Формування фібрили амілоїду за допомогою UIP400MTP мікропланшетного фонікатора

Амілоїдні фібрили, подібно до кристалів, утворюються в процесі зародження і подальшого росту. Однак у зв'язку з високим вільноенергетичним бар'єром зародження спонтанне утворення амілоїдної фібрили відбувається тільки після тривалої фази відставання. Ультразвук став потужним інструментом для індукції зародження амілоїду, тим самим значно прискорюючи утворення фібрил. У поєднанні зі зчитувачем мікропланшетів, що використовує флуоресценцію тіофлавіну Т (ThT), ультразвук дозволяє виявляти високопродуктивні амілоїдні фібрили в кількох зразках одночасно.

Утворення амілоїдної фібрили за допомогою мікропланшетного фонікатора UIP400MTP

За допомогою UIP400MTP багатолункового пластинчастого ультразвукового апарату можна швидко синтезувати амілоїдні фібрили однакової якості у великих кількостях для дослідницьких цілей. Такий ефективний підхід дозволяє вивчати амілоїдогенність білка. Ця техніка сприяє швидкій та відтворюваній амілоїдній фібриляції, що було продемонстровано на прикладі β2-мікроглобуліну (β2-m), амілоїдогенного білка, пов'язаного з амілоїдозом, пов'язаним з діалізом.

Простий експериментальний підхід: ультразвуково індукована фібриляція амілоїду

Щоб індукувати утворення фібрил, у центрі багатолункового пластинчастого сонника UIP400MTP було поміщено 96-лункову мікропластину, яка забезпечує рівномірне ультразвукове опромінення у всіх лунках. Умови експерименту були такими:

1. Кожна лунка містила 0,2 мл розчину β2-мікроглобуліну (0,3 мг/мл, рН 2,5), доповненого 5 мкМ ThT.
2. Пластина була піддана циклам ультразвуку, таким як 1-хвилинне ультразвукове дослідження, після чого слідувала 9-хвилинна пауза.
3. Після ультразвукового дослідження флуоресценцію ThT вимірювали за допомогою зчитувача мікропланшетів.

(пор. Со та ін., 2011)

Порівняння зі звичайною агітацією

У порівнянні з традиційними методами збудження, ультразвук різко знижував відстаючу фазу утворення фібрил. У звичайних умовах струшування мікропластин лише 1 з 10 свердловин проявляла підвищену флуоресценцію ThT через 20 годин. На противагу цьому, при використанні циклічного ультразвуку (15-хвилинна ультразвукова діагностика з подальшим 5-хвилинним заспокоєнням) було виявлено значне збільшення флуоресценції ThT відразу після першого лікування ультразвуком.

Швидке прискорення кінетики фібриляції

Результати, отримані від So et al. (2011), продемонстрували, що спонтанне утворення фібрили β2-мікроглобуліну при рН 2,5 можна прискорити з кількох годин до всього 10–15 хвилин за допомогою ультразвуку.
Зображення атомно-силової мікроскопії (AFM) підтвердили, що фібрили, отримані шляхом 10-хвилинного ультразвуку кожні 15 хвилин, морфологічно не відрізняються від тих, що утворилися за допомогою 1-хвилинного ультразвуку кожні 10 хвилин. Це підкреслює відтворюваність і надійність фібриляції амілоїду, спричиненої ультразвуком.

AFM-зображення амілоїдних фібрил отримують шляхом 1-хв ультразвукового дослідження кожні 10 хв (і), 10-хвального ультразвукового дослідження кожні 15 хв (іі) та реакції посіву без ультразвуку (і). Біла шкала показує 1 мкм.
Дослідження та зображення: ©Со та ін., 2011

Фібриляція в умовах нейтрального рН

Навіть в умовах нейтрального рН утворення фібрил було досягнуто після затримки в 1,5 години, що свідчить про те, що ультразвук значно знижує енергетичний бар'єр для зародження та росту. Це також підтверджує гіпотезу про те, що фібриляція амілоїду є насамперед фізичною реакцією, значною мірою обмеженою енергетичним бар'єром зародження, який ультразвук ефективно зменшує.

Вплив на дослідження амілоїдних захворювань

Легке та надійне формування амілоїдних фібрил за допомогою UIP400MTP мікропланшетного ультразвукового апарату має значні значення для досліджень хвороби Альцгеймера (ХА) та інших розладів, пов'язаних з амілоїдом, таких як хвороба Паркінсона, діабет II типу та системні амілоїдози. При АД агрегація амілоїду-β (Aβ) є ключовою патологічною ознакою, проте вивчення кінетики її фібриляції залишається складним завданням через тривалі фази затримки та варіабельність у звичайних методах. Утворення фібрил, спричинене ультразвуком, прискорює зародження, забезпечуючи високу відтворюваність та зменшену варіабельність, що має вирішальне значення для скринінгу потенційних інгібіторів та розуміння амілоїдогенних механізмів. Крім того, висока пропускна здатність UIP400MTP дозволяє проводити широкомасштабні дослідження неправильного згортання та агрегації білків, сприяючи відкриттю терапевтичних агентів, які можуть модулювати формування фібрил і потенційно пом'якшувати нейродегенеративне прогресування.

Дане дослідження встановлює ультразвук з використанням багатолункового пластинчастого фонікатора UIP400MTP як високоефективний метод прискорення утворення амілоїдної фібрили. До ключових переваг такого підходу можна віднести:

• Різке скорочення часу затримки для фібриляції.
• Рівномірне ультразвукове опромінення у всіх лунках, що дозволяє формувати відтворювані фібрили.
• Висока пропускна здатність скринінгу, що робить його придатним для пошуку амілоїдогенності білка по всьому геному.

Інтегруючи ультразвук з детекцією флуоресценції ThT, цей метод забезпечує швидку, масштабовану та надійну платформу для вивчення фібриляції амілоїду. Враховуючи його ефективність та потенціал високої пропускної здатності, цей підхід може сприяти легкому синтезу амілоїдних фібрил для біофізичних та фармацевтичних досліджень, пропонуючи перспективний інструмент для досліджень, пов'язаних з амілоїдом, та скринінгу лікарських засобів.