Shotgun Proteomikinde Mikroplaka Sonikasyonu – Uygulama Notu

Shotgun proteomik, karmaşık biyolojik materyali LC-MS/MS için hazır peptidlere dönüştürmek amacıyla verimli ve tekrarlanabilir numune hazırlığına dayanır. UIP400MTP mikroplaka sonikatörü, küçük hacimli numunelerin standartlaştırılmış ve paralel sonikasyonunu mümkün kılarak bu süreci destekler ve laboratuvarların mikroplaka tabanlı iş akışlarında parçalama, ekstraksiyon ve yeniden çözünürleştirme süreçlerini iyileştirmelerine yardımcı olur. Bu uygulama notu, PLA2G12A/Th17 çalışmalarından yayınlanmış bir hücre dışı vezikül iş akışını laboratuvarda test edilmiş bir örnek olarak kullanarak, UIP400MTP'nin proteomik numune hazırlığına nasıl entegre edilebileceğini açıklamaktadır.

Daha Tekrarlanabilir Shotgun Proteomik Çalışmaları için Mikroplaka Sonikasyonu

Proteomik araştırmacıları için, tekrarlanabilir numune hazırlığı, yüksek kaliteli LC-MS/MS verileri elde etmek açısından hayati önem taşır. UIP400MTP mikroplaka sonikatörü, plaka tabanlı ve küçük hacimli/yüksek verimli iş akışlarında standartlaştırılmış, paralel sonikasyon işlemini destekler.

Özellikle aşağıdaki alanlarda çalışan laboratuvarlar için son derece yararlıdır:

• Birçok kuyucukta tutarlı bir şekilde işlenmesi gereken büyük örnek kümeleri
• Örnek kaybı ve değişkenliğin en aza indirilmesi gereken, sınırlı miktarda malzeme içeren durumlar
• Hücre dışı veziküller gibi lipit bakımından zengin numuneler
• Etkili bir şekilde parçalanması, ekstraksiyonu veya yeniden çözünür hale getirilmesi gereken karmaşık biyolojik preparatlar
• Koşullar ve tekrarlar arasında tekrarlanabilirliğin hayati önem taşıdığı karşılaştırmalı shotgun proteomik

Sindirim işleminden önce mikroplaka sonikasyonunu entegre ederek, araştırmacılar aşağıdakiler için numunelerin hazırlık durumunu iyileştirebilirler:

• Protein ekstraksiyonu ve yeniden çözünürleştirme
• Tripsin/Lys-C sindirimi
• Nano-LC/MS/MS veri toplama
• Niteliksel aşağı akış proteomik analizi

 

Proteomik numune hazırlama işlemlerinizi güvenle ölçeklendirin!
Mikroplaka sonikasyonunun manuel işlemlerdeki değişkenliği nasıl azalttığını, numune parçalanmasını nasıl iyileştirdiğini ve karmaşık biyolojik numuneleri güvenilir LC-MS/MS analizi için nasıl hazırladığını öğrenin.

Bilgi Talebi


E-posta adresi (gerekli)


Ürün veya ilgi alanı



Gizlilik Politikasını kabul ediyorum









Bilgi isteyin

Mikroplaka sonikasyonu aşağıdaki alanlarda fayda sağlayabilir:

• Proteomik temel tesisleri
• Elektrikli araç araştırma laboratuvarları
• İmmünoloji ve hücre biyolojisi laboratuvarları
• Uygulamalı araştırma grupları
• Tek numune hazırlığından daha yüksek verimli iş akışlarına geçiş yapan yaşam bilimleri ekipleri

Hücre Dışı Vezikül Proteom Analizi için Yüksek Verimli Numune Hazırlama

Shotgun Proteomik Nedir?

Shotgun proteomik, bütün hücre lizatlarından ve doku ekstraktlarından saflaştırılmış organellere, hücre dışı veziküllere ve düşük miktarlı klinik numunelere kadar karmaşık biyolojik numuneleri karakterize etmek için merkezi bir analitik strateji haline gelmiştir. Bu yöntemin temel gücü, protein sindirimi, yüksek çözünürlüklü sıvı kromatografisi-tandem kütle spektrometrisi ve hesaplamalı peptid-protein çıkarımının bir araya getirilmesinde yatmaktadır. Ancak, nihai proteom veri setinin kalitesi, numune kütle spektrometresine ulaşmadan çok önce belirlenir. Verimli numune parçalama, protein çözünürleştirme, parazitik maddelerin giderilmesi, tekrarlanabilir enzimatik sindirim ve sağlam peptid geri kazanımı, kapsama derinliği ve kantitatif güvenilirlik açısından belirleyicidir.
Sınırlı veya değerli numunelerle çalışan proteomik araştırmacıları ve yaşam bilimleri laboratuvarları için numune hazırlığı genellikle en büyük engel teşkil etmektedir.

Proteomikte Hücre Dışı Veziküllerin Getirdiği Zorluklar

Örneğin, hücre dışı veziküller (EV’ler) özellikle zorlu bir numune sınıfını temsil eder. Bunlar, zarla çevrili, lipit açısından zengin, nano ölçekli parçacıklardır; nispeten düşük protein verimine sahip olmalarının yanı sıra lipitlerin, tuzların, deterjanların, serum proteinlerinin ve diğer matris bileşenlerinin taşınma riski yüksektir. Bu özellikler, sindirim verimliliğini, kromatografik performansı, elektrosprey stabilitesini ve peptid tanımlamasını olumsuz etkileyebilir. Bu nedenle, EV proteomikleri için bir hazırlama iş akışı, vezikül yapılarını bozacak ve protein yükünü çözünebilir hale getirecek kadar güçlü olmalı, aynı zamanda sonraki aşamalardaki enzimatik sindirim ve LC-MS/MS analizi ile uyumlu olmalıdır.
Bu bağlamda, mikroplaka uyumlu ultrasonikasyon, tekrarlanabilir ve paralelleştirilmiş numune işleme için pratik bir yaklaşım sunmaktadır. Hielscher mikroplaka sonikatör modelleri UIP400MTP (400 W) ve UIP550MTP (550 W), çok kuyulu plakalar ve küçük hacimli kaplardaki numunelerin sonikasyonu için tasarlanmıştır ve geleneksel tek problu sonikatörlere göre daha yüksek verimli iş akışlarını destekler. Proteomik laboratuvarları için bu format, elle yapılan işlemlerden kaynaklanan değişkenliği azaltabilmesi, birden fazla numunenin paralel işlenmesini iyileştirebilmesi ve plaka tabanlı numune hazırlama süreçlerine daha doğal bir şekilde entegre olabilmesi nedeniyle caziptir.

Örnek İş Akışı

PLA2G12A’nın yönlendirdiği Th17 hücre biyolojisi alanında yakın zamanda gerçekleştirilen bir hücre dışı vezikül proteomik iş akışı, UIP400MTP mikroplaka sonikatörünün shotgun proteomik numune hazırlığına nasıl entegre edilebileceğine dair laboratuvarda test edilmiş, faydalı bir örnek sunmaktadır. Bu çalışma serisinde, EV örnekleri, metanol işlemi, UIP400MTP sonikasyonu, santrifüjleme, kurutma, tripsin/Lys-C sindirimi ve nano-akışlı LC-yüksek çözünürlüklü tandem MS kullanılarak proteom analizi için işlenmiştir. Aynı biyolojik çalışma ilk olarak bir bioRxiv ön baskısı olarak bildirilmiş ve ardından Cell Reports dergisinde yayınlanmıştır; bu çalışmada proteomik analiz, PLA2G12A'nın patojenik T hücre yanıtları bağlamında EV yük proteinlerini nasıl değiştirdiğinin karakterize edilmesine yardımcı olmuştur.

Çok kuyulu plaka sonikatör UIP400MTP

Neden mikroplaka ultrasonikasyonu?
UIP400MTP, küçük hacimli numunelerin standartlaştırılmış ve paralel sonikasyonunu mümkün kılar. Bu özellik, tekrarlanabilirliğin, düşük numune miktarının ve çoklu numune işleme kapasitesinin önemli olduğu durumlarda faydalıdır.

Kalite Kontrol Kontrol Listesi

• Tüm numunelerde EV proteini eşdeğeri girdisinin eşit olduğunu doğrulayın.
• Rastgele veya dengeli örnek işleme düzenleri kullanın.
• Metanol hacmini, ultrasonik işlem süresini, kurutma süresini ve sindirim hacmini sabit tutun.
• Peptit verimini ve toplam protein tanımlamalarını izleyin.
• Kaçan bölünme oranını ve peptid uzunluk dağılımını kontrol edin.
• Kromatografik pik şeklini ve tutma süresi tekrarlanabilirliğini inceleyin.
• Taşınmayı izlemek için boşluklar bırakın.
• Daha geniş çaplı çalışmalarda birleştirilmiş kalite kontrol örneklerini kullanın.
• Tekrarlanan varyasyon katsayısını değerlendirin.
• PCA veya ilgili yöntemleri kullanarak parti etkilerini veya aykırı örnekleri tespit edin.

Tutanak Tutma Önerileri

Bu iş akışını yayınlarken veya belgelendirirken, EV giriş miktarını, plaka formatını, metanol hacmini, UIP400MTP’nin genliğini ve sonikasyon süresini, santrifüj koşullarını, kurutma yöntemini, sindirim tamponunu, enzim konsantrasyonunu, sindirim süresini, asitlendirme koşullarını, LC-MS/MS platformu, veri toplama modu, yazılım sürümü, veritabanı, FDR eşiği, normalizasyon yöntemi ve istatistiksel iş akışını belirtin.
Tüm Hielscher mikroplaka sonikatörleri, genlik, sonikasyon süresi ve sıcaklık gibi önemli işlem parametrelerini tarih ve saat bilgisiyle birlikte entegre SD kartta bir CSV dosyası olarak otomatik olarak kaydeder. Tekrarlanabilirlik ve kalite kontrolü için veri kaydı hiç bu kadar kolay olmamıştı!

Çalışmanın Ayrıntıları: PLA2G12A Çalışmasında EV Shotgun Proteomikleri

PLA2G12A çalışması, shotgun proteomik iş akışında UIP400MTP kullanımına dair somut bir örnek sunmaktadır. Çalışmanın biyolojik sorusu, salgılanan fosfolipaz PLA2G12A’nın Th17 hücrelerinden kaynaklanan hücre dışı vezikülleri nasıl modifiye ettiği ve bu yolla patojenik T hücresi farklılaşmasını nasıl etkilediğiydi. Yazarlar, PLA2G12A'nın EV zarlarına etki ederek 1-oleoil-lizofosfatidiletanolamin dahil lizofosfolipidler ürettiğini ve LPA2 aracılığıyla aşağı akıştaki lizofosfatidik asit sinyal iletiminin Th17 farklılaşmasına katkıda bulunduğunu göstermiştir. Lipid sinyalleşmesinin ötesinde, çalışmalarda RNA ve protein içeriği de dahil olmak üzere EV yükü de incelenmiş ve bu sayede shotgun proteomik, karakterizasyon stratejisinin önemli bir bileşeni haline gelmiştir.
EV hazırlama iş akışında, Th17 hücreleri, ekzozomlardan arındırılmış fetal sığır serumu içeren besiyerinde kültürlendi. Kültür süpernatantları, hücreleri uzaklaştırmak için önce santrifüjlendi, 0,22 µm'lik bir filtreden süzüldü, ultrafiltrasyon/ultrasantrifüjleme ile konsantre edildi, yıkandı, PBS içinde yeniden süspansiyon haline getirildi ve BCA protein analizi ile miktarları belirlendi. Bu ön EV hazırlığı, tanımlanmış bir protein eşdeğeri miktarda EV materyalinin proteomik iş akışına aktarılmasını sağlamıştır.
Shotgun proteomik analizi için yazarlar, 5 µg protein eşdeğerine karşılık gelen EV örneklerini kullandılar. Bu örnekler PCR tüplerinde kurutuldu ve 25 µL metanol ilave edildi. Ardından örnekler, UIP400MTP mikroplaka sonikatörü kullanılarak 3 dakika boyunca sonikasyona tabi tutuldu. Sonikasyonun ardından numuneler, 4°C'de 19.000 × g'de 20 dakika boyunca santrifüjlendi. 20 µL süpernatant çıkarıldıktan sonra numuneler kuruyana kadar santrifüjlendi. Proteinler daha sonra 50 mM amonyum bikarbonat içinde 100 ng/µL konsantrasyonunda 4 µL tripsin/Lys-C çözeltisi ile sonikasyon yoluyla çözüldü. Sindirim işlemi, 300 rpm'de çalkalanarak 37°C'de 2 saat boyunca gerçekleştirildi. Sindirim ürünü, 1 µL %1,25 trifloroasetik asit ile asitlendirildi ve nano-akışlı LC-yüksek çözünürlüklü tandem kütle spektrometresine tabi tutuldu.
Bu iş akışı, düşük girdi miktarlı EV proteomikleri için birkaç yararlı ilkeyi öne çıkarmaktadır. İlk olarak, girdi protein eşdeğeri bazında normalize edilmiştir; bu, farklı genotiplerden veya tedavilerden elde edilen EV’leri karşılaştırırken önemlidir. İkinci olarak, sonikasyon öncesinde metanol kullanılmıştır; bu, parçalanma ve ekstraksiyonu desteklerken, LC-MS/MS analizini zorlaştırabilecek deterjan sistemlerinden kaçınılmasını sağlamıştır. Üçüncü olarak, sonikasyon adımı kısa ve standartlaştırılmıştı; bu da paralel numune işlemeyle uyumludur. Dördüncü olarak, tripsin/Lys-C sindirimi çok küçük bir hacimde gerçekleştirildi; bu da seyreltmeyi azalttı ve düşük girdi peptid geri kazanımını destekledi. Son olarak, sindirimden asitlendirmeye ve LC-MS/MS’ye doğrudan geçiş, gereksiz işleme adımlarını en aza indirdi.
Aşağı akışlı LC-MS/MS yönteminde, Q-Exactive HF Orbitrap kütle spektrometresine bağlı nano-akışlı ters faz ayrıştırması kullanılmıştır. Numuneler bir C18 ön kolonunda tutuldu, ardından 200 nL/dk akış hızında ve 40 °C sıcaklıkta 50 µm iç çaplı bir analitik kolonda ayrıştırıldı. Gradyan, 60 dakika boyunca düşük organik çözücüden 5 çözücü B'ye doğru ilerlemiş, ardından yüksek organik yıkama ve yeniden dengeleme gerçekleştirilmiştir. MS verisi toplama işlemi, yüksek enerjili çarpışmalı ayrışma ile veriden bağımsız toplama kullanılarak pozitif iyon modunda gerçekleştirilmiştir. DIA ham dosyaları, in silico tahmin edilmiş bir spektral kütüphane kullanılarak DIA-NN 1.8 ile analiz edildi.