Ультразвукове приготування ліпосом

Ліпосоми, отримані за допомогою ультразвуку, демонструють дуже високу ефективність інкапсуляції, високу вантажопідйомність та однорідний малий сферичний розмір. Таким чином, ультразвукові ліпосоми забезпечують чудову біодоступність. Hielscher Ultrasonics пропонує ультразвукові апарати для надійного виробництва ліпосом фармацевтичного класу в режимі партії та безперервному режимі.

Переваги ультразвукового виробництва ліпосом

Ультразвукова інкапсуляція ліпосом – це техніка, що використовується для інкапсуляції ліків або інших терапевтичних агентів у ліпосоми за допомогою ультразвукової енергії. У порівнянні з іншими методами інкапсуляції ліпосом, ультразвукова інкапсуляція має кілька переваг, які роблять її провідною технікою виробництва.

• Високе навантаження, висока ефективність інкапсуляції: Відомо, що ультразвукове виробництво ліпосом забезпечує ліпосоми з високим вмістом активних інгредієнтів, наприклад, вітаміну C, молекул ліків тощо. Водночас метод ультразвукової обробки демонструє високу ефективність інкапсуляції. Це означає, що високий відсоток активної речовини інкапсулюється за допомогою ультразвукової обробки. Отже, це робить ультразвукову обробку високоефективним методом виробництва ліпосом.
• Однорідні малі ліпосоми: Однією з переваг ультразвукової інкапсуляції ліпосом є її здатність виробляти високосиметричні ліпосоми з вузьким розподілом розмірів. Ультразвукову енергію можна використовувати для руйнування більших ліпосом або ліпідних агрегатів на менші, більш однорідні ліпосоми. Це призводить до більшої узгодженості розміру та форми ліпосом, що може бути важливим для застосувань у доставці ліків, де розмір частинок може впливати на їхню фармакокінетику та ефективність.
• Застосовно до будь-яких молекул: Ще однією перевагою ультразвукової інкапсуляції ліпосом є її здатність інкапсулювати широкий спектр ліків та інших терапевтичних агентів. Цю техніку можна використовувати для інкапсуляції як гідрофільних, так і гідрофобних ліків, що може бути складно зробити іншими методами. Крім того, ультразвукову енергію можна використовувати для інкапсуляції макромолекул та наночастинок, які можуть бути занадто великими для інкапсуляції іншими методами.
• Швидко та надійно: Ультразвукова інкапсуляція ліпосом також є відносно простим та швидким процесом. Вона не потребує використання жорстких хімікатів або високих температур, які можуть бути шкідливими для інкапсульованих терапевтичних агентів.
• Масштабування: Крім того, цю техніку можна легко масштабувати для великомасштабного виробництва, що робить її економічно вигідним варіантом для застосувань у доставці ліків.

Загалом, ультразвукова інкапсуляція ліпосом є провідною технікою інкапсуляції ліпосом завдяки її здатності виробляти однорідні ліпосоми з вузьким розподілом розмірів, інкапсулювати широкий спектр терапевтичних агентів, а також завдяки простоті та можливості масштабування.

Після утворення ліпідної плівки та подальшої регідратації ультразвукова обробка використовується для сприяння інкапсуляції активних інгредієнтів у ліпосоми. Крім того, ультразвукова обробка досягає бажаного розміру ліпосом.

Ультразвукове приготування ліпосом для фармацевтики та косметики

Ліпосоми (везикули на основі ліпідів), трансферосоми (ультрадеформовані ліпосоми), етосоми (ультрадеформовані везикули з високим вмістом алкоголю) та ніосоми (синтетичні везикули) – це мікроскопічні везикули, які можна штучно приготувати як глобулярні носії, у які можна інкапсулювати активні молекули. Ці везикули з діаметром від 25 до 5000 nm часто використовуються як носії ліків у фармацевтичній та косметичній промисловості, наприклад, для пероральної або місцевої доставки ліків, генної терапії та імунізації. Ультразвукова обробка – це науково доведений метод для високоефективного виробництва ліпосом. Ультразвукові апарати Hielscher виробляють ліпосоми з високим вмістом активних інгредієнтів та чудовою біодоступністю.

Ліпосоми та ліпосомальні формуляції

Ліпосоми – це везикулярні системи з однією, кількома або багатьма ламелами, що складаються з того самого матеріалу, що й клітинна мембрана (ліпідний бішар). Залежно від їхнього складу та розміру ліпосоми поділяються наступним чином:

• багатоламелярні везикули (MLV, 0,1-10μm)
• малі одноламелярні везикули (SUV, <100 nm)
• великі одноламелярні везикули (LUV, 100–500 nm)
• гігантські одноламелярні везикули (GUV, ≥1 μm)

Основна структура ліпосомів складається з фосфоліпідів. Фосфоліпіди мають гідрофільну головну групу та гідрофобну хвостову групу, що складається з довгого вуглеводневого ланцюга.
Мембрана ліпосомів має дуже подібний склад до шкірного бар’єру, тому вони можуть легко інтегруватися в шкіру людини. Оскільки ліпосоми зливаються зі шкірою, вони можуть вивільняти інкапсульовані агенти безпосередньо в цільову зону, де активні речовини можуть виконувати свої функції. Таким чином, ліпосоми створюють посилення проникності/прохідності шкіри для інкапсульованих фармацевтичних і косметичних агентів. Також ліпосоми без інкапсульованих агентів, порожні везикули, є потужними активними речовинами для шкіри, оскільки «phosphatidylcholin» включає два есенціальні компоненти, які організм людини не може виробляти самостійно: лінолеву кислоту та холін.
Ліпосоми використовуються як біосумісні носії для ліків, пептидів, білків, «plasmic DNA», антисенс-олігонуклеотидів або рибозимів у фармацевтичних, косметичних і біохімічних цілях. Надзвичайна універсальність у розмірі частинок і фізичних параметрах ліпідів надає привабливий потенціал для створення індивідуально підібраних транспортних засобів для широкого спектру застосувань. (Ulrich 2002)

Утворення ліпосомів за допомогою ультразвуку

Ліпосоми можна утворювати за допомогою ультразвуку. Основним матеріалом для приготування ліпосомів є «amphilic» молекули, похідні від ліпідів біологічних мембран або засновані на них. Для утворення малих одноламелярних везикул (SUV) ліпідну дисперсію піддають м’якій ультразвуковій обробці – наприклад, за допомогою ручного ультразвукового пристрою UP50H (50W, 30kHz), VialTweeter або ультразвукового реактора CupHorn – в ледяній ванні. Тривалість такої ультразвукової обробки становить приблизно 5 – 15 хвилин. Іншим методом виробництва малих одноламелярних везикул є ультразвукова обробка багатоламелярних везикулярних ліпосомів.
Dinu-Pirvu et al. (2010) повідомляють про отримання трансферосомів шляхом ультразвукової обробки MLV при кімнатній температурі.
Hielscher Ultrasonics пропонує різноманітні ультразвукові пристрої, сонотроди та аксесуари і, таким чином, може забезпечити найбільш підходящу ультразвукову установку для високоефективної інкапсуляції ліпосомів у будь-якому масштабі.

Ультразвукова інкапсуляція активних речовин у ліпосоми

Ліпосоми працюють як носії для активних інгредієнтів, таких як вітаміни, терапевтичні молекули, пептиди тощо. Ультразвук є ефективним інструментом для приготування та формування ліпосомів для захоплення активних агентів. Одночасно ультразвукова обробка сприяє процесу інкапсуляції та захоплення, так що виробляються ліпосоми з високим навантаженням активних інгредієнтів. Перед інкапсуляцією ліпосоми мають тенденцію утворювати кластери через взаємодію заряд-заряд полярних голівок фосфоліпідів (пор. Míckova et al. 2008), крім того, вони повинні бути відкриті. Наприклад, Zhu et al. (2003) описують інкапсуляцію порошку біотину в ліпосоми за допомогою ультразвуку. Коли порошок біотину додавали в розчин суспензії везикул, розчин піддавали ультразвуковій обробці. Після цієї обробки біотин був захоплений у ліпосомах.
Дізнайтеся більше про ультразвукову інкапсуляцію «peptrides» GLP-1 (наприклад, семаглутиду) у ліпосомах!

Ліпосомальні емульсії за допомогою ультразвуку

Щоб посилити живильний ефект зволожувальних або антивікових кремів, лосьйонів, гелів та інших космецевтичних формуляцій, до ліпосомальних дисперсій додають емульгатори для стабілізації більшої кількості ліпідів. Але дослідження показали, що здатність ліпосом загалом обмежена. З додаванням емульгаторів цей ефект з’являється раніше, а додаткові емульгатори спричиняють ослаблення бар’єрної спорідненості фосфатидилхоліну. Наночастинки – що складаються з фосфатидилхоліну та ліпідів – є відповіддю на цю проблему. Ці наночастинки утворюються з крапельки олії, вкритої мономолекулярним шаром фосфатидилхоліну. Використання наночастинок дозволяє створювати формуляції, які здатні поглинати більше ліпідів і залишатися стабільними, так що додаткові емульгатори не потрібні.
Ультразвукова обробка – це перевірений метод виробництва наноемульсій та нанодисперсій. Високоінтенсивний ультразвук забезпечує потужність, необхідну для диспергування рідкої фази (дисперсної фази) у дрібних краплях у другій фазі (суцільній фазі). У зоні диспергування імплодуючі кавітаційні бульбашки спричиняють інтенсивні ударні хвилі в навколишній рідині та призводять до утворення рідинних струменів із високою швидкістю рідини. Щоб стабілізувати щойно утворені краплі дисперсної фази проти коалесценції, до емульсії додають емульгатори (поверхнево-активні речовини, ПАР) та стабілізатори. Оскільки коалесценція крапель після руйнування впливає на кінцевий розподіл розмірів крапель, ефективно стабілізуючі емульгатори використовують для підтримання кінцевого розподілу розмірів крапель на рівні, що дорівнює розподілу безпосередньо після руйнування крапель у зоні ультразвукового диспергування.

Ліпосомальні дисперсії за допомогою ультразвукової обробки

Ліпосомальні дисперсії, які базуються на ненасиченому «phosphatidylchlorine», мають низьку стабільність щодо окиснення. Стабілізацію дисперсії можна досягти за допомогою антиоксидантів, таких як комплекс вітамінів C та E.

Утворення ліпосом методом випаровування зворотної фази з використанням ультразвукової обробки

Ortan et al. (2002) досягли у своєму дослідженні щодо ультразвукового приготування ефірної олії Anethum graveolens у ліпосомах хороших результатів. Після ультразвукової обробки розмір ліпосом становив від 70 до 150 nm, а для MLV – від 230 до 475 nm; ці значення були приблизно постійними також через 2 місяці, але збільшилися через 12 місяців, особливо в дисперсії SUV (див. гістограми нижче). Вимірювання стабільності, щодо втрати ефірної олії та розподілу розмірів, також показало, що ліпосомальні дисперсії зберегли вміст леткої олії. Це свідчить про те, що інкапсуляція ефірної олії в ліпосомах підвищила стабільність олії.

Ortan et al. (2009): Стабільність дисперсій MLV та SUV після 1 року. Ліпосомальні формуляції зберігали при 4±1 ºC.

Ультразвукові процесори Hielscher є ідеальними пристроями для застосувань у косметичній та фармацевтичній промисловості. Системи, що складаються з кількох ультразвукових процесорів потужністю до 16 000 watts кожен, забезпечують місткість, необхідну для перетворення цієї лабораторної процедури на ефективний метод виробництва для отримання дрібнодисперсованих емульсій у потоці або в партії – досягаючи результатів, порівнянних з найкращими доступними сьогодні гомогенізаторами високого тиску, такими як дросельні клапани. На додаток до цієї високої ефективності в безперервній емульгації, ультразвукові пристрої Hielscher потребують дуже низького обслуговування та є дуже простими в експлуатації та очищенні. Ультразвук фактично сприяє очищенню та промиванню. Потужність ультразвуку є регульованою і може бути адаптована до конкретних продуктів та вимог емульгації. Спеціальні проточні реактори, що відповідають передовим вимогам CIP (очищення на місці) та SIP (стерилізація на місці), також доступні.

Часті запитання щодо ліпосом

Які типи ліпосом розрізняють?

Ліпосоми класифікують на різні типи залежно від їхнього розміру та кількості бішарів, які вони містять. Ці категорії включають:

• Малі мономембранні везикули (SUV): Це найменші ліпосоми з одним ліпідним бішаром.
• Великі мономембранні везикули (LUV): Більші за SUV, вони також мають один бішар.
• Багатошарові везикули (MLV): Вони містять кілька концентричних бішарів.
• Багатовезикулярні везикули (MVV): Вони складаються з кількох менших везикул у межах більшої везикули.

Інші спеціалізовані типи включають:

• ПЕГильовані ліпосоми: Ліпосоми, модифіковані поліетиленгліколем (PEG) для підвищення стабільності та часу циркуляції.
• Наноліпосоми: Дуже малі ліпосоми, які зазвичай використовують для цільової доставки ліків.

Які структури везикул можуть мати ліпосоми?

Ліпосоми додатково класифікують за їхньою структурою везикул на сім основних типів:

• Багатошарові великі везикули (MLV): Містять кілька бішарів.
• Оліголамелярні везикули (OLV): Мають кілька бішарів.
• Малі мономембранні везикули (SUV): Найменші з одним бішаром.
• Середні мономембранні везикули (MUV): Проміжного розміру з одним бішаром.
• Великі мономембранні везикули (LUV): Більші з одним бішаром.
• Гігантські мономембранні везикули (GUV): Дуже великі з одним бішаром.
• Багатовезикулярні везикули (MVV): Кілька везикул у межах однієї великої везикули.

У чому різниця між ліпосомами та ніосомами?

Ліпосоми та ніосоми відрізняються переважно своїм складом:
Ліпосоми: Виготовлені з дволанцюгових фосфоліпідів, які можуть бути нейтральними або зарядженими.
Ніосоми: Виготовлені з незаряджених одноланцюгових поверхнево-активних речовин та холестерину.
Обидві структури формуються за допомогою ультразвукової обробки, яка сприяє збиранню бішарових везикул.

Який ідеальний розмір ліпосома?

Для терапевтичної доставки ідеальний розмір ліпосома теоретично становить від 50 до 200 нанометрів у діаметрі. Цей діапазон розмірів оптимізує стабільність та біодоступність. Для зменшення везикули до бажаного розміру зазвичай використовують ультразвукову обробку.

Чи можуть ліпосоми нести гідрофільні ліки?

Так, ліпосоми можуть нести гідрофільні ліки. Вони цінуються в біомедичних застосуваннях за здатність інкапсулювати як гідрофобні, так і гідрофільні агенти. Крім того, вони забезпечують високу біосумісність та біорозкладність, що робить їх ефективними системами доставки.

Як виготовити ліпосоми?

Найпоширенішими методами підготовки ліпосом є метод тонкої плівки та метод випаровування в обертовій фазі.
Метод гідратації тонкої плівки:

1. Розчиніть ліпіди в органічному розчиннику.
2. Випаруйте розчинник, щоб утворити тонку ліпідну плівку.
3. Гідратуйте плівку водним розчином за допомогою ультразвукової обробки, щоб утворити багатошарові везикули.

Метод випаровування в обертовій фазі:

1. Розчиніть ліпіди у воді та етанолі.
2. Обробіть розчин ультразвуком при 60°C протягом приблизно 10 хвилин, щоб створити ліпідну пасту.
3. Охолодіть ліпідну суспензію та додавайте воду або буфер краплями, помішуючи.
4. Гідратуйте суспензію протягом 1 години, щоб утворити багатошарові везикули.
5. Зменшіть розмір ліпосомів за допомогою додаткової ультразвукової обробки.

Що таке археосоми?

Археосоми – це ліпосоми, виготовлені з архейних ліпідів, які відомі своєю стабільністю та стійкістю до екстремальних умов. Ці властивості роблять археосоми особливо корисними для доставки ліків та розробки вакцин у складних середовищах.

Як готують археосоми?

Процедура ультразвукової обробки згідно з Pise (2022): Археосоми можуть бути виготовлені з полярної ліпідної фракції «PLF» Sulfolobussolfataricus за допомогою ультразвукової обробки при 60°C без необхідності зовнішнього поповнення ліпідів. При 0°C полярні ліпіди з Sulfolobusacidocaldarius ефективно піддавалися ультразвуковій обробці для формування археосом. Археосоми, навантажені BMD, та звичайні ліпосоми, а також архейні ліпіди, ізольовані з Archaea H. salinarum та збагачені фосфатидилхоліном, були виготовлені за допомогою техніки ультразвукової обробки. Ультразвуково оброблені везикули були створені для місцевої доставки шляхом ультразвукової обробки дисперсій MLV при амплітуді 80 відсотків протягом 4 хвилин за допомогою сонікатора зондового типу Hielscher UP50H (див. зображення ліворуч).

Література/Посилання

• Raquel Martínez-González, Joan Estelrich, Maria Antònia Busquets (2016): Liposomes Loaded with Hydrophobic Iron Oxide Nanoparticles: Suitable T2 Contrast Agents for MRI. International Journal of Molecular Science 2016.
• Zahra Hadian, Mohammad Ali Sahari, Hamid Reza Moghimi; Mohsen Barzegar (2014): Formulation, Characterization and Optimization of Liposomes Containing Eicosapentaenoic and Docosahexaenoic Acids; A Methodology Approach. Iranian Journal of Pharmaceutical Research (2014), 13 (2): 393-404.
• Joanna Kopecka, Giuseppina Salzano, Ivana Campia, Sara Lusa, Dario Ghigo, Giuseppe De Rosa, Chiara Riganti (2014): Insights in the chemical components of liposomes responsible for P-glycoprotein inhibition. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine 2013.
• Pise, Ganesh (2022): Archaeosomes for both cell-based delivery applications and drug-based delivery applications. Journal of Medical Pharmaceutical and Allied Sciences 11, 2022. 4995-5003.