Утворення амілоїдних фібрил за допомогою ультразвукового пристрою для мікропланшетів UIP400MTP

Амілоїдні фібрили, подібно до кристалів, утворюються шляхом нуклеації та подальшого росту. Однак через високий бар’єр вільної енергії нуклеації спонтанне утворення амілоїдних фібрил відбувається лише після тривалої лаг-фази. Ультразвукова обробка стала потужним інструментом для індукування нуклеації амілоїду, завдяки чому утворення фібрил значно прискорюється. У поєднанні з мікропланшетним рідером, який реєструє флуоресценцію тіофлавіну T (ThT), ультразвукова обробка забезпечує високопродуктивне виявлення амілоїдних фібрил одночасно в багатьох зразках.

Індуковане ультразвуком утворення амілоїдних фібрил за допомогою ультразвукового пристрою для мікропланшетів UIP400MTP

За допомогою ультразвукового пристрою для багатолункових планшетів UIP400MTP можна швидко синтезувати великі кількості амілоїдних фібрил однакової якості для дослідницьких цілей. Цей ефективний підхід дає змогу вивчати амілоїдогенність білків. Ця методика сприяє швидкому та відтворюваному утворенню амілоїдних фібрил, що було продемонстровано на β2-мікроглобуліні (β2-m) – амілоїдогенному білку, пов’язаному з діаліз-асоційованим амілоїдозом.

Простий експериментальний підхід: індуковане ультразвуком утворення амілоїдних фібрил

Для індукування утворення фібрил 96-лунковий мікропланшет розмістили в центрі ультразвукового пристрою для багатолункових планшетів UIP400MTP, який забезпечує рівномірний ультразвуковий вплив на всі лунки. Умови експерименту були такими:

1. Кожна лунка містила 0,2 ml розчину β2-мікроглобуліну (0,3 mg/ml, pH 2,5) з додаванням 5 μM ThT.
2. Планшет піддавали циклам ультразвукової обробки, наприклад 1 хвилина ультразвукової обробки з подальшою паузою тривалістю 9 хвилин.
3. Після ультразвукової обробки флуоресценцію ThT вимірювали за допомогою мікропланшетного рідера.

(пор. So et al., 2011)

Порівняння зі звичайним перемішуванням

Порівняно з традиційними методами перемішування ультразвукова обробка різко скоротила лаг-фазу утворення фібрил. За звичайних умов струшування мікропланшета лише в 1 із 10 лунок спостерігалося підвищення флуоресценції ThT через 20 годин. Натомість за циклічної ультразвукової обробки (15 хвилин ультразвукової обробки з подальшими 5 хвилинами спокою) значне підвищення флуоресценції ThT було виявлено відразу після першої ультразвукової обробки.

Стрімке прискорення кінетики утворення фібрил

Результати, отримані So et al. (2011), продемонстрували, що за допомогою ультразвукової обробки тривалість спонтанного утворення фібрил β2-мікроглобуліну за pH 2,5 можна скоротити з кількох годин до лише 10–15 хвилин.
Зображення, отримані методом атомно-силової мікроскопії (AFM), підтвердили, що фібрили, утворені шляхом 10-хвилинної ультразвукової обробки кожні 15 хвилин, морфологічно не відрізнялися від фібрил, утворених шляхом 1-хвилинної ультразвукової обробки кожні 10 хвилин. Це підкреслює відтворюваність і надійність індукованого ультразвуком утворення амілоїдних фібрил.

AFM-зображення амілоїдних фібрил, отриманих шляхом 1-хвилинної ультразвукової обробки кожні 10 хв (i), шляхом 10-хвилинної ультразвукової обробки кожні 15 хв (ii) та за допомогою реакції із затравкою без ультразвукової обробки (iii). Біла масштабна лінійка відповідає 1 μm.
Дослідження та зображення: ©So et al., 2011

Утворення фібрил за нейтрального pH

Навіть за нейтрального pH утворення фібрил було досягнуто після лаг-періоду тривалістю 1,5 години, що демонструє значне зниження енергетичного бар’єра нуклеації та росту під дією ультразвукової обробки. Це додатково підтверджує гіпотезу про те, що утворення амілоїдних фібрил є насамперед фізичною реакцією, значною мірою обмеженою енергетичним бар’єром нуклеації, який ультразвукова обробка ефективно знижує.

Вплив на дослідження захворювань, пов’язаних з амілоїдом

Просте й надійне утворення амілоїдних фібрил за допомогою ультразвукового пристрою для мікропланшетів UIP400MTP має важливе значення для досліджень хвороби Альцгеймера (AD) та інших захворювань, пов’язаних з амілоїдом, таких як хвороба Паркінсона, цукровий діабет II типу та системні амілоїдози. При AD агрегація амілоїду-β (Aβ) є ключовою патологічною ознакою, проте вивчення кінетики утворення його фібрил залишається складним через тривалі лаг-фази та варіабельність традиційних методів. Утворення фібрил під дією ультразвукової обробки прискорює нуклеацію, забезпечуючи високу відтворюваність і знижену варіабельність, що є вкрай важливим для скринінгу потенційних інгібіторів і розуміння амілоїдогенних механізмів. Крім того, висока продуктивність UIP400MTP дає змогу проводити масштабні дослідження неправильного згортання та агрегації білків, сприяючи відкриттю терапевтичних засобів, здатних модулювати утворення фібрил і потенційно сповільнювати прогресування нейродегенерації.

Це дослідження підтверджує, що ультразвукова обробка за допомогою ультразвукового пристрою для багатолункових планшетів UIP400MTP є високоефективним методом прискорення утворення амілоїдних фібрил. Основні переваги цього підходу:

• Різке скорочення лаг-періоду утворення фібрил.
• Рівномірний ультразвуковий вплив на всі лунки, що забезпечує відтворюване утворення фібрил.
• Можливість високопродуктивного скринінгу, що робить цей підхід придатним для пошуку амілоїдогенності білків у масштабі всього геному.

Завдяки поєднанню ультразвукової обробки з реєстрацією флуоресценції ThT цей метод забезпечує швидку, масштабовану й надійну платформу для вивчення утворення амілоїдних фібрил. З огляду на ефективність і потенціал високопродуктивної обробки цей підхід може полегшити простий синтез амілоїдних фібрил для біофізичних і фармацевтичних досліджень, пропонуючи перспективний інструмент для досліджень, пов’язаних з амілоїдом, і скринінгу лікарських засобів.