การสร้างไฟบริลแอมีลอยด์ด้วยเครื่องโซนิเคเตอร์สำหรับไมโครเพลต UIP400MTP

ไฟบริลแอมีลอยด์ก่อตัวผ่านกระบวนการเกิดนิวเคลียสและการเติบโตในลำดับถัดมาเช่นเดียวกับผลึก อย่างไรก็ตาม เนื่องจากการเกิดนิวเคลียสมีอุปสรรคพลังงานอิสระสูง การก่อตัวของไฟบริลแอมีลอยด์ที่เกิดขึ้นเองจึงเกิดขึ้นได้เฉพาะหลังจากผ่านระยะหน่วงที่ยาวนานเท่านั้น การใช้คลื่นอัลตราโซนิกได้กลายเป็นเครื่องมือที่ทรงประสิทธิภาพในการเหนี่ยวนำการเกิดนิวเคลียสของแอมีลอยด์ จึงช่วยเร่งการก่อตัวของไฟบริลได้อย่างมาก เมื่อใช้ร่วมกับเครื่องอ่านไมโครเพลตที่ตรวจวัดการเรืองแสงของ thioflavin T (ThT) การใช้คลื่นอัลตราโซนิกช่วยให้ตรวจหาไฟบริลแอมีลอยด์ในตัวอย่างหลายตัวอย่างพร้อมกันได้ด้วยอัตราการประมวลผลตัวอย่างสูง

การสร้างไฟบริลแอมีลอยด์ที่เหนี่ยวนำด้วยคลื่นอัลตราโซนิกโดยใช้เครื่องโซนิเคเตอร์สำหรับไมโครเพลต UIP400MTP

เครื่องโซนิเคเตอร์สำหรับเพลตหลายหลุม UIP400MTP ช่วยให้สังเคราะห์ไฟบริลแอมีลอยด์ที่มีคุณภาพเท่ากันในปริมาณมากได้อย่างรวดเร็วเพื่อใช้ในการวิจัย แนวทางที่มีประสิทธิภาพนี้ช่วยให้ศึกษาความสามารถของโปรตีนในการก่อแอมีลอยด์ได้ เทคนิคนี้ช่วยให้เกิดไฟบริลแอมีลอยด์ได้อย่างรวดเร็วและทำซ้ำได้ ดังที่แสดงให้เห็นด้วย β2-microglobulin (β2-m) ซึ่งเป็นโปรตีนที่ก่อแอมีลอยด์และเกี่ยวข้องกับโรคแอมีลอยโดซิสที่สัมพันธ์กับการฟอกไต

แนวทางการทดลองอย่างง่าย: การเกิดไฟบริลแอมีลอยด์ที่เหนี่ยวนำด้วยคลื่นอัลตราโซนิก

เพื่อเหนี่ยวนำการก่อตัวของไฟบริล ได้วางไมโครเพลตชนิด 96 หลุมไว้ตรงกลางเครื่องโซนิเคเตอร์สำหรับเพลตหลายหลุม UIP400MTP ซึ่งทำให้ทุกหลุมได้รับคลื่นอัลตราโซนิกอย่างสม่ำเสมอ เงื่อนไขการทดลองมีดังนี้:

1. แต่ละหลุมบรรจุสารละลาย β2-microglobulin ปริมาตร 0.2 ml (0.3 mg/ml, pH 2.5) ที่เติม ThT ความเข้มข้น 5 μM
2. เพลตได้รับการบำบัดด้วยคลื่นอัลตราโซนิกเป็นรอบ เช่น ใช้คลื่นอัลตราโซนิกเป็นเวลา 1 นาที ตามด้วยการพัก 9 นาที
3. หลังการบำบัดด้วยคลื่นอัลตราโซนิก ได้วัดการเรืองแสงของ ThT ด้วยเครื่องอ่านไมโครเพลต

(ดูประกอบ So et al., 2011)

การเปรียบเทียบกับการเขย่าแบบทั่วไป

เมื่อเปรียบเทียบกับวิธีการเขย่าแบบดั้งเดิม การใช้คลื่นอัลตราโซนิกช่วยลดระยะหน่วงของการก่อตัวของไฟบริลได้อย่างมาก ภายใต้เงื่อนไขการเขย่าไมโครเพลตแบบทั่วไป มีเพียง 1 จาก 10 หลุมเท่านั้นที่แสดงการเรืองแสงของ ThT เพิ่มขึ้นหลังผ่านไป 20 ชั่วโมง ในทางตรงกันข้าม เมื่อใช้คลื่นอัลตราโซนิกเป็นรอบ (ใช้คลื่นอัลตราโซนิก 15 นาที ตามด้วยการปล่อยให้อยู่นิ่ง 5 นาที) ตรวจพบการเรืองแสงของ ThT เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญทันทีหลังการบำบัดด้วยคลื่นอัลตราโซนิกครั้งแรก

การเร่งจลนพลศาสตร์ของการเกิดไฟบริลอย่างรวดเร็ว

ผลการศึกษาของ So et al. (2011) แสดงให้เห็นว่าสามารถใช้คลื่นอัลตราโซนิกเร่งการก่อตัวของไฟบริลที่เกิดขึ้นเองของ β2-microglobulin ที่ pH 2.5 จากหลายชั่วโมงให้เหลือเพียง 10–15 นาทีได้
ภาพจากกล้องจุลทรรศน์แรงอะตอม (AFM) ยืนยันว่าไฟบริลที่สร้างโดยใช้คลื่นอัลตราโซนิกเป็นเวลา 10 นาทีทุก 15 นาที มีสัณฐานวิทยาที่ไม่สามารถแยกความแตกต่างจากไฟบริลที่สร้างโดยใช้คลื่นอัลตราโซนิกเป็นเวลา 1 นาทีทุก 10 นาทีได้ ผลนี้เน้นย้ำถึงความสามารถในการทำซ้ำและความคงเส้นคงวาของการเกิดไฟบริลแอมีลอยด์ที่เหนี่ยวนำด้วยคลื่นอัลตราโซนิก

ภาพ AFM ของไฟบริลแอมีลอยด์ที่สร้างโดยใช้คลื่นอัลตราโซนิกเป็นเวลา 1 min ทุก 10 min (i) โดยใช้คลื่นอัลตราโซนิกเป็นเวลา 10 min ทุก 15 min (ii) และโดยปฏิกิริยาที่ใช้เมล็ดตั้งต้นโดยไม่ใช้คลื่นอัลตราโซนิก (iii) แถบมาตราส่วนสีขาวแสดงความยาว 1 μm
การศึกษาและภาพ: ©So et al., 2011

การเกิดไฟบริลภายใต้สภาวะ pH เป็นกลาง

แม้ภายใต้สภาวะ pH เป็นกลาง ก็สามารถทำให้เกิดไฟบริลได้หลังจากระยะหน่วง 1.5 ชั่วโมง ซึ่งแสดงให้เห็นว่าการใช้คลื่นอัลตราโซนิกช่วยลดอุปสรรคด้านพลังงานของการเกิดนิวเคลียสและการเติบโตได้อย่างมาก ผลนี้ยังสนับสนุนสมมติฐานที่ว่าการเกิดไฟบริลแอมีลอยด์เป็นปฏิกิริยาทางกายภาพเป็นหลัก โดยส่วนใหญ่ถูกจำกัดด้วยอุปสรรคด้านพลังงานของการเกิดนิวเคลียส ซึ่งการใช้คลื่นอัลตราโซนิกช่วยลดได้อย่างมีประสิทธิภาพ

ผลต่อการวิจัยโรคที่เกี่ยวข้องกับแอมีลอยด์

การสร้างไฟบริลแอมีลอยด์ได้อย่างง่ายดายและเชื่อถือได้ด้วยเครื่องโซนิเคเตอร์สำหรับไมโครเพลต UIP400MTP มีนัยสำคัญอย่างยิ่งต่อการวิจัยโรคอัลไซเมอร์ (AD) และโรคอื่น ๆ ที่เกี่ยวข้องกับแอมีลอยด์ เช่น โรคพาร์กินสัน โรคเบาหวานชนิด II และโรคแอมีลอยโดซิสทั่วร่างกาย ในโรค AD การรวมตัวของแอมีลอยด์-β (Aβ) เป็นลักษณะบ่งชี้ทางพยาธิวิทยาที่สำคัญ แต่การศึกษาจลนพลศาสตร์ของการเกิดไฟบริลยังคงมีความท้าทายเนื่องจากระยะหน่วงที่ยาวนานและความแปรปรวนของวิธีการแบบทั่วไป การสร้างไฟบริลด้วยคลื่นอัลตราโซนิกช่วยเร่งการเกิดนิวเคลียส ทำให้มั่นใจได้ถึงความสามารถในการทำซ้ำที่สูงและความแปรปรวนที่ลดลง ซึ่งมีความสำคัญอย่างยิ่งต่อการคัดกรองสารที่อาจมีฤทธิ์ยับยั้งและการทำความเข้าใจกลไกการก่อแอมีลอยด์ นอกจากนี้ ความสามารถในการประมวลผลตัวอย่างด้วยอัตราสูงของ UIP400MTP ยังช่วยให้ศึกษาการพับตัวผิดรูปและการรวมตัวของโปรตีนในระดับขนาดใหญ่ได้ เอื้อต่อการค้นพบสารรักษาที่สามารถปรับการก่อตัวของไฟบริลและอาจบรรเทาการดำเนินของภาวะเสื่อมของระบบประสาทได้

การศึกษานี้แสดงให้เห็นว่าการใช้คลื่นอัลตราโซนิกด้วยเครื่องโซนิเคเตอร์สำหรับเพลตหลายหลุม UIP400MTP เป็นวิธีที่มีประสิทธิภาพสูงในการเร่งการก่อตัวของไฟบริลแอมีลอยด์ ข้อได้เปรียบสำคัญของแนวทางนี้ ได้แก่:

• ลดระยะหน่วงของการเกิดไฟบริลได้อย่างมาก
• ทุกหลุมได้รับคลื่นอัลตราโซนิกอย่างสม่ำเสมอ ทำให้การสร้างไฟบริลสามารถทำซ้ำได้
• มีความสามารถในการคัดกรองตัวอย่างด้วยอัตราสูง จึงเหมาะสำหรับการค้นหาความสามารถของโปรตีนในการก่อแอมีลอยด์ทั่วทั้งจีโนม

เมื่อผสานการใช้คลื่นอัลตราโซนิกเข้ากับการตรวจวัดการเรืองแสงของ ThT วิธีนี้ให้แพลตฟอร์มที่รวดเร็ว สามารถขยายขนาดได้ และเชื่อถือได้สำหรับการศึกษาการเกิดไฟบริลแอมีลอยด์ ด้วยประสิทธิภาพและศักยภาพในการประมวลผลตัวอย่างด้วยอัตราสูง แนวทางนี้อาจช่วยให้สังเคราะห์ไฟบริลแอมีลอยด์ได้อย่างง่ายดายสำหรับการวิจัยด้านชีวฟิสิกส์และเภสัชศาสตร์ โดยเป็นเครื่องมือที่มีแนวโน้มดีสำหรับการศึกษาที่เกี่ยวข้องกับแอมีลอยด์และการคัดกรองยา