Shotgun Proteomiğinde Mikroplaka Sonikasyonu – Uygulama Notu

Shotgun proteomiği, karmaşık biyolojik materyali LC-MS/MS analizine hazır peptitlere dönüştürmek için verimli ve tekrarlanabilir numune hazırlamaya dayanır. UIP400MTP mikroplaka sonikatörü, küçük hacimli numunelerin standartlaştırılmış, paralel sonikasyonuna olanak tanıyarak bu süreci destekler ve laboratuvarların mikroplaka temelli iş akışlarında parçalama, ekstraksiyon ve yeniden çözündürme işlemlerini iyileştirmesine yardımcı olur. Bu uygulama notu, laboratuvarda test edilmiş bir örnek olarak PLA2G12A/Th17 çalışmalarından yayımlanmış bir hücre dışı vezikül iş akışını kullanarak UIP400MTP sonikatörünün proteomik numune hazırlamaya nasıl entegre edilebileceğini açıklar.

Daha Tekrarlanabilir Shotgun Proteomiği için Mikroplaka Sonikasyonu

Proteomik araştırmacıları için tekrarlanabilir numune hazırlama, yüksek kaliteli LC-MS/MS verileri açısından kritik öneme sahiptir. UIP400MTP mikroplaka sonikatörü, plaka temelli ve küçük hacimli/yüksek numune işleme kapasiteli iş akışlarında standartlaştırılmış, paralel sonikasyonu destekler.

Özellikle aşağıdakilerle çalışan laboratuvarlar için yararlıdır:

• Çok sayıda kuyucukta tutarlı işlem gerektiren büyük numune grupları
• Numune kaybının ve değişkenliğin en aza indirilmesi gereken, sınırlı başlangıç miktarına sahip materyal
• Hücre dışı veziküller gibi lipit bakımından zengin numuneler
• Verimli parçalama, ekstraksiyon veya yeniden çözündürme gerektiren karmaşık biyolojik preparatlar
• Koşullar ve tekrarlar arasında tekrarlanabilirliğin temel önem taşıdığı karşılaştırmalı shotgun proteomiği

Araştırmacılar, sindirim öncesinde mikroplaka sonikasyonunu entegre ederek numunelerin aşağıdaki işlemlere hazırlığını iyileştirebilir:

• Protein ekstraksiyonu ve yeniden çözündürme
• Tripsin/Lys-C sindirimi
• Nano-LC/MS/MS veri toplama
• Sonraki aşamalardaki nicel proteomik analiz

 

Proteomik numune hazırlama kapasitenizi güvenle artırın!
Mikroplaka sonikasyonunun manuel işlemlerden kaynaklanan değişkenliği azaltmaya, numune parçalamayı iyileştirmeye ve karmaşık biyolojik numuneleri güvenilir LC-MS/MS analizine hazırlamaya nasıl yardımcı olduğunu öğrenin.

Bilgi Talebi


E-posta adresi (zorunlu)


İlgilendiğiniz ürün veya alan








Bilgi talep edin

Mikroplaka sonikasyonu aşağıdakilere fayda sağlayabilir:

• Proteomik merkezi hizmet birimleri
• EV araştırma laboratuvarları
• İmmünoloji ve hücre biyolojisi laboratuvarları
• Translasyonel araştırma grupları
• Tek numune hazırlamadan daha yüksek numune işleme kapasiteli iş akışlarına geçiş yapan yaşam bilimleri ekipleri

Hücre Dışı Vezikül Proteom Analizi için Yüksek Numune İşleme Kapasiteli Numune Hazırlama

Shotgun Proteomiği Nedir?

Shotgun proteomiği, tam hücre lizatları ve doku ekstraktlarından saflaştırılmış organellere, hücre dışı veziküllere ve düşük başlangıç miktarına sahip klinik numunelere kadar karmaşık biyolojik numunelerin karakterizasyonunda temel bir analitik strateji haline gelmiştir. Temel gücü, protein sindiriminin, yüksek çözünürlüklü sıvı kromatografisi–tandem kütle spektrometrisinin ve peptitlerden proteinlere yönelik hesaplamalı çıkarımın birleştirilmesinde yatar. Ancak nihai proteom veri kümesinin kalitesi, numune kütle spektrometresine ulaşmadan çok önce belirlenir. Verimli numune parçalama, protein çözündürme, girişim yapan maddelerin uzaklaştırılması, tekrarlanabilir enzimatik sindirim ve sağlam peptit geri kazanımı, kapsam derinliği ve nicel güvenilirlik açısından belirleyicidir.
Sınırlı veya değerli numunelerle çalışan proteomik araştırmacıları ve yaşam bilimleri laboratuvarları için numune hazırlama çoğu zaman darboğazdır.

Proteomikte Hücre Dışı Veziküllerin Oluşturduğu Zorluk

Örneğin hücre dışı veziküller (EV’ler), özellikle zorlu bir numune sınıfını temsil eder. Bunlar, nispeten düşük protein verimine ve lipitlerin, tuzların, deterjanların, serum proteinlerinin ve diğer matriks bileşenlerinin sonraki aşamalara taşınması açısından yüksek potansiyele sahip, zarla çevrili, lipit bakımından zengin, nano ölçekli parçacıklardır. Bu özellikler sindirim verimliliğini, kromatografik performansı, elektrosprey kararlılığını ve peptit tanımlamayı olumsuz etkileyebilir. Bu nedenle EV proteomiği için bir hazırlama iş akışı, vezikül yapılarını parçalayacak ve protein yükünü çözündürecek kadar güçlü olmalı, aynı zamanda sonraki enzimatik sindirim ve LC-MS/MS analiziyle uyumlu kalmalıdır.
Bu bağlamda mikroplakayla uyumlu ultrasonikasyon, tekrarlanabilir ve paralelleştirilmiş numune işleme için pratik bir yaklaşım sunar. Hielscher mikroplaka sonikatörü modelleri UIP400MTP (400 W) ve UIP550MTP (550 W), çok kuyucuklu plakalarda ve küçük hacimli kaplarda bulunan numunelerin sonikasyonu için tasarlanmıştır ve geleneksel tek problu sonikatörlerden daha yüksek numune işleme kapasiteli iş akışlarını destekler. Proteomik laboratuvarları için bu format caziptir; çünkü elle yapılan işlemlerden kaynaklanan değişkenliği azaltabilir, birden fazla numunenin paralel işlenmesini iyileştirebilir ve plaka temelli numune hazırlama süreçlerine daha doğal biçimde entegre olabilir.

Örnek İş Akışı

PLA2G12A tarafından yönlendirilen Th17 hücre biyolojisine ilişkin yakın tarihli bir hücre dışı vezikül proteomiği iş akışı, UIP400MTP mikroplaka sonikatörünün shotgun proteomiği numune hazırlama sürecine nasıl dahil edilebileceğine dair yararlı, laboratuvarda test edilmiş bir örnek sunar. Bu çalışma serisinde EV numuneleri, metanol işlemi, UIP400MTP sonikasyonu, santrifüjleme, kurutma, tripsin/Lys-C sindirimi ve nano akışlı LC–yüksek çözünürlüklü tandem MS kullanılarak proteom analizi için işlenmiştir. Biyolojik çalışma 2026 yılında Mochizuki-Ono ve çalışma arkadaşları tarafından raporlanmış ve proteomik analiz, patojenik T hücresi yanıtları bağlamında PLA2G12A’nın EV yük proteinlerini nasıl değiştirdiğinin karakterizasyonuna yardımcı olmuştur.

Çok kuyucuklu plaka sonikatörü UIP400MTP

Neden mikroplaka sonikasyonu?
UIP400MTP sonikatörü, küçük hacimli numunelerin standartlaştırılmış, paralel sonikasyonuna olanak tanır. Bu, tekrarlanabilirliğin, düşük numune başlangıç miktarının ve çoklu numune işleme kapasitesinin önemli olduğu durumlarda yararlıdır.


Kalite Kontrol Kontrol Listesi

• Tüm numunelerde EV protein eşdeğeri başlangıç miktarının eşit olduğunu doğrulayın.
• Rastgeleleştirilmiş veya dengelenmiş numune işleme yerleşimleri kullanın.
• Metanol hacmini, sonikasyon süresini, kurutma süresini ve sindirim hacmini tutarlı tutun.
• Peptit verimini ve toplam protein tanımlamalarını izleyin.
• Kaçırılmış kesim oranını ve peptit uzunluğu dağılımını kontrol edin.
• Kromatografik pik şeklini ve alıkonma süresi tekrarlanabilirliğini inceleyin.
• Numuneler arası taşınmayı izlemek için kör numuneler dahil edin.
• Daha büyük çalışmalar için havuzlanmış QC numuneleri kullanın.
• Tekrarların varyasyon katsayısını değerlendirin.
• Parti etkilerini veya aykırı numuneleri belirlemek için PCA veya ilgili yöntemleri kullanın.

Kayıt Tutma Önerileri

Bu iş akışını yayımlarken veya belgelendirirken EV başlangıç miktarını, plaka formatını, metanol hacmini, UIP400MTP sonikatörünün genliğini ve sonikasyon süresini, santrifüjleme koşullarını, kurutma yöntemini, sindirim tamponunu, enzim konsantrasyonunu, sindirim süresini, asitlendirme koşullarını, LC-MS/MS platformunu, veri toplama modunu, yazılım sürümünü, veri tabanını, FDR eşiğini, normalizasyon yöntemini ve istatistiksel iş akışını raporlayın.
Tüm Hielscher mikroplaka sonikatörleri, genlik, sonikasyon süresi ve sıcaklık gibi önemli işlem parametrelerini tarih ve saat damgasıyla birlikte entegre SD karta CVS dosyası olarak otomatik kaydeder. Tekrarlanabilirlik ve kalite kontrol için veri kaydı hiç bu kadar kolay olmamıştı!

Çalışmanın Ayrıntıları: PLA2G12A Çalışmasında EV Shotgun Proteomiği

PLA2G12A çalışması, bir shotgun proteomiği iş akışında UIP400MTP sonikatörünün kullanımına somut bir örnek sunar. Biyolojik soru, salgılanan fosfolipaz PLA2G12A’nın Th17 hücrelerinden türeyen hücre dışı vezikülleri nasıl değiştirdiği ve böylece patojenik T hücresi farklılaşmasını nasıl etkilediğiydi. Yazarlar, PLA2G12A’nın EV zarları üzerinde etki ederek 1-oleoil-lizofosfatidiletanolamin dahil lizofosfolipitler ürettiğini ve sonraki aşamalarda LPA2 aracılığıyla gerçekleşen lizofosfatidik asit sinyalleşmesinin Th17 farklılaşmasına katkıda bulunduğunu göstermiştir. Çalışmalarda lipit sinyalleşmesinin ötesinde, RNA ve protein içeriği dahil EV yükü de incelenmiş ve bu durum shotgun proteomiğini karakterizasyon stratejisinin önemli bir bileşeni haline getirmiştir.
EV hazırlama iş akışında Th17 hücreleri, eksozomları uzaklaştırılmış fetal sığır serumu içeren besiyerinde kültüre edilmiştir. Kültür süpernatantları önce hücreleri uzaklaştırmak için santrifüjlenmiş, 0,22 µm filtreden geçirilmiş, ultrafiltrasyon/ultrasantrifüjleme ile yoğunlaştırılmış, yıkanmış, PBS içinde yeniden süspanse edilmiş ve BCA protein testiyle miktarları belirlenmiştir. Bu ön aşama EV hazırlığı, tanımlanmış bir protein eşdeğeri miktarındaki EV materyalinin proteomik iş akışına aktarılabilmesini sağlamıştır.
Shotgun proteomik analiz için yazarlar, 5 µg protein eşdeğerine karşılık gelen EV numuneleri kullanmıştır. Bu numuneler PCR tüplerinde kurutulmuş ve 25 µL metanol eklenmiştir. Ardından numuneler UIP400MTP mikroplaka sonikatörü kullanılarak 3 dakika sonikasyona tabi tutulmuştur. Sonikasyonun ardından numuneler 4°C sıcaklıkta, 19.000 × g ile 20 dakika santrifüjlenmiştir. 20 µL süpernatant uzaklaştırıldıktan sonra numuneler kuruyana kadar santrifüjlenmiştir. Daha sonra proteinler, 50 mM amonyum bikarbonat içindeki 100 ng/µL konsantrasyonlu tripsin/Lys-C çözeltisinin 4 µL’sinde sonikasyonla çözündürülmüştür. Sindirim, 300 rpm hızında çalkalamayla 37°C sıcaklıkta 2 saat gerçekleştirilmiştir. Sindirim ürünü, 1 µL %1,25 trifloroasetik asitle asitlendirilmiş ve nano akışlı LC–yüksek çözünürlüklü tandem kütle spektrometrisi analizine tabi tutulmuştur.
Bu iş akışı, düşük başlangıç miktarına sahip EV proteomiği için çeşitli yararlı ilkeleri vurgular. İlk olarak başlangıç miktarı protein eşdeğerine göre normalize edilmiştir; bu, farklı genotiplerden veya uygulamalardan gelen EV’leri karşılaştırırken önemlidir. İkinci olarak sonikasyon öncesinde metanol kullanılmış, böylece LC-MS/MS analizini karmaşıklaştırabilecek deterjan sistemlerinden kaçınılırken parçalama ve ekstraksiyon desteklenmiştir. Üçüncü olarak sonikasyon adımı kısa ve standartlaştırılmıştır; bu da paralel numune işlemeyle uyumludur. Dördüncü olarak tripsin/Lys-C sindirimi çok küçük bir hacimde gerçekleştirilerek seyrelme azaltılmış ve düşük başlangıç miktarından peptit geri kazanımı desteklenmiştir. Son olarak sindirimden doğrudan asitlendirmeye ve LC-MS/MS analizine geçiş, gereksiz işlem adımlarını en aza indirmiştir.
Sonraki aşamadaki LC-MS/MS yönteminde, Q-Exactive HF Orbitrap kütle spektrometresine bağlanmış nano akışlı ters faz ayırma kullanılmıştır. Numuneler C18 ön kolonda tutulmuş, ardından 50 µm iç çaplı analitik kolonda 200 nL/min debide ve 40°C sıcaklıkta ayrılmıştır. Gradyan, 60 dakika boyunca düşük organik çözücü düzeyinden %35 çözücü B’ye ilerlemiş, ardından yüksek organik çözücü içerikli yıkama ve yeniden dengeleme uygulanmıştır. MS veri toplama, daha yüksek enerjili çarpışma kaynaklı ayrışmayla veriden bağımsız veri toplama kullanılarak pozitif iyon modunda gerçekleştirilmiştir. DIA ham dosyaları, in silico tahmin edilmiş bir spektral kütüphaneyle DIA-NN 1.8 kullanılarak analiz edilmiştir.