การถ่ายยีนเข้าสู่เซลล์พืชด้วยอัลตราซาวนด์

การถ่ายยีนโดยใช้ Agrobacterium เป็นตัวกลางร่วมกับอัลตราซาวนด์ (SAAT) เป็นวิธีที่มีประสิทธิภาพในการทำให้เซลล์พืชติดเชื้อเพื่อนำยีนจากภายนอกเข้าสู่เซลล์ โดยใช้ Agrobacterium เป็นตัวขนส่ง คาวิเทชันจากอัลตราซาวนด์ทำให้เกิดการทำให้เกิดรูพรุนด้วยอัลตราซาวนด์ ซึ่งอธิบายได้ว่าเป็นการสร้างบาดแผลขนาดจุลภาคแบบเจาะจงในเนื้อเยื่อพืช บาดแผลขนาดจุลภาคที่สร้างขึ้นด้วยอัลตราซาวนด์เหล่านี้ช่วยให้สามารถขนส่ง DNA และเวกเตอร์ DNA เข้าสู่เมทริกซ์ของเซลล์ได้อย่างมีประสิทธิภาพ

การทำให้เกิดรูพรุนด้วยอัลตราซาวนด์ – การเพิ่มประสิทธิภาพการถ่ายยีนเข้าสู่เซลล์ด้วยอัลตราซาวนด์

เมื่อใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ความถี่ต่ำ (ประมาณ 20kHz) กับเซลล์แขวนลอย ผลของคาวิเทชันทางเสียงจะทำให้เยื่อหุ้มเซลล์ในเนื้อเยื่อมีความสามารถในการซึมผ่านเพิ่มขึ้นชั่วคราว ผลจากอัลตราซาวนด์นี้เรียกว่าการทำให้เกิดรูพรุนด้วยอัลตราซาวนด์ และใช้สำหรับถ่ายยีนเข้าสู่เซลล์หรือเนื้อเยื่อ
ข้อดีของการใช้อัลตราซาวนด์มีพื้นฐานมาจากหลักการทำงานเชิงกลที่ไม่อาศัยความร้อน ซึ่งทำให้การใช้อัลตราซาวนด์มักประยุกต์ใช้ได้หลากหลายกว่าและขึ้นอยู่กับชนิดของเซลล์น้อยกว่า การประยุกต์ใช้การทำให้เกิดรูพรุนด้วยอัลตราซาวนด์ได้อย่างหลากหลายเปิดโอกาสให้ใช้ประโยชน์จากพืชดัดแปลงพันธุกรรม ซึ่งมีศักยภาพสูงในการผลิตโปรตีนสำหรับการรักษามนุษย์ที่มีโครงสร้างซับซ้อนด้วยกระบวนการทางชีวภาพ เครื่องปฏิกรณ์ชีวภาพที่ใช้พืชเหล่านี้สามารถดัดแปลงพันธุกรรมได้ง่าย ป้องกันการปนเปื้อนที่อาจเกิดขึ้นจากเชื้อก่อโรคในมนุษย์ ไม่ทำลายแบคทีเรียที่เป็นตัวกลางในการถ่ายยีน (เช่น Agrobacterium) และเป็นวิธีสังเคราะห์ทางชีวภาพที่มีต้นทุนต่ำและมีประสิทธิผล

การถ่ายยีนเข้าสู่เซลล์โดยใช้อัลตราซาวนด์ช่วย

การใช้อัลตราซาวนด์เป็นเทคนิคที่ใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ความถี่ต่ำเพื่อกระตุ้นการเคลื่อนที่ของอนุภาคในสารละลายและผสมสารละลาย จึงเพิ่มอัตราการถ่ายเทมวลและการละลาย ในขณะเดียวกัน การใช้อัลตราซาวนด์สามารถกำจัดก๊าซที่ละลายอยู่ในของเหลวได้ ในการถ่ายยีนเข้าสู่พืช การใช้อัลตราซาวนด์จะทำให้เกิดบาดแผลขนาดจุลภาคในเนื้อเยื่อพืช และเพิ่มประสิทธิภาพการนำส่ง DNA เปลือยเข้าสู่โพรโทพลาสต์ของพืช

สำหรับการถ่ายยีน วิธีการถ่ายยีนโดยใช้ Agrobacterium เป็นตัวกลางร่วมกับอัลตราซาวนด์ (SAAT) เป็นวิธีที่นิยมเลือกใช้ และมีประสิทธิภาพสูงกว่าการใช้อัลตราซาวนด์เพื่อถ่าย DNA เปลือยและเวกเตอร์ DNA เข้าสู่โพรโทพลาสต์โดยตรงอย่างมีนัยสำคัญ งานศึกษาจำนวนมากแสดงให้เห็นว่าการถ่ายยีนโดยใช้ Agrobacterium เป็นตัวกลางร่วมกับอัลตราซาวนด์ (SAAT) สามารถใช้กระตุ้นให้เกิดการทำลายเชิงกลและการสร้างบาดแผลบนเซลล์พืชด้วยคลื่นอัลตราซาวนด์และคาวิเทชันทางเสียงที่เกิดขึ้นตามมา การใช้อัลตราซาวนด์เป็นเวลาสั้น ๆ สร้างบาดแผลขนาดจุลภาคบนผิวของชิ้นส่วนพืชที่ใช้เพาะเลี้ยง เนื่องจากเซลล์ที่มีบาดแผลเปิดทางให้ Agrobacterium แทรกซึมเข้าสู่ส่วนที่ลึกกว่าของเนื้อเยื่อพืช จึงเพิ่มโอกาสที่เซลล์พืชจะติดเชื้อ นอกจากนี้ สารประกอบฟีนอลิกที่หลั่งออกมายังช่วยเพิ่มประสิทธิภาพการถ่ายยีน บาดแผลขนาดจุลภาคที่เกิดจากอัลตราซาวนด์ยังช่วยให้แบคทีเรียแทรกซึมเข้าสู่ชิ้นส่วนพืชที่ใช้เพาะเลี้ยงได้ง่ายขึ้นด้วย มีการใช้ SAAT เพื่อถ่ายยีนเข้าสู่พืชได้สำเร็จ โดยเฉพาะพืชชนิดที่ถือว่าต้านทานต่อ Agrobacterium
ข้อดีหลักของ SAAT คือเป็นวิธีที่ง่ายมากและมีต้นทุนต่ำ รวมทั้งช่วยเพิ่มประสิทธิภาพการถ่ายยีนโดยใช้ Agrobacterium เป็นตัวกลางได้อย่างมีนัยสำคัญ นอกเหนือจากการใช้ SAAT ในการถ่ายยีนเข้าสู่ Chenopodium rubrum L. และ Beta vulgaris L. ได้สำเร็จแล้ว วิธีนี้ยังถูกนำไปใช้ในการผลิตโฮโลทอกซินชนิดไวต่อความร้อนของ Escherichia coli ชนิดป่าด้วยเทคนิครีคอมบิแนนต์ และสารเสริมฤทธิ์วัคซีน LT ของ Escherichia coli กลายพันธุ์ใน Nicotiana tabacum ซึ่งตรวจพบไตเตอร์ IgG ที่จำเพาะต่อ LT-B ในระบบร่างกายสูงที่สุดในนก
(เทียบกับ Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka และ R. Baranski, 2014)

ขั้นตอนทั่วไปในการถ่ายยีนเข้าสู่เซลล์พืชผ่านการทำให้เกิดรูพรุนด้วยอัลตราซาวนด์

1. การเตรียมสารพันธุกรรม: เริ่มต้นด้วยการเตรียมสารพันธุกรรมที่ต้องการนำเข้าสู่เซลล์พืช ซึ่งอาจเป็นพลาสมิด DNA, RNA หรือกรดนิวคลีอิกชนิดอื่น
2. การแยกเซลล์พืช: แยกเซลล์พืชที่ต้องการใช้เป็นเป้าหมาย เซลล์เหล่านี้อาจแยกจากเนื้อเยื่อพืชหรือจากการเพาะเลี้ยง ขึ้นอยู่กับการทดลองของคุณ
3. เซลล์แขวนลอย: ทำให้เซลล์พืชแขวนลอยในอาหารเลี้ยงเซลล์หรือบัฟเฟอร์ที่เหมาะสม ขั้นตอนนี้จำเป็นเพื่อให้แน่ใจว่าเซลล์มีสุขภาพดีและอยู่ในสภาวะที่เอื้อต่อการรับยีน
4. การตั้งค่าเครื่องอัลตราซาวนด์: เตรียมเครื่องอัลตราซาวนด์ชนิดโพรบโดยกำหนดค่าพารามิเตอร์สำหรับการใช้อัลตราซาวนด์ไว้ล่วงหน้า เช่น แอมพลิจูด เวลา พลังงาน และอุณหภูมิ จุ่มโพรบอัลตราซาวนด์ลงในเซลล์แขวนลอย
5. การใช้อัลตราซาวนด์: เริ่มขั้นตอนการใช้อัลตราซาวนด์ การสั่นอย่างรวดเร็วของปลายโพรบทำให้เกิดฟองคาวิเทชันในของเหลว ฟองเหล่านี้ขยายตัวและยุบตัวเนื่องจากคลื่นอัลตราซาวนด์ ทำให้เกิดแรงเชิงกลและการไหลระดับจุลภาคในสารแขวนลอย
6. การทำให้เกิดรูพรุนด้วยอัลตราซาวนด์: แรงเชิงกลและการไหลระดับจุลภาคที่เกิดจากคาวิเทชันสร้างรูพรุนและช่องเปิดชั่วคราวในเยื่อหุ้มเซลล์พืช สารพันธุกรรมที่อยู่ในสารแขวนลอยสามารถเข้าสู่เซลล์พืชผ่านรูพรุนเหล่านี้ได้
7. การบ่ม: หลังจากทำให้เกิดรูพรุนด้วยอัลตราซาวนด์แล้ว ให้บ่มเซลล์พืชเพื่อให้เซลล์ฟื้นตัวและเยื่อหุ้มเซลล์กลับมามีเสถียรภาพ ขั้นตอนนี้สำคัญอย่างยิ่งต่อการอยู่รอดของเซลล์และการถ่ายยีนให้สำเร็จ

การถ่ายยีนผ่าน Agrobacterium หรือไลโปโซม

การนำสารพันธุกรรมเข้าสู่เซลล์พืชมีรูปแบบที่ใช้กันทั่วไปสองรูปแบบ โดยใช้ Agrobacterium ซึ่งเป็นสกุลของแบคทีเรียแกรมลบ หรือใช้ไลโปโซมเป็นตัวพาสารพันธุกรรม

• การทำให้เกิดรูพรุนด้วยอัลตราซาวนด์โดยใช้ Agrobacterium เป็นตัวกลาง: Agrobacterium tumefaciens เป็นแบคทีเรียที่ใช้กันทั่วไปในงานพันธุวิศวกรรมพืช ในวิธีนี้ พลาสมิด DNA ที่มียีนที่ต้องการจะถูกนำเข้าสู่ Agrobacterium แล้วจึงนำไปผสมกับเซลล์พืช จากนั้นทำให้เกิดรูพรุนในเซลล์แขวนลอยด้วยเครื่องอัลตราซาวนด์ชนิดโพรบ พลังงานอัลตราซาวนด์ช่วยเพิ่มประสิทธิภาพการถ่ายสารพันธุกรรมจาก Agrobacterium เข้าสู่เซลล์พืช วิธีนี้ใช้กันอย่างแพร่หลายในการดัดแปลงพันธุกรรมพืช
• การทำให้เกิดรูพรุนด้วยอัลตราซาวนด์โดยใช้ไลโปโซมเป็นตัวกลาง: ไลโปโซมเป็นถุงขนาดเล็กที่มีองค์ประกอบเป็นลิพิดและสามารถบรรทุกสารพันธุกรรมได้ ในวิธีนี้ ไลโปโซมที่บรรจุพลาสมิด DNA หรือกรดนิวคลีอิกชนิดอื่นจะถูกนำไปผสมกับเซลล์พืช จากนั้นใช้เครื่องอัลตราซาวนด์ชนิดโพรบเพื่อทำให้เกิดรูพรุนและช่วยให้เซลล์พืชรับไลโปโซมได้ง่ายขึ้น อัลตราซาวนด์ทำลายชั้นลิพิดสองชั้นของไลโปโซม ทำให้สารพันธุกรรมถูกปล่อยเข้าสู่เซลล์พืช วิธีนี้มีประโยชน์สำหรับการศึกษาการแสดงออกของยีนแบบชั่วคราวในเซลล์พืช

ประโยชน์ที่ได้รับการพิสูจน์ทางวิทยาศาสตร์ของการถ่ายยีนโดยใช้ Agrobacterium เป็นตัวกลางร่วมกับอัลตราซาวนด์ (SAAT)

การถ่ายยีนโดยใช้ Agrobacterium เป็นตัวกลางร่วมกับอัลตราซาวนด์ (SAAT) ถูกนำไปใช้กับพืชหลายชนิด การใช้คลื่นอัลตราซาวนด์กับเซลล์พืชเพาะเลี้ยงเป็นเวลาสั้น ๆ และด้วยความรุนแรงค่อนข้างต่ำทำให้เกิดรูพรุน ซึ่งต่อมาช่วยให้ Agrobacterium ที่ทำหน้าที่ขนส่งยีนแทรกซึมเข้าไปได้ลึก ด้านล่างนี้เป็นตัวอย่างงานศึกษาที่แสดงให้เห็นผลที่เป็นประโยชน์ของ SAAT

การถ่ายยีนเข้าสู่อัชวากันธาโดยใช้อัลตราซาวนด์ช่วย

เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพการถ่ายยีนเข้าสู่ W. somnifera (รู้จักกันในชื่ออัชวากันธาหรือวินเทอร์เชอร์รี) Dehdashti และคณะ (2016) ได้ศึกษาการใช้ acetosyringone (AS) และอัลตราซาวนด์
มีการเติม acetosyringone (AS) ในสามขั้นตอน ได้แก่ การเพาะเลี้ยง Agrobacterium ในอาหารเหลว การทำให้ติดเชื้อ Agrobacterium และการเพาะเลี้ยงชิ้นส่วนพืชร่วมกับ Agrobacterium พบว่าการเติม AS 75 μM ลงในการเพาะเลี้ยง Agrobacterium ในอาหารเหลวเหมาะสมที่สุดสำหรับการเหนี่ยวนำยีน vir
การใช้อัลตราซาวนด์เพิ่มเติม (SAAT) ส่งผลให้เกิดการแสดงออกของยีนสูงที่สุด พบว่าการแสดงออกของยีน gusA ในรากขนดีที่สุดเมื่อใบและปลายยอดได้รับอัลตราซาวนด์เป็นเวลา 10 และ 20s ตามลำดับ ประสิทธิภาพการถ่ายยีนของวิธีการที่ปรับปรุงแล้วอยู่ที่ 66.5 และ 59.5% สำหรับชิ้นส่วนใบและปลายยอดที่ใช้เพาะเลี้ยง ตามลำดับ เมื่อเทียบกับวิธีการอื่น พบว่าประสิทธิภาพการถ่ายยีนของวิธีการที่ปรับปรุงแล้วนี้สูงกว่า 2.5 เท่าสำหรับใบ และ 3.7 เท่าสำหรับปลายยอด การวิเคราะห์ด้วยวิธี Southern blot ยืนยันว่ามียีน gusA ที่ถ่ายเข้าไป 1–2 สำเนาในสาย W1-W4 ขณะที่ตรวจพบยีนที่ถ่ายเข้าไป 1–4 สำเนาในสาย W5 ที่ได้จากวิธีการที่ปรับปรุงแล้ว

ผลของระยะเวลาการถ่ายยีนโดยใช้ Agrobacterium เป็นตัวกลางร่วมกับอัลตราซาวนด์ (SAAT) ต่อความถี่ของการถ่ายยีนในชิ้นส่วนใบ (a) และปลายยอด (b) ของ W. somnifera ที่ใช้เพาะเลี้ยง
(การศึกษาและภาพกราฟิก: © Dehdashti et al., 2016)

การถ่ายยีนเข้าสู่ฝ้ายโดยใช้อัลตราซาวนด์ช่วย

Hussain et al. (2007) แสดงให้เห็นผลที่เป็นประโยชน์ของการถ่ายยีนเข้าสู่ฝ้ายโดยใช้อัลตราซาวนด์ช่วย คาวิเทชันทางเสียงที่เกิดจากอัลตราซาวนด์ความถี่ต่ำสร้างบาดแผลขนาดจุลภาคบนและใต้ผิวของเนื้อเยื่อพืช (การทำให้เกิดรูพรุนด้วยอัลตราซาวนด์) และช่วยให้ Agrobacterium เคลื่อนที่เข้าไปได้ลึกขึ้นและทั่วทั้งเนื้อเยื่อพืชอย่างสมบูรณ์ การสร้างบาดแผลในลักษณะนี้เพิ่มโอกาสในการทำให้เซลล์พืชที่อยู่ลึกลงไปในเนื้อเยื่อติดเชื้อ มีการวัดการแสดงออกของยีน GUS เพื่อประเมินประสิทธิภาพการถ่ายยีนด้วย SAAT ระบบรายงานผล GUS เป็นระบบยีนรายงานผลที่มีประโยชน์อย่างยิ่งในงานชีววิทยาระดับโมเลกุลของพืชและจุลชีววิทยา การปรับพารามิเตอร์ต่าง ๆ ของ SAAT ช่วยเพิ่มการแสดงออกของ GUS แบบชั่วคราวในฝ้ายอย่างมีนัยสำคัญ โดยใช้เอ็มบริโอที่เจริญเต็มที่เป็นชิ้นส่วนพืชสำหรับเพาะเลี้ยง ตรวจพบ GUS ครั้งแรกเมื่อผ่านไป 24h หลังการบ่มชิ้นส่วนพืช และเมื่อผ่านไป 48h การแสดงออกของ GUS มีระดับสูงมาก ซึ่งเป็นตัวบ่งชี้ที่มีประโยชน์ว่าการถ่ายยีนเข้าสู่ชิ้นส่วนฝ้ายที่ใช้เพาะเลี้ยงด้วยวิธีการถ่ายยีนโดยใช้ Agrobacterium เป็นตัวกลางร่วมกับอัลตราซาวนด์ (SAAT) ประสบความสำเร็จ เมื่อเปรียบเทียบเทคนิคการถ่ายยีนต่าง ๆ (ได้แก่ การยิงอนุภาค, Agro, BAAT, SAAT) การถ่ายยีนโดยใช้ Agrobacterium เป็นตัวกลางร่วมกับอัลตราซาวนด์ (SAAT) ให้ผลการถ่ายยีนดีที่สุดอย่างเห็นได้ชัด

การเลือกวิธีการถ่ายยีนโดยพิจารณาจากการแสดงออกของ GUS แบบชั่วคราว การถ่ายยีนโดยใช้ Agrobacterium เป็นตัวกลางร่วมกับอัลตราซาวนด์ (SAAT) แสดงให้เห็นการแสดงออกแบบชั่วคราวที่สูงกว่าอย่างมีนัยสำคัญ
(การศึกษาและภาพกราฟิก: © Hussain et al., 2007)

โซลูชันอัลตราซาวนด์สมรรถนะสูงสำหรับการทำให้เกิดรูพรุนด้วยอัลตราซาวนด์และ SAAT

Hielscher Ultrasonics มีประสบการณ์ยาวนานในการพัฒนาและผลิตเครื่องอัลตราซาวนด์สมรรถนะสูงสำหรับห้องปฏิบัติการ สถานวิจัย และการผลิตในระดับอุตสาหกรรมที่มีอัตราการประมวลผลสูงมาก สำหรับงานจุลชีววิทยาและวิทยาศาสตร์ชีวภาพ Hielscher มีโซลูชันหลากหลายเพื่อรองรับความต้องการที่แตกต่างกันตามเนื้อเยื่อเฉพาะชนิดและวิธีจัดการเนื้อเยื่อเหล่านั้น สำหรับการใช้อัลตราซาวนด์กับตัวอย่างจำนวนมากพร้อมกัน Hielscher มี UIP400MTP สำหรับแผ่นหลุมหลายหลุม, VialTweeter สำหรับการใช้อัลตราซาวนด์กับหลอดตัวอย่างได้สูงสุด 10 หลอด (เช่น หลอด Eppendorf) หรือ CupHorn อัลตราซาวนด์ เครื่องอัลตราซาวนด์ชนิดโพรบสำหรับใช้เป็นเครื่องโฮโมจีไนเซอร์ในห้องปฏิบัติการมีให้เลือกตั้งแต่ 50 ถึง 400 วัตต์ ส่วนเครื่องอัลตราซาวนด์ชนิดโพรบสำหรับระบบอุตสาหกรรมครอบคลุมช่วงกำลังตั้งแต่ 500 วัตต์ถึง 16kW
โปรดติดต่อเราและแจ้งการประยุกต์ใช้งานและข้อกำหนดของกระบวนการของคุณ ทีมงานที่มีประสบการณ์ของเรายินดีแนะนำเครื่องอัลตราซาวนด์ที่เหมาะสมที่สุดสำหรับกระบวนการทางชีวภาพของคุณ
ตารางด้านล่างแสดงความสามารถในการประมวลผลโดยประมาณของเครื่องอัลตราซาวนด์ของเรา: