Ультразвукове виробництво високоочищених шизофілланових бета-глюканів

Шизофіллан – це грибний β-глюкан з імуномодулюючими властивостями. Для високоактивних медичних ефектів шизофіллан повинен мати низьку молекулярну масу, щоб демонструвати покращену біодоступність. Було доведено, що ультразвукова обробка знижує молекулярну масу шизофіллану. Як надійний та ефективний метод, ультразвукова обробка може бути легко застосована для виробництва шизофіллану з низькою молекулярною масою.

Гриби Schizophyllum та ультразвукова екстракція бета-глюканів

Види грибів Schizophyllum ростуть у природі на відмерлих деревах після дощових сезонів. Плодові тіла збирають у наступний сухий сезон. Види Schizophyllum багаті на біохімічні сполуки, такі як глюкани, і тому їх споживають особливо в тропічних країнах як їжу та ліки. Через свої імуномодулюючі, протигрибкові, протипухлинні та противірусні властивості Schizophyllum commune, також відомий як гриб розщеплений (Splitgill), привернув увагу біотехнологічних та фармацевтичних компаній.
Полісахарид шизофіллан, також відомий як сизофіран, соніфілан або сизофілан, є основним β-глюканом, знайденим у грибах Schizophyllum, які пропонують високоефективний біоактивний β-глюкан шизофіллан.
Гриби Schizophyllum commune ростуть у природі на деревах, міцелій також можна вирощувати в ферментаційному середовищі. Для фармацевтичних та косметичних застосувань шизофіллан з низькою молекулярною масою є значно більш ефективним, ніж шизофіллан з високою молекулярною масою. Це пов’язано з тим, що шизофіллан з низькою молекулярною масою демонструє значно кращу біодоступність та швидкість абсорбції. Додатково, шизофіллан з високою молекулярною масою часто є проблематичним у застосуваннях, оскільки він призводить до високої в’язкості його водних розчинів.
Ультразвукове зменшення розміру є високоефективною та надійною технікою для зниження молекулярної маси шизофіллану, тим самим підвищуючи якість молекули β-глюкану.

Протокол виробництва шизофіллану з низькою молекулярною масою

Оскільки шизофіллан демонструє радикально кращу біодоступність та властивості застосування, дослідницька група Смірнова вивчала ультразвукову обробку для розщеплення та зменшення розміру молекули β-глюкану шизофіллану.

Ультразвукова обробка шизофіллану

β-1.3(1.6)-глюкан шизофіллан (SPG) був вироблений шляхом зануреного культивування гриба S. commune в біореакторі з використанням сахарози як субстрату.
Після закінчення культивування культуральну рідину розбавляли демінералізованою водою до концентрації шизофіллану 2 г/л та обробляли ультразвуком за допомогою Ультразвукового процесора UIP2000hdT (Hielscher Ultrasonics GmbH, Німеччина) у режимі рециркуляції за наступних параметрів та умов: об’ємна витрата середовища 50 mL/s, частота 20 kHz, потужність 2000 W, тип сонотрода BS2d22, тип бустера B2-1.4 та амплітуда 100%. Температура культуральної рідини на початку ультразвукової обробки становила 25°C. Ультразвуково оброблену культуральну рідину (специфічний вхід енергії 100 Ws/mL) фільтрували через глибинний фільтр Seitz HS800 під тиском 1,5 bar при 40°C. Ультразвуково оброблений шизофіллан (uSPG) для хімічної характеристики осаджували з фільтрату потрійною кількістю ізопропілового спирту при лабораторній температурі та сушили при 60°C протягом 12h. Розчини uSPG для імунологічних досліджень готували наступним чином: (1) фільтрат ультразвуково обробленої культуральної рідини діалізували через касету 0,1m2 Pall Centramate T-series PES (межа відсіювання 100 kDa) при 0,8 bar, діалізування продовжували, поки електропровідність ретентату не становила 20 μS/cm; (2) розчин концентрували діалізуванням до концентрації uSPG 1 g/L та стерилізували автоклавуванням при 120°C/20 min. Денатурований uSPG готували аналогічним чином, за винятком того, що до фільтрату культуральної рідини додавали NaOH у концентрації 0,2 M, та лужний розчин інкубували протягом 30 min при лабораторній температурі перед діалізуванням.

Аналітичні методи

Вихід міцелію оцінювали гравіметрично: культуральну рідину розбавляли водою у співвідношенні 1:4, центрифугували при 10 000 × g при 25°C для 20 min, осад промивали потрійною кількістю води, сушили при 60°C і зважували. Шизофіллан осадили з надосадкової рідини потрійною кількістю ізопропілового спирту, сушили при 60°C для 24h і визначали його вихід гравіметрично. pO2 у культуральній рідині вимірювали за допомогою оптичного зонда Hamilton-Visiferm DO 120 (Hamilton, Switzerland).
Динамічну в’язкість культуральної рідини вимірювали на HAAKE Visco Tester 6L зі шпинделями 1L і 2L при 4°C і швидкості обертання 30 rpm. Швидкість фільтрації розраховували за часом фільтрації 500 mL культуральної рідини через глибинний фільтр Seitz HS800 (Pall, USA) розміром 200 × 200 mm при тиску 1,5 bar і 40°C.
Молекулярну масу uSPG вимірювали методом SEC-MALLS на системі ВЕЖ Alliance (Waters) з послідовно з’єднаними колонками PL aquagel OH60 і PL aquagel OH40, а детектор miniDAWN TREOS (Wyatt) концентрували діафільтрацією до концентрації uSPG 1 g/L і стерилізували автоклавуванням при 120°C/20 min. Денатурований uSPG готували аналогічним чином, за винятком того, що до фільтрату культуральної рідини додавали NaOH у концентрації 0,2 M, і лужний розчин інкубували протягом 30 min при лабораторній температурі перед діафільтрацією.

Результати:
Ультразвукову обробку застосовували безпосередньо до 144-годинної культуральної рідини S. commune з міцелієм для полегшення подальшої обробки SPG.

Характеристики ультразвуково обробленого шизофіллану: Ультразвуково оброблений шизофіллан (uSPG) осадили з фільтрату культуральної рідини за допомогою спирту та характеризували. За даними SEC-MALLS, Mw uSPG становила близько 1 MDa. Середня молекулярна маса шизофіллану з рідкої ферментації становить приблизно 5 MDa, тоді як при твердотільному культивуванні вона може досягати до 10 MDa. Порівняння молекулярної маси ультразвуково обробленого шизофіллану з молекулярними масами нативного необробленого шизофіллану показує, що внаслідок ультразвукової обробки молекулярна маса зменшується в 5–10 разів.
Ультразвуково оброблений полісахарид uSPG містив 0,7% w/w білка та 1,0% w/w залишку після прожарювання. Гідролізат uSPG складався з глюкози з вмістом понад 99%. Аналітичні результати свідчать про те, що ультразвукова обробка випадково розщеплює основний ланцюг β-глюкану, тоді як бічні гілки залишаються недоторканими, зменшуючи розмір і молекулярну масу шизофіллану. Імунологічні дослідження uSPG, практично вільного від білків та ендотоксинів, показали, що ультразвуково оброблений шизофіллан з низькою Mw має виражену імуномодулюючу активність.

 
Знижена в’язкість: Ультразвукова обробка призвела до значного зниження в’язкості культуральної рідини. Під час ультразвукової обробки в’язкість культуральної рідини змінювалася нелінійно: спочатку в’язкість знижувалася швидко, але згодом цей процес уповільнювався. Специфічний енерговитрата 100 Ws/mL була достатньою для зниження в’язкості культуральної рідини майже в 7 разів.

Покращена фільтрація: Ультразвуково оброблений культуральний бульйон проходив крізь фільтр швидше, ніж необроблений культуральний бульйон (питомий енерговитрата 0 Ws/mL) з високомолекулярним SPG. Крім того, ультразвукова обробка значно зменшила втрати продукту під час фільтрації. Фільтрат необробленого культурального бульйону з високомолекулярним SPG (питомий енерговитрата 0 Ws/mL) містив 0,3 ± 0,07 g/L SPG, тоді як концентрація SPG перед глибинною фільтрацією становила 2 g/L. Натомість фільтрат культурального бульйону, обробленого ультразвуком із питомою енерговитратою 100 Ws/mL, містив SPG у концентрації 2,2 ± 0,2 g/L, що відповідає майже нульовим втратам продукту.

Висновок: У своєму висновку дослідницька група зазначає, що ультразвукова обробка є ефективною технологією для виробництва шизофіллану з низькою молекулярною масою, який можна використовувати в косметиці та медицині. Застосування ультразвукової обробки до повного культурального бульйону з міцелієм надає певних переваг виробництву шизофіллану. Це зменшує втрати продукту під час подальшої обробки та робить можливим виробництво високоочищеного полісахариду завдяки ефективному використанню ультрафільтрації.
Крім того, дослідники виявили, що ультразвукова обробка шизофіллану легко масштабується. Одна одиниця пілотного ультразвукового дезінтегратора UIP2000hdT обробляла 1 літр культурального бульйону за 110 s у потоковому режимі. Продуктивність системи можна легко збільшити шляхом послідовного підключення додаткових ультразвукових установок.

 
Дізнайтеся більше про просте масштабування екстракції грибів!
 

Високопродуктивне ультразвукове обладнання для обробки грибних глюканів

Фрагментацію полісахаридів, таких як глюкани, а також інших біоактивних сполук, таких як хітин і хітозан, можна надійно здійснювати за допомогою високоефективного ультразвукового обладнання Hielscher. Наші ультразвукові гомогенізатори можуть забезпечувати високі амплітуди, пропонують точне регулювання параметрів процесу та можуть працювати цілодобово (24/7) під великим навантаженням і в складних умовах. Асортимент обладнання Hielscher Ultrasonics надійно відповідає цим вимогам. Окрім видатної ефективності ультразвуку, ультразвукові гомогенізатори Hielscher вирізняються високою енергоефективністю, що є суттєвою економічною перевагою – особливо при використанні у комерційному великомасштабному виробництві.
Ультразвукові гомогенізатори Hielscher – це високоефективні системи, які можна оснастити аксесуарами, такими як сонотроди, підсилювачі, реактори або проточні комірки, щоб оптимально відповідати потребам вашого процесу. Завдяки цифровому кольоровому дисплею, можливості попереднього налаштування циклів ультразвукової обробки, автоматичному запису даних на вбудовану SD-карту, дистанційному керуванню через браузер та багатьом іншим функціям забезпечується найвищий рівень контролю процесу та зручність використання. Поєднання з міцністю та високою вантажопідйомністю робить ультразвукові системи Hielscher вашим надійним «робочим конем» у виробництві. Зниження молекулярної маси β-глюканів, таких як шизофіллан, потребує потужного ультразвуку для досягнення цільового розщеплення та отримання кінцевого продукту шизофіллану високої якості, який можна використовувати у фармацевтичних застосуваннях.

Дізнайтеся більше про ультразвукову екстракцію бета-глюканів з грибів, включаючи покрокові інструкції, тут!

Наведена нижче таблиця дає уявлення про приблизну продуктивність наших ультразвукових апаратів: