bệnh ở người, không làm hỏng vi khuẩn trung gian biến đổi (ví dụ: Agrobacterium) và là một phương pháp tổng hợp sinh học rẻ tiền, hiệu quả.

Siêu âm hỗ trợ chuyển đổi tế bào

Sonication là một kỹ thuật áp dụng sóng siêu âm tần số thấp để khuấy trộn các hạt trong dung dịch, để trộn các giải pháp, do đó làm tăng tốc độ truyền khối lượng và hòa tan. Đồng thời, sonication có thể loại bỏ khí hòa tan từ chất lỏng. Trong biến đổi thực vật, sonication sẽ gây ra sự hình thành các microwound trên mô thực vật và tăng cường việc cung cấp DNA trần trụi vào nguyên sinh chất thực vật.

Đối với biến đổi di truyền, Sonication-Assisted Agrobacterium-qua trung gian biến đổi (SAAT) là phương pháp ưa thích và có hiệu quả cao hơn đáng kể so với sonication được sử dụng để chuyển dna trần truồng và vectơ DNA trực tiếp vào nguyên sinh chất. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng sonication hỗ trợ chuyển đổi qua trung gian Agrobacterium (SAAT) có thể được sử dụng để gây ra sự gián đoạn cơ học và hình thành các vết thương trên tế bào thực vật bằng sóng siêu âm và cavitation âm thanh kết quả. Một điều trị siêu âm ngắn tạo ra các vết thương vi mô trên bề mặt của explants. Vì các tế bào bị thương sẽ cho phép sự xâm nhập của Agrobacterium vào phần sâu hơn của các mô thực vật, do đó làm tăng khả năng tế bào thực vật bị nhiễm bệnh. Ngoài ra, các hợp chất phenolic được tiết ra giúp tăng cường sự biến đổi. Các vết thương siêu âm tạo ra vi mô làm cho sự xâm nhập explant của vi khuẩn cũng khả thi hơn. SAAT đã được sử dụng thành công để biến đổi gen ở các loài thực vật đặc biệt được coi là kháng vi khuẩn Agrobacterium.
Là một phương pháp rất đơn giản và rẻ tiền, cũng như sự tăng cường đáng kể của việc chuyển gen qua trung gian Agrobacterium là những lợi thế chính của SAAT. Ngoài việc áp dụng thành công SAAT trong việc chuyển đổi Chenopodium rubrum L. và Beta Vulgaris L., phương pháp này cũng đã được áp dụng trong sản xuất các chất bổ trợ vắc xin LT đột biến LT loại Escherichia coli tái tổ hợp Escherichia coli ở Nicotiana tabacum, trong đó các titres IgG đặc hiệu LT-B có hệ thống cao nhất đã được phát hiện ở chim.
(cf. Laere và cộng sự, 2016; M. Klimek-Chodacka và R. Baranski, 2014)

Quy trình chung để chuyển gen thông qua sự sonoporation trong tế bào thực vật

1. Chuẩn bị vật liệu di truyền: Bắt đầu bằng cách chuẩn bị vật liệu di truyền bạn muốn đưa vào tế bào thực vật. Đây có thể là DNA plasmid, RNA hoặc các axit nucleic khác.
2. Phân lập tế bào thực vật: Cô lập các tế bào thực vật bạn muốn nhắm mục tiêu. Tùy thuộc vào thí nghiệm của bạn, các tế bào này có thể được phân lập từ các mô thực vật hoặc nuôi cấy.
3. Đình chỉ tế bào: Đình chỉ các tế bào thực vật trong một môi trường hoặc bộ đệm thích hợp. Điều này rất cần thiết để đảm bảo rằng các tế bào khỏe mạnh và ở trạng thái thuận lợi cho sự hấp thu gen.
4. Thiết lập Sonicator của bạn: Chuẩn bị sonicator loại đầu dò của bạn bằng các thông số cài đặt trước sonication như biên độ, thời gian, năng lượng và nhiệt độ. Ngâm đầu dò siêu âm vào hệ thống treo tế bào.
5. Sonication Bắt đầu thủ tục sonication. Sự dao động nhanh chóng của đầu dò tạo ra bong bóng xâm thực trong chất lỏng. Những bong bóng này mở rộng và sụp đổ do sóng siêu âm, tạo ra lực cơ học và vi dòng trong hệ thống treo.
6. Sonoporation: Các lực cơ học và vi dòng được tạo ra bởi cavitation tạo ra lỗ chân lông tạm thời và lỗ trên màng của tế bào thực vật. Vật liệu di truyền có trong huyền phù có thể xâm nhập vào tế bào thực vật thông qua các lỗ chân lông này.
7. Thời gian ủ bệnh: Sau khi xử lý sonoporation, ủ các tế bào thực vật để cho phép chúng phục hồi và ổn định màng của chúng. Đây là một bước quan trọng để đảm bảo sự tồn tại của tế bào và chuyển gen thành công.

Chuyển gen qua Agrobacterium hoặc Liposome

Có hai dạng phổ biến để truyền tế bào thực vật. Họ sử dụng agrobacterium, một chi vi khuẩn gram âm, hoặc liposome làm vật liệu di truyền.

• Sonoporation qua trung gian Agrobacterium: Agrobacterium tumefaciens là một loại vi khuẩn thường được sử dụng trong kỹ thuật di truyền thực vật. Trong phương pháp này, DNA plasmid chứa gen mong muốn được đưa vào Agrobacterium, sau đó được trộn với tế bào thực vật. Hệ thống treo tế bào phải chịu sự sonoporation bằng cách sử dụng sonicator kiểu đầu dò. Năng lượng siêu âm tăng cường việc chuyển vật liệu di truyền từ Agrobacterium sang tế bào thực vật. Phương pháp này được sử dụng rộng rãi cho việc biến đổi gen của thực vật.
• Sonoporation qua trung gian liposome: Liposome là các túi dựa trên lipid có thể mang vật liệu di truyền. Trong phương pháp này, liposome được nạp với DNA plasmid hoặc các axit nucleic khác được trộn với tế bào thực vật. Sonoporation sử dụng sonicator kiểu đầu dò được sử dụng để tạo điều kiện cho sự hấp thu liposome của tế bào thực vật. Siêu âm phá vỡ hai lớp lipid của liposome, giải phóng vật liệu di truyền vào tế bào thực vật. Cách tiếp cận này rất hữu ích cho các nghiên cứu biểu hiện gen thoáng qua trong tế bào thực vật.

Lợi ích đã được khoa học chứng minh của quá trình biến đổi qua trung gian agrobacterium hỗ trợ Sonication (SAAT)

Sonication-Assisted Agrobacterium-Mediated Transformation (SAAT) đã được áp dụng cho nhiều loài thực vật. Một điều trị siêu âm ngắn và tương đối nhẹ của nuôi cấy tế bào thực vật gây ra sonoporation, mà sau đó cho phép một sự xâm nhập sâu của Agrobacterium như là người vận chuyển gen. Dưới đây bạn có thể đọc các nghiên cứu mẫu mực chứng minh tác dụng có lợi của SAAT.

Ultrasonically hỗ trợ chuyển đổi của Ashwagandha

Để cải thiện hiệu quả biến đổi trong W. somnifera (được gọi là ashwagandha hoặc anh đào mùa đông), Dehdashti và các đồng nghiệp (2016) đã điều tra việc sử dụng acetosyringone (AS) và sonication.
Acetosyringone (AS) đã được thêm vào trong ba giai đoạn: Nuôi cấy chất lỏng Agrobacterium, nhiễm vi khuẩn Agrobacterium và đồng nuôi cấy explants với Agrobacterium. Việc bổ sung 75 μM AS vào nuôi cấy chất lỏng Agrobacterium được phát hiện là tối ưu để tạo ra các gen vir.
Các ứng dụng bổ sung của sonication (SAAT) dẫn đến biểu hiện gen cao nhất. Biểu hiện gen gusA ở rễ có lông được tìm thấy là tốt nhất khi lá và đầu chồi được sonicated lần lượt trong 10 và 20s. Hiệu quả chuyển đổi của giao thức cải tiến được ghi nhận lần lượt là 66,5 và 59,5% trong trường hợp người chụp lá và đầu chồi. Khi so sánh với các giao thức khác, hiệu quả chuyển đổi của giao thức cải tiến này được phát hiện là cao hơn 2,5 lần đối với lá và gấp 3,7 lần đối với các mẹo chụp. Các phân tích blot miền Nam đã xác nhận 1-2 bản sao của quá trình chuyển gen gusA trong các dòng W1-W4, trong khi các bản sao transgene 1-4 được phát hiện trong dòng W5 được tạo bởi giao thức cải tiến.

Ảnh hưởng của thời gian biến đổi qua trung gian Agrobacterium hỗ trợ sonication (SAAT) đến tần số biến đổi của lá W. somnifera (a) và đầu chồi (b) explants
(nghiên cứu và đồ họa: © Dehdashti và cộng sự, 2016)

Ultrasonically hỗ trợ chuyển đổi của bông

Hussain et al. (2007) chứng minh những tác động có lợi của sự biến đổi bông hỗ trợ sonication. Cavitation âm thanh gây ra bởi siêu âm tần số thấp tạo ra các vết thương vi mô trên và dưới bề mặt của mô thực vật (sonoporation) và cho phép Agrobacterium di chuyển sâu hơn và hoàn toàn khắp các mô thực vật. Thời trang gây thương tích này làm tăng xác suất lây nhiễm các tế bào thực vật nằm sâu hơn trong mô. Để đánh giá hiệu quả biến đổi của SAAT, biểu hiện gen GUS đã được đo lường. Hệ thống phóng viên GUS là một hệ thống gen phóng viên, đặc biệt hữu ích trong sinh học phân tử thực vật và vi sinh vật học. Điều chỉnh các thông số SAAT khác nhau, biểu hiện thoáng qua GUS trong bông bằng cách sử dụng phôi trưởng thành khi explant được tăng cường đáng kể. GUS lần đầu tiên được phát hiện 24h sau khi ủ các explants và đến 48h, biểu hiện GUS rất dữ dội, phục vụ như một chỉ số hữu ích về sự biến đổi thành công của bông explant sau khi sonication hỗ trợ chuyển đổi qua trung gian Agrobacterium (SAAT). Việc so sánh các kỹ thuật biến đổi khác nhau (cụ thể là biolistic, Agro, BAAT, SAAT), biến đổi qua trung gian Agrobacterium hỗ trợ sonication (SAAT) cho thấy cho đến nay kết quả tốt nhất của quá trình biến đổi.

Lựa chọn quy trình chuyển đổi trên cơ sở biểu hiện thoáng qua của GUS. Sự biến đổi qua trung gian Agrobacterium được hỗ trợ bởi Sonication (SAAT) cho thấy một biểu hiện thoáng qua cao hơn đáng kể.
(nghiên cứu và đồ họa: © Hussain và cộng sự, 2007)

Giải pháp siêu âm hiệu suất cao cho sonoporation và SAAT

Hielscher Ultrasonics là kinh nghiệm lâu năm trong việc phát triển và sản xuất ultrasonicators hiệu suất cao cho các phòng thí nghiệm, cơ sở nghiên cứu cũng như sản xuất công nghiệp với thông lượng rất cao. Đối với vi sinh và khoa học đời sống, Hielscher cung cấp các giải pháp khác nhau để đáp ứng các yêu cầu khác nhau cần thiết cho các mô cụ thể và phương pháp điều trị của họ. Đối với ultrasonication đồng thời của nhiều mẫu Hielscher cung cấp UIP400MTP cho các tấm multiwell, VialTweeter cho sonication của lên đến 10 lọ (ví dụ: ống Eppendorf) hoặc CupHorn siêu âm. Ultrasonicators loại thăm dò có sẵn từ 50 đến 400 watt như homogenizers phòng thí nghiệm, trong khi các hệ thống công nghiệp bao gồm phạm vi công suất từ 500 watt đến 16kW.
Vui lòng liên hệ với chúng tôi và cho chúng tôi biết về các yêu cầu về đơn đăng ký và quy trình của bạn. Đội ngũ nhân viên giàu kinh nghiệm của chúng tôi sẽ vui mừng giới thiệu ultrasonicator phù hợp nhất cho quá trình sinh học của bạn.
Bảng dưới đây cho bạn một dấu hiệu về khả năng xử lý gần đúng của máy siêu âm: