การเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรมในเซลล์พืชโดยใช้อัลตราโซนิก

Sonication-Assisted Agrobacterium-Mediated Transformation (SAAT) เป็นวิธีที่มีประสิทธิภาพในการติดเชื้อในเซลล์พืชด้วยยีนแปลกปลอมโดยใช้ Agrobacterium เป็นตัวขนส่ง โพรงอากาศอัลตราโซนิกทําให้เกิด sonoporation ซึ่งสามารถอธิบายได้ว่าเป็นบาดแผลขนาดเล็กเป้าหมายของเนื้อเยื่อพืช ด้วยการสร้างบาดแผลขนาดเล็กด้วยอัลตราโซนิกเหล่านี้ DNA และ DNA เวกเตอร์สามารถขนส่งเข้าสู่เมทริกซ์เซลล์ได้อย่างมีประสิทธิภาพ

โซโนโพเรชั่น – การเปลี่ยนแปลงเซลล์ที่เพิ่มขึ้นด้วยอัลตราโซนิก

เมื่อใช้อัลตราซาวนด์ความถี่ต่ํา (ประมาณ 20kHz) กับสารแขวนลอยของเซลล์ผลกระทบของโพรงอากาศแบบอะคูสติกทําให้เกิดการซึมผ่านของเยื่อหุ้มเซลล์ชั่วคราว ผลอัลตราโซนิกนี้เรียกว่า sonoporation และใช้สําหรับการถ่ายโอนยีนเข้าสู่เซลล์หรือเนื้อเยื่อ
ข้อดีของอัลตราโซนิกขึ้นอยู่กับหลักการทํางานทางกลที่ไม่ใช่ความร้อนซึ่งทําให้การ sonication มักจะมีความหลากหลายมากขึ้นและขึ้นอยู่กับประเภทของเซลล์น้อยลง การประยุกต์ใช้ sonoporation ที่หลากหลายเปิดโอกาสให้เกิดการใช้พืชดัดแปลงพันธุกรรมซึ่งมีศักยภาพอย่างมากในการผลิตโปรตีนบําบัดที่ซับซ้อนของมนุษย์ เครื่องปฏิกรณ์ชีวภาพจากพืชดังกล่าวสามารถจัดการทางพันธุกรรมได้ง่ายป้องกันการปนเปื้อนที่อาจเกิดขึ้นกับเชื้อโรคของมนุษย์ไม่ทําลายแบคทีเรียที่เป็นสื่อกลางในการเปลี่ยนแปลง (เช่น Agrobacterium) และเป็นวิธีการสังเคราะห์ทางชีวภาพที่มีราคาไม่แพงและมีประสิทธิภาพ

การเปลี่ยนแปลงเซลล์ด้วยอัลตราโซนิกช่วย

Sonication เป็นเทคนิคที่ใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ความถี่ต่ําเพื่อกวนอนุภาคในสารละลายเพื่อผสมสารละลายซึ่งจะช่วยเพิ่มอัตราการถ่ายเทมวลและการละลาย ในขณะเดียวกันการ sonication สามารถกําจัดก๊าซที่ละลายน้ําออกจากของเหลวได้ ในการเปลี่ยนแปลงพืช sonication จะทําให้เกิดการก่อตัวของ microwounds บนเนื้อเยื่อพืชและเพิ่มการส่ง DNA ที่เปลือยเปล่าเข้าสู่โปรโทพลาสต์ของพืช

สําหรับการเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรม Sonication-Assisted Agrobacterium-mediated Transformation (SAAT) เป็นวิธีที่ต้องการและมีประสิทธิภาพสูงกว่า sonication อย่างมีนัยสําคัญที่ใช้ในการถ่ายโอน DNA เปลือยเปล่าและเวกเตอร์ DNA โดยตรงไปยังโปรโทพลาสต์ การศึกษาจํานวนมากแสดงให้เห็นว่า sonication assisted Agrobacterium-mediated transformation (SAAT) สามารถใช้เพื่อกระตุ้นให้เกิดการหยุดชะงักทางกลและการก่อตัวของบาดแผลบนเซลล์พืชโดยคลื่นอัลตราซาวนด์และโพรงอากาศอะคูสติกที่เกิดขึ้น การรักษาด้วยอัลตราโซนิกสั้น ๆ จะสร้างบาดแผลขนาดเล็กบนพื้นผิวของ explants เนื่องจากเซลล์ที่บาดเจ็บจะอนุญาตให้ Agrobacterium แทรกซึมเข้าไปในส่วนที่ลึกกว่าของเนื้อเยื่อพืชจึงเพิ่มโอกาสที่เซลล์พืชจะติดเชื้อ นอกจากนี้ สารประกอบฟีนอลิกที่หลั่งออกมายังช่วยเพิ่มการเปลี่ยนแปลง บาดแผลขนาดเล็กที่สร้างขึ้นด้วยอัลตราโซนิกทําให้แบคทีเรียแทรกซึมเข้าไปของแบคทีเรียเป็นไปได้มากขึ้น SAAT ประสบความสําเร็จในการนํามาใช้สําหรับการเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรมในพันธุ์พืชโดยเฉพาะอย่างยิ่งที่ถือว่าดื้อต่อ Agrobacterium
การเป็นวิธีการที่ง่ายและราคาไม่แพงมากตลอดจนการปรับปรุงอย่างมีนัยสําคัญของการถ่ายโอนยีนที่เป็นสื่อกลางของ Agrobacterium เป็นข้อได้เปรียบที่สําคัญของ SAAT นอกเหนือจากการประยุกต์ใช้ SAAT ที่ประสบความสําเร็จในการเปลี่ยนแปลงของ Chenopodium rubrum L. และ Beta vulgaris L. แล้ว แนวทางนี้ยังถูกนําไปใช้ในการผลิตสารเสริมวัคซีน LT ที่กลายพันธุ์ของ Escherichia coli ชนิดป่า และ Escherichia coli กลายพันธุ์ใน Nicotiana tabacum ซึ่งตรวจพบไทเทร์ IgG เฉพาะ LT-B ในระบบสูงสุดในนก
(อ้างอิง Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka และ R. Baranski, 2014)

ขั้นตอนทั่วไปสําหรับการถ่ายโอนยีนผ่าน Sonoporation ในเซลล์พืช

1. การเตรียมสารพันธุกรรม: เริ่มต้นด้วยการเตรียมสารพันธุกรรมที่คุณต้องการนําเข้าสู่เซลล์พืช นี่อาจเป็นพลาสมิด DNA, RNA หรือกรดนิวคลีอิกอื่นๆ
2. การแยกเซลล์พืช: แยกเซลล์พืชที่คุณต้องการกําหนดเป้าหมาย เซลล์เหล่านี้อาจถูกแยกออกจากเนื้อเยื่อพืชหรือวัฒนธรรมทั้งนี้ขึ้นอยู่กับการทดลองของคุณ
3. การแขวนเซลล์: ระงับเซลล์พืชในอาหารกลางหรือบัฟเฟอร์ที่เหมาะสม นี่เป็นสิ่งสําคัญเพื่อให้แน่ใจว่าเซลล์มีสุขภาพดีและอยู่ในสถานะที่เอื้อต่อการดูดซึมยีน
4. ตั้งค่า Sonicator ของคุณ: เตรียมเครื่องโซนิคเตอร์ชนิดโพรบของคุณโดยพารามิเตอร์การตั้งค่าล่วงหน้าของ sonication เช่น แอมพลิจูด เวลา พลังงาน และอุณหภูมิ จุ่มโพรบอัลตราโซนิกลงในสารแขวนลอยของเซลล์
5. Sonication: เริ่มขั้นตอนการ sonication การสั่นอย่างรวดเร็วของปลายโพรบจะทําให้เกิดฟองอากาศในของเหลว ฟองอากาศเหล่านี้ขยายตัวและยุบตัวเนื่องจากคลื่นอัลตราโซนิกสร้างแรงเชิงกลและไมโครสตรีมมิ่งในระบบกันสะเทือน
6. โซโนโพเรชั่น: แรงเชิงกลและไมโครสตรีมมิ่งที่เกิดจากโพรงอากาศจะสร้างรูพรุนและรูชั่วคราวในเยื่อหุ้มเซลล์พืช สารพันธุกรรมที่มีอยู่ในสารแขวนลอยสามารถเข้าสู่เซลล์พืชผ่านรูขุมขนเหล่านี้ได้
7. การฟักไข่: หลังจากการรักษาด้วยโซโนโพเรชั่นให้บ่มเซลล์พืชเพื่อให้พวกมันฟื้นตัวและทําให้เยื่อหุ้มของพวกมันมีเสถียรภาพ นี่เป็นขั้นตอนสําคัญเพื่อให้แน่ใจว่าเซลล์อยู่รอดและการถ่ายโอนยีนได้สําเร็จ

การถ่ายโอนยีนผ่าน Agrobacterium หรือ Liposomes

มีสองรูปแบบทั่วไปในการถ่ายเซลล์พืช พวกเขาใช้เกษตรแบคทีเรียซึ่งเป็นสกุลของแบคทีเรียแกรมลบหรือไลโปโซมเป็นพาหะของสารพันธุกรรม

• Sonoporation ที่เป็นสื่อกลางของ Agrobacterium: Agrobacterium tumefaciens เป็นแบคทีเรียที่ใช้กันทั่วไปในพันธุวิศวกรรมพืช ในวิธีนี้พลาสมิดดีเอ็นเอที่มียีนที่ต้องการจะถูกนําเข้าสู่ Agrobacterium จากนั้นจึงผสมกับเซลล์พืช สารแขวนลอยของเซลล์อยู่ภายใต้การ sonoporation โดยใช้เครื่องสะท้อนเสียงแบบโพรบ พลังงานอัลตราโซนิกช่วยเพิ่มการถ่ายโอนสารพันธุกรรมจาก Agrobacterium ไปยังเซลล์พืช วิธีนี้ใช้กันอย่างแพร่หลายสําหรับการดัดแปลงพันธุกรรมของพืช
• Sonoporation ที่มีไลโปโซมเป็นสื่อกลาง: ไลโปโซมเป็นถุงไขมันที่สามารถนําสารพันธุกรรมได้ ในวิธีนี้ไลโปโซมที่เต็มไปด้วยพลาสมิดดีเอ็นเอหรือกรดนิวคลีอิกอื่น ๆ จะถูกผสมกับเซลล์พืช Sonoporation โดยใช้ sonicator ชนิดโพรบถูกนํามาใช้เพื่ออํานวยความสะดวกในการดูดซึมไลโปโซมโดยเซลล์พืช อัลตราซาวนด์ขัดขวางไขมันสองชั้นของไลโปโซมปล่อยสารพันธุกรรมเข้าสู่เซลล์พืช วิธีนี้มีประโยชน์สําหรับการศึกษาการแสดงออกของยีนชั่วคราวในเซลล์พืช

ประโยชน์ที่ได้รับการพิสูจน์ทางวิทยาศาสตร์ของ Sonication-Assisted Agrobacterium-Mediated Transformation (SAAT)

Sonication-Assisted Agrobacterium-Mediated Transformation (SAAT) ถูกนําไปใช้กับพืชหลายชนิด การรักษาด้วยอัลตราโซนิกที่สั้นและค่อนข้างอ่อนโยนของการเพาะเลี้ยงเซลล์พืชทําให้เกิด sonoporation ซึ่งต่อมาช่วยให้สามารถเจาะลึกของ Agrobacterium ในฐานะตัวขนส่งยีน ด้านล่างนี้คุณสามารถอ่านการศึกษาที่เป็นแบบอย่างที่แสดงให้เห็นถึงผลประโยชน์ของ SAAT

การเปลี่ยนแปลงด้วยอัลตราโซนิกของ Ashwagandha

เพื่อปรับปรุงประสิทธิภาพการเปลี่ยนแปลงใน W. somnifera (เรียกว่า ashwagandha หรือเชอร์รี่ฤดูหนาว) Dehdashti และเพื่อนร่วมงาน (2016) ได้ตรวจสอบการใช้ acetosyringone (AS) และ sonication
Acetosyringone (AS) ถูกเพิ่มในสามขั้นตอน: การเพาะเลี้ยงของเหลว Agrobacterium, การติดเชื้อ Agrobacterium และการเพาะเลี้ยงร่วมกับ Agrobacterium การเติม AS 75 μM ลงในการเพาะเลี้ยงของเหลว Agrobacterium พบว่าเหมาะสมที่สุดสําหรับการเหนี่ยวนํายีนของไวรัส
การประยุกต์ใช้ sonication เพิ่มเติม (SAAT) ส่งผลให้การแสดงออกของยีนสูงสุด การแสดงออกของยีน gusA ในรากที่มีขนพบว่าดีที่สุดเมื่อใบและปลายหน่อถูก sonicated เป็นเวลา 10 และ 20 วินาทีตามลําดับ ประสิทธิภาพการเปลี่ยนแปลงของโปรโตคอลที่ได้รับการปรับปรุงถูกบันทึกไว้ 66.5 และ 59.5% ในกรณีของ explants ปลายใบและยอดตามลําดับ เมื่อเปรียบเทียบกับโปรโตคอลอื่น ๆ ประสิทธิภาพการแปลงของโปรโตคอลที่ได้รับการปรับปรุงนี้พบว่าสูงขึ้น 2.5 เท่าสําหรับใบและ 3.7 เท่าสําหรับปลายการยิง การวิเคราะห์ Southern blot ยืนยันสําเนา 1-2 สําเนาของ gusA transgene ในสาย W1-W4 ในขณะที่ตรวจพบสําเนา 1-4 transgene ในสาย W5 ที่สร้างขึ้นโดยโปรโตคอลที่ได้รับการปรับปรุง

ผลของระยะเวลาของการเปลี่ยนแปลงที่เป็นสื่อกลางของ Agrobacterium (SAAT) ที่มีต่อความถี่ในการเปลี่ยนแปลงของใบ W. somnifera (a) และปลายหน่อ (b) explants(การศึกษาและกราฟิก: © Dehdashti et al., 2016)

การเปลี่ยนแปลงฝ้ายด้วยอัลตราโซนิกช่วย

Hussain et al. (2007) แสดงให้เห็นถึงผลประโยชน์ของการเปลี่ยนแปลงฝ้ายช่วย sonication โพรงอากาศอะคูสติกที่เกิดจากอัลตราซาวนด์ความถี่ต่ําสร้างบาดแผลขนาดเล็กบนและใต้พื้นผิวของเนื้อเยื่อพืช (sonoporation) และช่วยให้ Agrobacterium เดินทางลึกขึ้นและสมบูรณ์ทั่วเนื้อเยื่อพืช แฟชั่นบาดแผลนี้เพิ่มโอกาสที่จะติดเชื้อในเซลล์พืชที่อยู่ลึกลงไปในเนื้อเยื่อ เพื่อประเมินประสิทธิภาพการเปลี่ยนแปลงของ SAAT ได้วัดการแสดงออกของยีน GUS ระบบผู้รายงาน GUS เป็นระบบยีนผู้รายงาน ซึ่งมีประโยชน์อย่างยิ่งในชีววิทยาโมเลกุลของพืชและจุลชีววิทยา การปรับพารามิเตอร์ SAAT ต่างๆ การแสดงออกชั่วคราวของ GUS ในฝ้ายโดยใช้ตัวอ่อนที่โตเต็มที่เป็น explant เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสําคัญ ตรวจพบ GUS เป็นครั้งแรก 24 ชั่วโมงหลังจากการฟักตัวของ explant และเมื่อถึง 48 ชั่วโมงการแสดงออกของ GUS มีความเข้มข้นมากซึ่งทําหน้าที่เป็นตัวบ่งชี้ที่มีประโยชน์ของการเปลี่ยนแปลงที่ประสบความสําเร็จของ explant ฝ้ายหลังจากการ sonication ช่วยการเปลี่ยนแปลงที่เป็นสื่อกลางของ Agrobacterium (SAAT) การเปรียบเทียบเทคนิคการแปลงต่างๆ (ได้แก่ biolistic, Agro, BAAT, SAAT) การปฏิรูปแบบ Agrobacterium-mediated (SAAT) แสดงให้เห็นถึงผลลัพธ์ที่ดีที่สุดของการเปลี่ยนแปลง

ทางเลือกของขั้นตอนการแปลงบนพื้นฐานของการแสดงออกชั่วคราวของ GUS การแปลงที่เป็นสื่อกลางของ Agrobacterium (SAAT) แสดงการแสดงออกชั่วคราวที่สูงขึ้นอย่างมีนัยสําคัญ(การศึกษาและกราฟิก: © Hussain et al., 2007)

โซลูชั่นอัลตราโซนิกประสิทธิภาพสูงสําหรับ Sonoporation และ SAAT

Hielscher Ultrasonics มีประสบการณ์มาอย่างยาวนานในการพัฒนาและผลิตเครื่องอัลตราโซนิกประสิทธิภาพสูงสําหรับห้องปฏิบัติการสิ่งอํานวยความสะดวกด้านการวิจัยตลอดจนการผลิตทางอุตสาหกรรมที่มีปริมาณงานสูงมาก สําหรับจุลชีววิทยาและวิทยาศาสตร์เพื่อชีวิต Hielscher นําเสนอโซลูชั่นที่หลากหลายเพื่อรองรับความต้องการที่แตกต่างกันที่จําเป็นสําหรับเนื้อเยื่อเฉพาะและการรักษา สําหรับการอัลตราโซนิกพร้อมกันของตัวอย่างจํานวนมาก Hielscher เสนอ UIP400MTP สําหรับแผ่นมัลติเวลล์ VialTweeter สําหรับการ sonication ได้ถึง 10 ขวด (เช่นหลอด Eppendorf) หรืออัลตราโซนิก CupHorn เครื่องอัลตราโซนิกชนิดโพรบมีให้เลือกตั้งแต่ 50 ถึง 400 วัตต์เป็นโฮโมจีไนเซอร์ในห้องปฏิบัติการในขณะที่ระบบอุตสาหกรรมครอบคลุมช่วงพลังงานตั้งแต่ 500 วัตต์ถึง 16kW
โปรดติดต่อเราและแจ้งให้เราทราบเกี่ยวกับข้อกําหนดในการสมัครและกระบวนการของคุณ พนักงานที่มีประสบการณ์ของเรายินดีที่จะแนะนําเครื่องอัลตราโซนิกที่เหมาะสมที่สุดสําหรับกระบวนการทางชีวภาพของคุณ
ตารางด้านล่างให้ข้อบ่งชี้ถึงความสามารถในการประมวลผลโดยประมาณของเครื่องอัลตราโซนิกของเรา: