Sonication-Assisted Agrobacterium-Mediated Transformation (SAAT) เป็นวิธีที่มีประสิทธิภาพในการติดเชื้อในเซลล์พืชที่มียีนแปลกปลอมโดยใช้ Agrobacterium เป็นตัวขนส่ง อัลตราโซนิก cavitation ทําให้เกิด sonoporation ซึ่งสามารถอธิบายได้ว่าเป็นเป้าหมาย micro-wounding ของเนื้อเยื่อพืช ผ่าน ultrasonically เหล่านี้สร้างบาดแผลขนาดเล็กดีเอ็นเอและดีเอ็นเอเวกเตอร์สามารถขนส่งได้อย่างมีประสิทธิภาพในเมทริกซ์ของเซลล์

sonoporation – การเปลี่ยนแปลงเซลล์ที่เพิ่มขึ้น Ultrasonically

เมื่อใช้อัลตร้าซาวด์ความถี่ต่ํา (ประมาณ 20kHz) กับสารแขวนลอยของเซลล์ผลของการเกิดโพรงอากาศอะคูสติกทําให้เกิดการซึมผ่านของเมมเบรนชั่วคราวในเนื้อเยื่อของเซลล์ ผลอัลตราโซนิกนี้เรียกว่า sonoporation และใช้สําหรับการถ่ายโอนยีนเข้าไปในเซลล์หรือเนื้อเยื่อ
ข้อดีของ ultrasonication ขึ้นอยู่กับหลักการทํางานเชิงกลที่ไม่ใช่ความร้อนซึ่งทําให้ sonication มักจะหลากหลายมากขึ้นและขึ้นอยู่กับชนิดของเซลล์น้อยลง การประยุกต์ใช้ sonoporation ที่หลากหลายเปิดโอกาสในการใช้ประโยชน์จากพืชดัดแปรพันธุกรรมซึ่งมีศักยภาพที่สําคัญในการผลิตทางชีวภาพของโปรตีนบําบัดของมนุษย์ที่ซับซ้อน เครื่องปฏิกรณ์ชีวภาพจากพืชดังกล่าวสามารถจัดการทางพันธุกรรมได้ง่ายป้องกันการปนเปื้อนที่อาจเกิดขึ้นกับเชื้อโรคในมนุษย์ไม่ทําลายแบคทีเรียที่เป็นสื่อกลางในการเปลี่ยนแปลง (เช่น Agrobacterium) และเป็นวิธีการสังเคราะห์ทางชีวภาพที่ไม่แพงและมีประสิทธิภาพ

การแปลงเซลล์ช่วยอัลตราโซนิก

Sonication เป็นเทคนิคที่ใช้คลื่นอัลตร้าซาวด์ความถี่ต่ําเพื่อกวนอนุภาคในสารละลายเพื่อผสมสารละลายซึ่งจะเป็นการเพิ่มอัตราการถ่ายโอนมวลและการละลาย ในขณะเดียวกัน sonication สามารถกําจัดก๊าซที่ละลายแล้วออกจากของเหลวได้ ในการเปลี่ยนแปลงของพืช sonication จะทําให้เกิดการก่อตัวของ microwounds บนเนื้อเยื่อพืชและเพิ่มการส่งมอบดีเอ็นเอเปลือยกายเข้าไปในโปรโตพลาสต์ของพืช

สําหรับการเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรม Sonication-Assisted Agrobacterium-mediated Transformation (SAAT) เป็นวิธีการที่ต้องการและมีประสิทธิภาพสูงกว่า sonication ที่ใช้ในการถ่ายโอนดีเอ็นเอและดีเอ็นเอเวกเตอร์ที่เปลือยเปล่าไปยังโปรโทพลาสต์โดยตรง การศึกษาจํานวนมากได้แสดงให้เห็นว่า sonication ช่วยการเปลี่ยนแปลง Agrobacterium-mediated (SAAT) สามารถใช้เพื่อก่อให้เกิดการหยุดชะงักทางกลและการก่อตัวของบาดแผลในเซลล์พืชโดยคลื่นอัลตราซาวนด์และ cavitation อะคูสติกที่เกิดขึ้น การรักษาอัลตราโซนิกสั้น ๆ สร้างบาดแผลขนาดเล็กบนพื้นผิวของ explants เนื่องจากเซลล์ที่ได้รับบาดเจ็บจะช่วยให้การแทรกซึมของ Agrobacterium เข้าไปในส่วนลึกของเนื้อเยื่อพืชซึ่งจะเป็นการเพิ่มโอกาสที่เซลล์พืชจะติดเชื้อ นอกจากนี้สารประกอบฟีนอลิกที่หลั่งออกมายังช่วยเพิ่มการเปลี่ยนแปลง บาดแผลขนาดเล็กที่สร้างขึ้น ultrasonically ทําให้การแทรกซึมของแบคทีเรียอย่างกว้างขวางยังเป็นไปได้มากขึ้น SAAT ถูกใช้อย่างประสบความสําเร็จในการเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรมในพันธุ์พืชโดยเฉพาะอย่างยิ่งถือว่าทนต่อ Agrobacterium
เป็นวิธีที่ง่ายและราคาไม่แพง, เช่นเดียวกับการเพิ่มประสิทธิภาพที่สําคัญของการถ่ายโอนยีน Agrobacterium- ไกล่เกลี่ยเป็นข้อได้เปรียบที่สําคัญของ SAAT. นอกเหนือจากการประยุกต์ใช้ SAAT ที่ประสบความสําเร็จในการเปลี่ยนแปลงของ Chenopodium rubrum L. และ Beta vulgaris L. แล้ววิธีการนี้ยังถูกนําไปใช้ในการผลิต Escherichia coli ชนิดเรคอมบิแนนท์ Escherichia coli wild-type heat-labile holotoxin และ Escherichia coli mutant LT vaccine adjuvants ใน Nicotiana tabacum ซึ่งตรวจพบไทเทรส IGG เฉพาะ LT-B ที่เป็นระบบสูงสุดในนก
(cf เลย Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka และ R. Baranski, 2014)

ขั้นตอนทั่วไปสําหรับการถ่ายโอนยีนผ่าน Sonoporation ในเซลล์พืช

1. การเตรียมสารพันธุกรรม: เริ่มต้นด้วยการเตรียมสารพันธุกรรมที่คุณต้องการแนะนําในเซลล์พืช นี่อาจเป็นพลาสมิดดีเอ็นเออาร์เอ็นเอหรือกรดนิวคลีอิกอื่น ๆ
2. การแยกเซลล์พืช: แยกเซลล์พืชที่คุณต้องการกําหนดเป้าหมาย เซลล์เหล่านี้อาจถูกแยกออกจากเนื้อเยื่อพืชหรือวัฒนธรรมทั้งนี้ขึ้นอยู่กับการทดลองของคุณ
3. การระงับเซลล์: ระงับเซลล์พืชในสื่อหรือบัฟเฟอร์ที่เหมาะสม นี่เป็นสิ่งสําคัญเพื่อให้แน่ใจว่าเซลล์มีสุขภาพดีและอยู่ในสถานะที่เอื้อต่อการดูดซึมยีน
4. ตั้งค่า Sonicator ของคุณ: เตรียม sonicator ประเภทโพรบของคุณโดยพารามิเตอร์การตั้งค่าล่วงหน้าเช่น แอมพลิจูด เวลา พลังงาน และอุณหภูมิ จุ่มโพรบอัลตราโซนิกลงในสารแขวนลอยของเซลล์
5. sonication: เริ่มขั้นตอน sonication การสั่นอย่างรวดเร็วของปลายโพรบจะสร้างฟองอากาศในของเหลว ฟองอากาศเหล่านี้ขยายตัวและยุบตัวเนื่องจากคลื่นอัลตราโซนิกสร้างแรงเชิงกลและไมโครสตรีมในระบบกันสะเทือน
6. Sonoporation: แรงทางกลและไมโครสตรีมที่เกิดจากโพรงอากาศสร้างรูขุมขนและรูชั่วคราวในเยื่อหุ้มเซลล์พืช สารพันธุกรรมที่มีอยู่ในสารแขวนลอยสามารถเข้าสู่เซลล์พืชผ่านรูขุมขนเหล่านี้
7. การฟักไข่: หลังจากการรักษา sonoporation ให้บ่มเซลล์พืชเพื่อให้พวกเขาสามารถกู้คืนและทําให้เยื่อหุ้มเซลล์มีเสถียรภาพ นี่เป็นขั้นตอนสําคัญเพื่อให้แน่ใจว่าเซลล์อยู่รอดและถ่ายโอนยีนได้สําเร็จ

การถ่ายโอนยีนผ่าน Agrobacterium หรือ Liposomes

มีสองรูปแบบทั่วไปในการแปลงเซลล์พืช พวกเขาใช้ agrobacterium ซึ่งเป็นแบคทีเรียแกรมลบหรือไลโปโซมเป็นพาหะของสารพันธุกรรม

• Agrobacterium-Mediated Sonoporation: Agrobacterium tumefaciens เป็นแบคทีเรียที่ใช้กันทั่วไปในพันธุวิศวกรรมพืช ในวิธีนี้พลาสมิดดีเอ็นเอที่มียีนที่ต้องการจะถูกนําเข้าสู่ Agrobacterium ซึ่งจะถูกผสมกับเซลล์พืช การระงับเซลล์จะถูก sonoporation โดยใช้ sonicator ชนิดโพรบ พลังงานอัลตราโซนิกช่วยเพิ่มการถ่ายโอนสารพันธุกรรมจาก Agrobacterium ไปยังเซลล์พืช วิธีนี้ใช้กันอย่างแพร่หลายสําหรับการดัดแปลงพันธุกรรมของพืช
• Liposome-Mediated Sonoporation: ไลโปโซมเป็นถุงไขมันที่สามารถนําพาสารพันธุกรรมได้ ในวิธีนี้ไลโปโซมที่เต็มไปด้วยพลาสมิดดีเอ็นเอหรือกรดนิวคลีอิกอื่น ๆ จะถูกผสมกับเซลล์พืช Sonoporation โดยใช้ sonicator ชนิดโพรบถูกนํามาใช้เพื่ออํานวยความสะดวกในการดูดซึมไลโปโซมโดยเซลล์พืช อัลตราซาวนด์ขัดขวางไขมันสองชั้นของไลโปโซมปล่อยสารพันธุกรรมเข้าสู่เซลล์พืช วิธีนี้มีประโยชน์สําหรับการศึกษาการแสดงออกของยีนชั่วคราวในเซลล์พืช

ประโยชน์ที่ได้รับการพิสูจน์ทางวิทยาศาสตร์ของการเปลี่ยนแปลง Agrobacterium-Mediated ช่วย Sonication (SAAT)

Sonication-Assisted Agrobacterium-Mediated Transformation (SAAT) ได้ถูกนําไปใช้กับพืชหลายชนิด การรักษาอัลตราโซนิกสั้น ๆ และค่อนข้างอ่อนของการเพาะเลี้ยงเซลล์พืชทําให้เกิด sonoporation ซึ่งต่อมาช่วยให้การเจาะลึกของ Agrobacterium เป็นตัวขนส่งยีน ด้านล่างนี้คุณสามารถอ่านการศึกษาที่เป็นแบบอย่างที่แสดงให้เห็นถึงผลประโยชน์ของ SAAT

การเปลี่ยนแปลงด้วยอัลตราโซนิกช่วยของ Ashwagandha

เพื่อปรับปรุงประสิทธิภาพการเปลี่ยนแปลงใน W. somnifera (เรียกว่า Ashwagandha หรือเชอร์รี่ฤดูหนาว) Dehdashti และเพื่อนร่วมงาน (2016) ได้ตรวจสอบการใช้ acetosyringone (AS) และ sonication
Acetosyringone (AS) ถูกเพิ่มเข้ามาในสามขั้นตอน: วัฒนธรรมของเหลว Agrobacterium, การติดเชื้อ Agrobacterium และการเพาะเลี้ยงร่วมของ explants กับ Agrobacterium การเพิ่ม 75 μM AS ในการเพาะเลี้ยงของเหลว Agrobacterium พบว่าเหมาะสมที่สุดสําหรับการเหนี่ยวนํายีน vir
การประยุกต์ใช้ sonication เพิ่มเติม (SAAT) ส่งผลให้การแสดงออกของยีนสูงสุด การแสดงออกของยีน gusA ในรากที่มีขนดกพบว่าดีที่สุดเมื่อใบและเคล็ดลับการถ่ายทําถูก sonicated สําหรับ 10 และ 20s ตามลําดับ ประสิทธิภาพการเปลี่ยนแปลงของโปรโตคอลที่ได้รับการปรับปรุงถูกบันทึกไว้ 66.5 และ 59.5% ในกรณีของใบไม้และปลายหน่อตามลําดับ เมื่อเปรียบเทียบกับโปรโตคอลอื่น ๆ ประสิทธิภาพการเปลี่ยนแปลงของโปรโตคอลที่ได้รับการปรับปรุงนี้พบว่าสูงขึ้น 2.5 เท่าสําหรับใบไม้และ 3.7 เท่าสําหรับเคล็ดลับการถ่ายภาพ การวิเคราะห์รอยเปื้อนภาคใต้ยืนยัน 1-2 สําเนาของยีนกัสในบรรทัด W1-W4 ในขณะที่ 1-4 สําเนา transgene ถูกตรวจพบในบรรทัด W5 ที่สร้างขึ้นโดยโปรโตคอลที่ปรับปรุงแล้ว

ผลของระยะเวลาของการเปลี่ยนแปลง Agrobacterium ช่วย sonication- ไกล่เกลี่ย (SAAT) ต่อความถี่การเปลี่ยนแปลงของใบ W. somnifera (a) และปลายยิง (b) explants
(การศึกษาและกราฟิก: © Dehdashti et al., 2016)

การเปลี่ยนแปลงอัลตราโซนิกช่วยของฝ้าย

Hussain et al. (2007) แสดงให้เห็นถึงผลประโยชน์ของการเปลี่ยนแปลงฝ้ายช่วย sonication โพรงอากาศอะคูสติกที่เกิดจากอัลตร้าซาวด์ความถี่ต่ําสร้างแผลขนาดเล็กบนและใต้พื้นผิวของเนื้อเยื่อพืช (sonoporation) และช่วยให้ Agrobacterium เดินทางลึกและสมบูรณ์ทั่วเนื้อเยื่อพืช รูปแบบบาดแผลนี้เพิ่มความน่าจะเป็นของการติดเชื้อเซลล์พืชที่อยู่ลึกลงไปในเนื้อเยื่อ เพื่อประเมินประสิทธิภาพการเปลี่ยนแปลงของ SAAT ได้มีการวัดการแสดงออกของยีน GUS ระบบผู้สื่อข่าว GUS เป็นระบบยีนของนักข่าวซึ่งมีประโยชน์อย่างยิ่งในด้านอณูชีววิทยาและจุลชีววิทยาของพืช การปรับพารามิเตอร์ SAAT ต่างๆ การแสดงออกชั่วคราวของ GUS ในฝ้ายโดยใช้ตัวอ่อนที่โตเต็มที่เป็น explant ได้รับการปรับปรุงอย่างมีนัยสําคัญ GUS ถูกตรวจพบครั้งแรก 24 ชั่วโมงหลังจากการบ่มของ explants และโดย 48h การแสดงออกของ GUS นั้นรุนแรงมากซึ่งทําหน้าที่เป็นตัวบ่งชี้ที่มีประโยชน์ของการเปลี่ยนแปลงที่ประสบความสําเร็จของฝ้าย explant หลังจาก sonication ช่วยการเปลี่ยนแปลง Agrobacterium media mediated (SAAT) การเปรียบเทียบเทคนิคการเปลี่ยนแปลงต่างๆ (ได้แก่ biolistic, Agro, BAAT, SAAT), การเปลี่ยนแปลง Agrobacterium-mediated (SAAT) ช่วย sonication-aided (SAAT) แสดงให้เห็นโดยไกลผลลัพธ์ที่ดีที่สุดของการเปลี่ยนแปลง

ทางเลือกของขั้นตอนการเปลี่ยนแปลงบนพื้นฐานของการแสดงออกชั่วคราวของ GUS การเปลี่ยนแปลงที่เป็นสื่อกลางของ Agrobacterium (SAAT) ช่วย Sonication แสดงให้เห็นถึงการแสดงออกชั่วคราวที่สูงขึ้นอย่างมีนัยสําคัญ
(การศึกษาและกราฟิก: © Hussain et al., 2007)

โซลูชั่นอัลตราโซนิกประสิทธิภาพสูงสําหรับ Sonoporation และ SAAT

Hielscher Ultrasonics มีประสบการณ์ยาวนานในการพัฒนาและผลิต ultrasonicators ประสิทธิภาพสูงสําหรับห้องปฏิบัติการสิ่งอํานวยความสะดวกการวิจัยเช่นเดียวกับการผลิตภาคอุตสาหกรรมที่มีปริมาณงานสูงมาก สําหรับจุลชีววิทยาและวิทยาศาสตร์เพื่อชีวิต Hielscher นําเสนอโซลูชั่นที่หลากหลายเพื่อรองรับความต้องการที่แตกต่างกันซึ่งจําเป็นสําหรับเนื้อเยื่อเฉพาะและการรักษา สําหรับ ultrasonication พร้อมกันของตัวอย่างจํานวนมาก Hielscher มี UIP400MTP สําหรับแผ่น multiwell, VialTweeter สําหรับ sonication ได้ถึง 10 ขวด (เช่นหลอด Eppendorf) หรือ CupHorn ล้ําเสียง ultrasonicators ชนิดโพรบมีให้เลือกตั้งแต่ 50 ถึง 400 วัตต์เป็น homogenizers ในห้องปฏิบัติการในขณะที่ระบบอุตสาหกรรมครอบคลุมช่วงพลังงานตั้งแต่ 500 วัตต์ถึง 16kW
โปรดติดต่อเราและแจ้งให้เราทราบเกี่ยวกับข้อกําหนดการสมัครและกระบวนการของคุณ พนักงานที่มีประสบการณ์ดีของเรายินดีที่จะแนะนํา ultrasonicator ที่เหมาะสมที่สุดสําหรับกระบวนการทางชีวภาพของคุณ
ตารางด้านล่างนี้จะช่วยให้คุณมีข้อบ่งชี้ของความจุในการประมวลผลโดยประมาณของ ultrasonicators ของเรา: