Ультразвукове виробництво високоочищених бета-глюканів шизофіллану

Шизофіаллан - грибний β-глюкан з імуномодулюючими властивостями. Для високоактивного лікарського ефекту шизофіллан повинен мати низьку молекулярну масу, щоб продемонструвати покращену біодоступність. Доведено, що ультразвук знижує молекулярну масу шизофіллану. Як надійний і ефективний метод, ультразвукова хвороба може бути легко застосована для виробництва низькомолекулярного шизофілана.

Гриби шизофіллум та ультразвукова екстракція бета-глюкану

Види гриба Schizophyllum ростуть в природі на гниючих деревах після сезону дощів. Плодові тіла збирають в наступний сухий сезон. Види шизофіллума багаті біохімічними сполуками, такими як глюкани, і тому споживаються, особливо в тропічних країнах, як їжа та ліки. Завдяки своїм імуномодулюючим, протигрибковим, протипухлинним та противірусним властивостям Schizophyllum commune, також відомий як гриб Splitgill, привернув увагу біотехнологічних та фармацевтичних компаній.
Полісахарид шизофіллан, також відомий як сизофіран, соніфілан або сизофілан, є основним β-глюканом, що міститься в грибах Schizophyllum, які пропонують високоефективний біологічно активний β-глюкан шизофіллан.
Гриби Schizophyllum commune ростуть в природі на деревах, міцелій також можна культивувати в бродильному бульйоні. Для фармацевтичних і косметичних застосувань низькомолекулярний шизофіллан набагато ефективніший, ніж високомолекулярний шизофіллан. Це пов'язано з тим, що низькомолекулярний шизофіллан демонструє значно кращу біодоступність і показники абсорбції. Крім того, високомолекулярний шизофіллан часто є проблематичним у застосуванні, оскільки це призводить до високої в'язкості його водних розчинів.
Ультразвукове зменшення розміру є високоефективним і надійним методом зниження молекулярної маси шизофіллану, тим самим підвищуючи якість молекули β-глюкану.

Протокол виробництва низькомолекулярного шизофіллану

Оскільки молекулярна маса шизофіллану демонструє значно кращу біодоступність та властивості застосування, дослідницька група Смірну досліджувала ультразвук для розщеплення та зменшення розміру молекули β-глюкану шизофіллану.

Ультразвукове дослідження шизофілана

β-1,3(1,6)-глюкан-шизофіллан (SPG) був отриманий шляхом підводного культивування гриба S. commune в біореакторі з використанням сахарози як субстрату.
Після закінчення культивування відвар культури розбавляли демінералізованою водою до концентрації шизофіллана 2 г/л і ультразвукували ультразвуковий процесор UIP2000HDT (Hielscher Ultrasonics GmbH, Німеччина) в режимі переробки при наступних параметрах і умовах: середній потік 50 мл/с, частота 20 кГц, вихід 2000 Вт, сонотрод типу BS2d22, підсилювач типу В2-1,4 і амплітуда 100%. Температура культурального бульйону на початку ультразвукового дослідження становила 25°С. Бульйон з ультразвуковою культурою (питома енергія 100 Вт/мл) фільтрували через глибинний фільтр Seitz HS800 під тиском 1,5 бар при 40°C. Ультразвуковий шизофіллан (uSPG) для хімічної характеристики осаджували з фільтрату потрійною кількістю ізопропілового спирту при лабораторній температурі, а висушували при 60 °C протягом 12 год uSPG розчини для імунологічних досліджень готували наступним чином: (1) ультразвуковий фільтрат культурального бульйону діафільтрували через касету PES серії Pall Centramate T-серії 0,1 м2 (відсічення 100 кДа) при 0,8 бар і діафільтрацію продовжували до тих пір, поки провідність ретентату не досягла 20 мкСм/см; (2) розчин концентрували діафільтрацією до концентрації uSPG 1 г/л і стерилізували автоклавуванням при 120 °C/20 хв. Денатурований uSPG готували аналогічним способом, за винятком того, що NaOH додавали до фільтрату культурального бульйону в концентрації 0,2 М, а алкалізований розчин інкубували протягом 30 хв при лабораторній температурі перед діафільтрацією.

Аналітичні методи

Вихід міцелію оцінювали гравіметрично: бульйон культури розбавляли водою 1:4, центрифугували 10000 × г при 25°С протягом 20 хв, осад промивали потрійною кількістю води, сушили при 60°С і зважували. Шизофіллан осаджували з супернатанту потрійною кількістю ізопропілового спирту, сушили при температурі 60 ° C протягом 24 год, і його вихід визначали гравіметрично. рО2 в культуральному бульйоні вимірювали оптичним зондом Hamilton-Visiferm DO 120 (Гамільтон, Швейцарія).
Динамічну в'язкість культурного бульйону вимірювали на HAAKE Visco Tester 6L зі шпинделями 1L і 2L при 4°C і частоті обертання 30 об/хв. Швидкість фільтрації обчислювалася за часом фільтрації культурального бульйону об'ємом 500 мл через фільтр глибини Seitz HS800 (Pall, США) товщиною 200 × мм при тиску 1,5 бар і 40°C.
Молекулярну масу uSPG вимірювали методом SEC-MALLS на системі ВЕРХ Alliance (Waters) з послідовно з'єднаними колонками PL aquagel OH60 та PL aquagel OH40, а детектор miniDAWN TREOS (Wyatt) концентрував діафільтрацією до концентрації uSPG 1 г/л та стерилізував автоклавуванням при 120°C/20 хв. Денатурований uSPG готували аналогічним способом, за винятком того, що NaOH додавали до фільтрату культурального бульйону в концентрації 0,2 М, а алкалізований розчин інкубували протягом 30 хв при лабораторній температурі перед діафільтрацією.

Результатів:
Ультразвукова обробка була застосована безпосередньо до бульйону культури S. commune 144-h з міцелієм для полегшення подальшої обробки SPG.
 
Характеристики ультразвукового шизофіллана: Ультразвуковий шизофіллан (uSPG) був осаджений з фільтрату культурального бульйону спиртом і охарактеризований. За оцінками SEC-MALLS, МВт uSPG становить близько 1 МДа. Середня молекулярна маса шизофіллану в результаті рідкого бродіння становить приблизно 5 МДа, тоді як при твердотільному культивуванні вона може досягати до 10 МДа. Порівнюючи молекулярну масу ультразвукового шизофіллану з молекулярною масою нативного необробленого шизофіллану, можна спостерігати зниження молекулярної маси в 5–10 разів завдяки ультразвуку.
Ультразвуковий полісахарид uSPG містив 0,7% w/w білка та 1,0% w/w залишку після займання. Гідролізат uSPG складався з глюкози більш ніж на 99%. Результати аналізу свідчать про те, що ультразвукова хвороба розщеплює β-глюкановий кістяк хаотично, а бічні гілки залишаються недоторканими, тим самим зменшуючи розмір і молекулярну масу шизофіллану. Імунологічні дослідження по суті білково- та ендотоксинного вільного uSPG показали, що ультразвуковий шизофіллан з низьким вмістом Mw має виражену імуномодулюючу активність.

 
Знижена в'язкість: Ультразвукове дослідження призвело до значного зниження в'язкості культурального бульйону. При ультразвуковому дослідженні в'язкість культурального бульйону змінювалася нелінійно: на початку ультразвуку зниження в'язкості було швидким, але пізніше воно сповільнилося. Питома витрата енергії 100 Вт/мл була достатньою для зниження в'язкості культурального бульйону майже в 7 разів.

Покращена фільтрація: Культуральний бульйон, оброблений ультразвуком, протікав через фільтр швидше, ніж необроблений культуральний бульйон (питома енергія введення 0 Вт/мл) з високомолекулярною СПГ. Крім того, ультразвук значно знижував втрати продукту при фільтрації. Фільтрат необробленого культурального бульйону з високомолекулярним SPG (питомий енергетичний вхід 0 Ws/mL) містив 0,3 ± 0,07 г/л SPG, тоді як концентрація SPG до глибинної фільтрації становила 2 г/л. На противагу цьому, фільтрат ультразвукової культури потужністю 100 Вт/мл містив SPG у концентрації 2,2 ± 0,2 г/л, що відповідає майже нульовим втратам продукту.

Висновок: У своєму висновку дослідницька група підсумовує, що ультразвукова обробка є ефективною технологією для виробництва низькомолекулярного шизофілана, який потім може використовуватися в косметиці та медицині. Ультразвукова терапія при застосуванні на повному культуральному бульйоні з міцелієм приносить певні переваги для виробництва шизофілана. Це зменшує втрати продукту при подальшій обробці та робить можливим виробництво високоочищеного полісахариду завдяки ефективному використанню ультрафільтрації.
Крім того, дослідники виявили, що ультразвукова обробка шизофіллану легко масштабується. Одна установка дослідного заводу ультразвукового дезінтегратора UIP2000HDT переробляла 1 літр культурального бульйону за 110 с в проточному режимі. Продуктивність системи може бути легко збільшена шляхом послідовного підключення додаткових апаратів УЗД.

 
Дізнайтеся більше про просте масштабування видобутку грибів!
 

Високопродуктивне ультразвукове обладнання для обробки грибкового глюкану

Фрагментація полісахаридів, таких як глюкани, а також інших біологічно активних сполук, таких як хітин і хітозан, може бути надійно оброблена за допомогою високопродуктивного ультразвукового обладнання Hielscher. Наші ультразвукові апарати можуть видавати високі амплітуди, забезпечують точне керування параметрами процесу та можуть працювати 24/7 при великому навантаженні та у вимогливих умовах. Асортимент обладнання Hielscher Ultrasonics надійно відповідає цим вимогам. Крім видатних ультразвукових характеристик, ультразвукові апарати Hielscher можуть похвалитися високою енергетичною ефективністю, що є значною економічною перевагою – Особливо при використанні на комерційному великосерійному виробництві.
Ультразвукові апарати Hielscher – це високопродуктивні системи, які можуть бути оснащені такими аксесуарами, як сонотроди, бустери, реактори або проточні елементи, щоб оптимально відповідати потребам вашого процесу. Завдяки цифровому кольоровому дисплею, можливості попередньо встановлених ультразвукових проходів, автоматичному запису даних на вбудовану SD-карту, віддаленому керуванню браузером та багатьом іншим функціям, забезпечується найвищий контроль процесів та зручність для користувача. У поєднанні з міцністю та великою вантажопідйомністю ультразвукові системи Hielscher стануть вашою надійною робочою конячкою на виробництві. Зменшення молекулярної маси β-глюканів, таких як шизофіллан, вимагає потужного ультразвуку для отримання цільового розщеплення та кінцевого продукту шизофіллану високої якості, який можна використовувати для фармацевтичних застосувань.
 
Дізнайтеся більше про ультразвукову екстракцію бета-глюкану з грибів, включаючи покрокові інструкції, тут!
 
Наведена нижче таблиця дає уявлення про приблизну потужність обробки наших ультразвукових апаратів: