PMCA для високопродуктивного виявлення пріонів за допомогою ультразвукового пристрою UIP400MTP

Ультразвуковий пристрій UIP400MTP для багатолункових планшетів пропонує потужне рішення для високопродуктивної підготовки зразків під час циклічної ампліфікації неправильно згорнутих білків (PMCA). Забезпечуючи рівномірний розподіл енергії між численними лунками та підтримуючи точні параметри ультразвукової обробки, ця система дає змогу одночасно обробляти велику кількість зразків із винятковою відтворюваністю. Ці можливості мають вирішальне значення для оптимізації PMCA з метою виявлення пріонів у низьких концентраціях у складних біологічних зразках, як-от слина, де інгібітори аналізу можуть маскувати результати.

Пріонні захворювання, як-от хронічна виснажлива хвороба (CWD) в оленевих і хвороба Кройцфельда–Якоба (CJD) у людей, є нейродегенеративними розладами, спричиненими неправильно згорнутими пріонними білками (PrP^Sc). Ці захворювання часто супроводжуються низьким вмістом інфекційних пріонів у біологічних рідинах, як-от слина, кров і сеча, що ускладнює діагностику та дослідження. Горизонтальна передача CWD через пріони, що виділяються в компоненти довкілля, має особливо значні наслідки для управління популяціями диких тварин і здоров’я екосистем. Так само за таких захворювань, як хвороба Кройцфельда–Якоба, надійна ампліфікація неправильно згорнутих пріонних білків зі зразків людини має вирішальне значення для вдосконалення діагностики та розуміння прогресування захворювання.

Полегшуйте проведення аналізів MBEC завдяки надійному та швидкому відокремленню біоплівок за допомогою ультразвукового пристрою UIP400MTP для мікропланшетів. UIP400MTP може працювати з будь-яким стандартним планшетом для аналізів та ефективно відокремлює клітини й біоплівки.

Застосування модифікованого протоколу PMCA дає змогу подолати вплив поширених інгібіторів аналізу (наприклад, муцинів у слині) та досягти високої чутливості виявлення пріонів, які інакше не вдавалося б виявити або результати виявлення яких були б неоднозначними за використання таких методів, як індукована струшуванням конверсія в реальному часі (RT-QuIC). Ці досягнення покращують виявлення пріонів за різних захворювань, роблячи PMCA незамінним інструментом дослідження пріонів і діагностики. Ультразвуковий пристрій UIP400MTP для багатолункових планшетів полегшує високопродуктивну PMCA, забезпечуючи ультразвукову обробку численних зразків у мікропланшетах (наприклад, 6-, 24- або 96-лункових планшетах) або флаконах у штативі для пробірок.

Протокол високопродуктивної циклічної ампліфікації неправильно згорнутих білків (PMCA)

Наведений нижче протокол дає змогу ефективно обробляти велику кількість зразків за цілком однакових умов для отримання надійних результатів дослідження.

Підготовка зразків

Вихідний матеріал:
Підготуйте зразки такими способами:

Ресуспендування осадів, одержаних саркозиловою екстракцією, у субстраті PMCA.
Безпосереднє внесення пріонних затравок у гомогенати мозку або зразки крові.

Субстрат:

Використовуйте 10% (за масою/об’ємом) гомогенат мозку, приготований із трансгенних мишей із надекспресією PrP^C (наприклад, мишей Tg).
Гомогенізуйте мозкову тканину в:
– 1× PBS.
– 150 mM NaCl.
– 1% Triton X-100.
Зберігайте субстрат при -80ºC до використання.

Розміщення зразків у мікропланшеті або пробірках:
Пробірки:

Додайте 90 μL субстрату з гомогенату мозку та засійте 10 μL зразка (наприклад, кров, гомогенат мозку або саркозиловий осад).
Розмістіть 3 тефлонові кульки (діаметром 1,59 mm або 2,38 mm) у кожну пробірку на 0,2 mL.
Закріпіть пробірки в штативі, сумісному з ультразвуковим пристроєм UIP400MTP.

6-лунковий мікропланшет:

Додайте 5 mL субстрату з гомогенату мозку та засійте 500 μL зразка в кожну лунку.
Додайте 3 тефлонові кульки в кожну лунку.

Процедура PMCA

Розміщення:
Помістіть штатив із пробірками або 6-лунковий мікропланшет в ультразвуковий пристрій UIP400MTP згідно з інструкцією виробника.

Програма циклів:
Виконайте 144 цикли PMCA наступним чином:

Інкубація: 29 хвилин і 30 секунд при 37°C.
Ультразвукова обробка: 30 секунд при 60% амплітуди.
Контроль температури: використовуйте підключаємий датчик температури для відстеження температури зразків і налаштуйте UIP400MTP на максимальну температуру 48–50°C.

Наступні раунди:
Після завершення першого раунду зі 144 циклів перенесіть аліквоту ампліфікованого матеріалу:

Розведіть у 10 разів у свіжому субстраті з гомогенату мозку трансгенних мишей.
Виконуйте 96 циклів PMCA для наступних раундів, дотримуючись тих самих параметрів ультразвукової обробки.
Продовжуйте до потрібної кількості раундів (зазвичай до 5).

Виявлення PrP^Sc

Розщеплення протеїназою K:
– Обробіть зразки протеїназою K (50 μg/mL) при 37°C протягом 1 години.
– Зупиніть розщеплення додаванням SDS-буферу для зразків і кип’ятінням протягом 10 хвилин.
Вестерн-блот-аналіз:
– Проаналізуйте розщеплені зразки за допомогою:
– антитіл 6H4 або PRC1 проти PrP.
– Виконайте SDS-PAGE і перенесіть на PVDF-мембрани для реєстрації.

Hielscher UIP400MTP – найуніверсальніший ультразвуковий процесор для багатолункових планшетів, планшетів для ПЛР або пробірок зі зразками. Завдяки безперервній потужності ультразвукової обробки 400 ват він призначений для таких застосувань, як лізис клітин, емульгування, екстракція білків, фрагментація ДНК / РНК, деагломерація, екстракція зі зразків FFPE, відокремлення клітин і біоплівок або емульгування. UIP400MTP – це не ультразвукова ванна. Це чашковий випромінювач високої інтенсивності для сфокусованої ультразвукової обробки. Цей потужний безконтактний ультразвуковий процесор забезпечує рівномірну обробку в усіх лунках стандартного планшета. Ви можете точно регулювати амплітуду, потужність та імпульсний режим. Вбудований таймер і температурний зонд забезпечують відтворювані результати. Ультразвуковий процесор UIP400MTP для планшетів охолоджує зразки за допомогою водяної ванни; зовнішній охолоджувач доступний як опція.

Обробляйте більше зразків для отримання надійніших результатів

Ультразвуковий пристрій UIP400MTP для багатолункових планшетів значно підвищує ефективність і масштабованість циклічної ампліфікації неправильно згорнутих білків (PMCA), розв’язуючи проблему традиційно великих витрат часу на цю процедуру. Завдяки можливості одночасної обробки до 96 зразків у 96-лунковому планшеті система оптимізує робочі процеси PMCA, підтримуючи точні й однакові умови ультразвукової обробки в усіх лунках. Ця висока продуктивність мінімізує ручні маніпуляції, скорочує кількість трудомістких етапів і забезпечує відтворюваність, роблячи пристрій незамінним інструментом дослідження пріонів. Незалежно від того, чи досліджують хронічну виснажливу хворобу, чи хворобу Кройцфельда–Якоба, UIP400MTP полегшує проведення масштабних досліджень із вищою ефективністю, даючи дослідникам змогу задовольняти вимоги сучасних діагностичних і наукових застосувань.

Запросіть додаткову інформацію

Будь ласка, скористайтеся наведеною нижче формою, щоб запитати додаткову інформацію про ультразвуковий диспергатор UIP400MTP з високою продуктивністю обробки зразків, застосування для PMCA та ціни. Ми будемо раді обговорити з Вами підготовку Ваших зразків і запропонувати найкращий сонікатор, що відповідає Вашим вимогам!

Адреса електронної пошти (обов’язково)

Номер телефону

Ім’я

Сфера інтересу

Пов’язані теми

Література / Джерела

FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.

Поширені запитання

Що таке пріони?

Пріони – це неправильно згорнуті білки, здатні спричиняти аномальне згортання нормальних клітинних білків, особливо в головному мозку. На відміну від бактерій або вірусів, пріони не містять нуклеїнових кислот і поширюються за механізмом самовідтворення за власною структурною матрицею, що призводить до прогресивних нейродегенеративних захворювань, як-от хвороба Кройцфельда–Якоба, губчаста енцефалопатія великої рогатої худоби (коров’ячий сказ) і скрепі в овець. Їхня стійкість до стандартних процесів стерилізації підкреслює їхню унікальну патогенність і створює значні труднощі в медичній та дослідницькій практиці.

Що таке метод PMCA?

Циклічна ампліфікація неправильно згорнутих білків (PMCA) – це лабораторний метод, який використовують для ампліфікації неправильно згорнутих пріонних білків (PrP^Sc) in vitro. Він імітує перетворення нормального клітинного пріонного білка (PrP^C) на його неправильно згорнуту інфекційну форму (PrP^Sc), що є характерною ознакою пріонних захворювань. Процес передбачає цикли інкубації та ультразвукової обробки для прискорення агрегації PrP^Sc, що робить його потужним інструментом виявлення низького вмісту пріонів.

Неправильне згортання якого білка спричиняє хворобу Кройцфельда–Якоба?

Хвороба Кройцфельда–Якоба (CJD) спричинена неправильним згортанням пріонного білка (PrP). Нормальна ізоформа (PrP^C) набуває аномальної конформації з високим вмістом β-складчастих шарів (PrP^Sc), яка стає інфекційною та утворює амілоїдні агрегати в головному мозку, що призводить до нейродегенерації.

Що таке циклічна ампліфікація неправильно згорнутих білків інфекційних пріонів?

Циклічна ампліфікація неправильно згорнутих білків (PMCA) – це метод ампліфікації інфекційної форми пріонів (PrP^Sc) шляхом багаторазової інкубації нормального PrP^C з невеликими кількостями PrP^Sc. Під час кожного циклу PrP^Sc каталізує неправильне згортання PrP^C, а ультразвукова обробка фрагментує агрегати, створюючи більше центрів зародкоутворення. Це імітує реплікацію пріонів in vivo та дає змогу чутливо виявляти пріони в біологічних зразках.

Що спричиняє неправильне згортання PrP?

Неправильне згортання PrP з утворенням патогенної форми PrP^Sc можуть спричиняти:

Спонтанне неправильне згортання за спорадичних пріонних захворювань.
Генетичні мутації в гені PRNP (наприклад, за сімейних пріонних захворювань).
Контакт з інфекційним PrP^Sc через забруднені харчові продукти, медичні процедури або іншими шляхами.
Чинники середовища або структурні чинники, як-от pH, іони металів чи кофактори, що дестабілізують PrP^C.

Що таке тест RT-QuIC?

Індукована струшуванням конверсія в реальному часі (RT-QuIC) – це високочутливий діагностичний аналіз на пріонні захворювання. Він виявляє PrP^Sc шляхом посилення його здатності перетворювати рекомбінантний PrP^C на неправильно згорнуті агрегати. У тесті використовують флуоресцентне виявлення утворення амілоїдних фібрил, що робить його корисним для діагностики таких захворювань, як CJD, у спинномозковій рідині (CSF) або інших тканинах.