PMCA для виявлення пріонів з високою пропускною здатністю за допомогою UIP400MTP Sonicator

Багатолунковий пластинчастий саунікатор UIP400MTP пропонує потужне рішення для високопродуктивної підготовки зразків в умовах циклічної ампліфікації з неправильним згортанням білків (PMCA). Забезпечуючи рівномірний розподіл енергії по декількох свердловинах і підтримуючи точні параметри ультразвукового випромінювання, ця система дозволяє одночасно обробляти численні зразки з винятковою відтворюваністю. Ці можливості мають вирішальне значення для оптимізації PMCA для виявлення пріонів у низьких концентраціях у складних біологічних зразках, таких як слина, де інгібітори аналізу можуть затьмарити результати.

Пріонні захворювання, такі як хронічна хвороба виснаження (CWD) у цервідах та хвороба Крейтцфельдта-Якоба (CJD) у людей, є нейродегенеративними розладами, спричиненими неправильно згорнутими пріонними білками (PrP^СК). Ці захворювання часто включають низький рівень інфекційних пріонів у рідинах організму, таких як слина, кров і сеча, що ускладнює діагностику та дослідження. Горизонтальна передача CWD через пріони, що скидаються в екологічні матриці, має особливо значні наслідки для управління дикою природою та екологічного здоров'я. Аналогічно, при таких захворюваннях, як хвороба Крейтцфельдта-Якоба, надійна ампліфікація неправильно згорнутих пріонних білків із зразків людини має вирішальне значення для просування діагностики та розуміння прогресування захворювання.

Застосування модифікованого протоколу PMCA дозволяє обійти поширені інгібітори аналізу (наприклад, муцини в слині) і досягти високої чутливості у виявленні пріонів, які в іншому випадку були б невиявлені або неоднозначні, використовуючи такі методи, як перетворення в реальному часі, викликане тремтінням (RT-QuIC). Ці досягнення покращують виявлення пріонів для різних захворювань, що робить PMCA незамінним інструментом для дослідження та діагностики пріонів. Багатолунковий пластинчастий ультразвуковий UIP400MTP сприяє високопродуктивному ультразвукуванню PMCA численних зразків у мікропланшетах (наприклад, 6-, 24- або 96-лункових планшетах) або флаконах у стійці для пробірок.

Протокол циклічної ампліфікації з неправильним згортанням високопродуктивних білків (PMCA)

Наведений нижче протокол дозволяє ефективно обробляти велику кількість зразків за точно таких же умов для отримання надійних результатів досліджень.

Підготовка зразків

Вихідний матеріал:
Підготуйте зразки за допомогою:

• Повторне суспендування гранул для екстракції саркосилу в субстраті PMCA.
• Безпосередньо спайкуючі гомогенати мозку або зразки крові з пріоновим насінням.

Субстрат:

• Використовуйте 10% (мас./об) гомогенату мозку, приготованого з трансгенних мишей з надмірною експресією PrP^C (наприклад, миші Tg).
• Гомогенізують тканини мозку в:
  – 1× ПБС.
  – 150 мМ NaCl.
  – 1% Тритон Х-100.
• Зберігайте субстрат при температурі -80ºC до використання.

Установка зразка в мікропланшетах або пробірках:
Труб:

• Додайте 90 мкл субстрату з гомогенату мозку та посівіть 10 мкл зразка (наприклад, крові, гомогенату мозку або гранули саркосилу).
• Помістіть 3 тефлонові кульки (діаметром 1,59 мм або 2,38 мм) у кожну трубку об'ємом 0,2 мл.
• Встановіть трубки в стійку, сумісну з UIP400MTP ультразвукорежисером.

Мікропланшет на 6 лунок:

• Додайте 5 мл субстрату з гомогенату мозку та посів 500 мкл зразка на лунку.
• У кожну лунку додайте по 3 тефлонові намистини.

Процедура PMCA

Розміщення:
Помістіть стійку для трубок або мікропланшет на 6 лунок у UIP400MTP ультразвуковик відповідно до інструкцій виробника.

Програма велопрогулянок:
Виконайте 144 цикли PMCA наступним чином:

• Інкубація: 29 хвилин і 30 секунд при 37°C.
• Звук: 30 секунд з амплітудою 60%.
• Слідкуйте за температурою: Використовуйте роз'ємний датчик температури, щоб контролювати температуру зразка та запрограмувати UIP400MTP на максимальну температуру 48–50°C.

Наступні раунди:
Пройшовши перше коло з 144 циклів, перенесіть аліквоту посиленого матеріалу:

• Розбавити в 10 разів свіжим трансгенним гомогенатним субстратом мозку миші.
• Виконайте 96 циклів PMCA для наступних раундів, зберігаючи ті ж параметри ультразвуку.
• Продовжуйте протягом бажаної кількості раундів (зазвичай до 5).

Виявлення PrP^СК

1. Травлення протеїнази К:
   – Обробіть зразки протеїназою К (50 мкг/мл) при 37 °C протягом 1 години.
   – Припиніть травлення, додавши буфер SDS-зразка та кип'ятіть протягом 10 хвилин.
2. Аналіз вестерн-блоту:
   – Проаналізуйте засвоєні зразки, використовуючи:
   – Антитіла до PrP 6H4 або PRC1.
   – Виконайте SDS-PAGE і перенесіть на PVDF мембрани для виявлення.

 

 

Обробляйте більше зразків для отримання більш надійних результатів

Багатолунковий пластинчастий ультразвуковий апарат UIP400MTP значно підвищує ефективність і масштабованість циклічної ампліфікації неправильного згортання білка (PMCA), вирішуючи традиційно трудомісткий характер процедури. Дозволяючи одночасно обробляти до 96 зразків у 96-лунковій плиті, система оптимізує робочі процеси PMCA, зберігаючи при цьому точні та однорідні умови ультразвуку на всіх свердловинах. Ця висока пропускна здатність мінімізує ручне керування, зменшує трудомісткі етапи та забезпечує відтворюваність, що робить його незамінним інструментом для дослідження пріонів. Незалежно від того, чи досліджуєте ви хронічне виснаження чи хворобу Крейтцфельдта-Якоба, UIP400MTP сприяє проведенню великомасштабних досліджень з більшою ефективністю, дозволяючи дослідникам відповідати вимогам сучасних діагностичних та наукових застосувань.

---

---

Література / Список літератури

• FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
• De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
• Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
• Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
• Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
• Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.