การสร้างอะไมลอยด์ไฟบริลโดยใช้เครื่องโซนิคเตอร์ไมโครเพลท UIP400MTP

เส้นใยอะไมลอยด์เหมือนกับผลึกก่อตัวขึ้นผ่านกระบวนการสร้างนิวเคลียสและการเจริญเติบโตที่ตามมา อย่างไรก็ตามเนื่องจากอุปสรรคพลังงานอิสระสูงของการเกิดนิวเคลียสการสร้างอะไมลอยด์ที่เกิดขึ้นเองจึงเกิดขึ้นหลังจากระยะล่าช้าเป็นเวลานานเท่านั้น อัลตราโซนิกได้กลายเป็นเครื่องมือที่มีประสิทธิภาพในการกระตุ้นให้เกิดนิวเคลียสอะไมลอยด์ซึ่งจะช่วยเร่งการสร้างไฟบริกได้อย่างมีนัยสําคัญ เมื่อรวมกับเครื่องอ่านไมโครเพลทโดยใช้การเรืองแสงไทโอฟลาวิน T (ThT) อัลตราโซนิกช่วยให้สามารถตรวจจับเส้นใยอะไมลอยด์ในหลายตัวอย่างพร้อมกันได้

การก่อตัวของเส้นใยอะไมลอยด์ที่เหนี่ยวนําด้วยอัลตราโซนิกด้วยเครื่องโซนิคเตอร์ไมโครเพลท UIP400MTP

ด้วยเครื่อง sonicator แผ่นหลายหลุม UIP400MTP อะไมลอยด์ไฟบริลที่มีคุณภาพเท่ากันในปริมาณมากสามารถสังเคราะห์ได้อย่างรวดเร็วเพื่อวัตถุประสงค์ในการวิจัย วิธีการที่มีประสิทธิภาพนี้ช่วยให้สามารถศึกษาการเกิดอะไมลอยด์ของโปรตีนได้ เทคนิคนี้ช่วยอํานวยความสะดวกในการเกิดภาวะหัวใจแบบอะไมลอยด์อย่างรวดเร็วและทําซ้ําได้ ดังที่แสดงให้เห็นกับ β2-microglobulin (β2-m) ซึ่งเป็นโปรตีนอะไมลอยด์เจนิกที่เกี่ยวข้องกับอะไมลอยโดซิสที่เกี่ยวข้องกับการฟอกไต

วิธีการทดลองอย่างง่าย: การสั่นสะเทือนของอะไมลอยด์ที่เกิดจากอัลตราโซนิก

เพื่อกระตุ้นให้เกิดเส้นใยไมโครเพลท 96 หลุมถูกวางไว้ที่กึ่งกลางของเครื่องสะท้อนเสียงแบบหลายหลุม UIP400MTP ซึ่งช่วยให้มั่นใจได้ว่าการเปิดรับแสงอัลตราโซนิกสม่ําเสมอในทุกหลุม เงื่อนไขการทดลองมีดังนี้:

1. แต่ละหลุมมีสารละลาย β2-microglobulin 0.2 มล. (0.3 มก./มล., pH 2.5) เสริมด้วย 5 μM ThT
2. แผ่นอยู่ภายใต้รอบอัลตราโซนิกเช่นอัลตราโซนิก 1 นาทีตามด้วยการหยุดชั่วคราว 9 นาที
3. หลังการ sonication การเรืองแสง ThT ถูกวัดโดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลท

(อ้างอิง So et al., 2011)

เปรียบเทียบกับการกวนแบบธรรมดา

เมื่อเทียบกับวิธีการกวนแบบดั้งเดิมอัลตราโซนิกช่วยลดระยะล่าช้าของการก่อตัวของเส้นใยได้อย่างมาก ภายใต้สภาวะการเขย่าไมโครเพลททั่วไป มีเพียง 1 ใน 10 หลุมเท่านั้นที่แสดงการเรืองแสง ThT ที่เพิ่มขึ้นหลังจากผ่านไป 20 ชั่วโมง ในทางตรงกันข้ามการใช้อัลตราโซนิกแบบหมุนเวียน (sonication 15 นาทีตามด้วยความสงบ 5 นาที) ตรวจพบการเรืองแสง ThT ที่เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสําคัญทันทีหลังจากการรักษาด้วยคลื่นเสียงครั้งแรก

การเร่งความเร็วอย่างรวดเร็วของจลนศาสตร์ Fibrillation

ผลลัพธ์ที่ได้จาก So et al. (2011) แสดงให้เห็นว่าการก่อตัวของเส้นใยที่เกิดขึ้นเองของ β2-microglobulin ที่ pH 2.5 สามารถเร่งได้จากหลายชั่วโมงเหลือเพียง 10-15 นาทีด้วยอัลตราโซนิก
ภาพกล้องจุลทรรศน์แรงอะตอม (AFM) ยืนยันว่าเส้นใยที่เกิดจากอัลตราโซนิก 10 นาทีทุกๆ 15 นาทีนั้นแยกไม่ออกจากสัณฐานวิทยาจากที่เกิดจากอัลตราโซนิก 1 นาทีทุกๆ 10 นาที สิ่งนี้เน้นย้ําถึงความสามารถในการทําซ้ําและความทนทานของการสั่นสะเทือนของอะไมลอยด์ที่เกิดจากอัลตราโซนิก

ภาพ AFM ของอะไมลอยด์ไฟบริลที่ผลิตโดยอัลตราโซนิก 1 นาทีทุกๆ 10 นาที (i) โดยการ sonication 10 นาทีทุกๆ 15 นาที (ii) และโดยปฏิกิริยาการเพาะเมล็ดโดยไม่มีอัลตราโซนิก (iii) แถบมาตราส่วนสีขาวหมายถึง 1 μm
การศึกษาและภาพ: ©So et al., 2011

การเกิดอาการสั่นพลิ้วที่สภาวะ pH เป็นกลาง

แม้จะอยู่ภายใต้สภาวะ pH ที่เป็นกลางการสร้างเส้นใยก็ทําได้หลังจากเวลาล่าช้า 1.5 ชั่วโมงซึ่งแสดงให้เห็นว่าอัลตราโซนิกช่วยลดอุปสรรคด้านพลังงานในการเกิดนิวเคลียสและการเจริญเติบโตได้อย่างมีนัยสําคัญ สิ่งนี้สนับสนุนสมมติฐานที่ว่าการสั่นสะเทือนของอะไมลอยด์เป็นปฏิกิริยาทางกายภาพเป็นหลักซึ่งส่วนใหญ่ถูก จํากัด โดยอุปสรรคพลังงานนิวเคลียสซึ่งอัลตราโซนิกช่วยลดได้อย่างมีประสิทธิภาพ

ผลกระทบต่อการวิจัยโรคที่เกี่ยวข้องกับอะไมลอยด์

การก่อตัวของเส้นใยอะไมลอยด์ที่ง่ายและเชื่อถือได้โดยใช้เครื่อง sonicator ไมโครเพลท UIP400MTP มีนัยสําคัญสําหรับการวิจัยโรคอัลไซเมอร์ (AD) และความผิดปกติอื่น ๆ ที่เกี่ยวข้องกับอะไมลอยด์เช่นโรคพาร์กินสันเบาหวานชนิดที่ 2 และอะไมลอยด์ในระบบ ใน AD การรวมตัวของ amyloid-β (Aβ) เป็นจุดเด่นทางพยาธิวิทยาที่สําคัญ แต่การศึกษาจลนศาสตร์ของการสั่นสะเทือนยังคงท้าทายเนื่องจากระยะล่าช้าและความแปรปรวนในวิธีการทั่วไป การสร้างเส้นใยที่ขับเคลื่อนด้วยอัลตราโซนิกช่วยเร่งการสร้างนิวเคลียสทําให้มั่นใจได้ถึงความสามารถในการทําซ้ําสูงและลดความแปรปรวนซึ่งเป็นสิ่งสําคัญสําหรับการคัดกรองสารยับยั้งที่อาจเกิดขึ้นและทําความเข้าใจกลไก amyloidogenic นอกจากนี้ ความสามารถด้านปริมาณงานสูงของ UIP400MTP ยังช่วยให้สามารถตรวจสอบปริมาณโปรตีนที่พับและการรวมตัวกันในวงกว้าง ซึ่งอํานวยความสะดวกในการค้นพบสารบําบัดที่สามารถปรับการสร้างเส้นใยและอาจลดความก้าวหน้าของระบบประสาทเสื่อม

การศึกษานี้สร้างอัลตราโซนิกโดยใช้เครื่องโซนิกแผ่นหลายหลุม UIP400MTP เป็นวิธีที่มีประสิทธิภาพสูงในการเร่งการสร้างเส้นใยอะไมลอยด์ ข้อได้เปรียบที่สําคัญของแนวทางนี้ ได้แก่ :

• ลดเวลาล่าช้าสําหรับการเกิดภาวะเต้นผิดจังหวะลงอย่างมาก
• การเปิดรับอัลตราซาวนด์ที่สม่ําเสมอในทุกหลุมทําให้สามารถสร้างเส้นใยที่ทําซ้ําได้
• ความสามารถในการคัดกรองปริมาณงานสูง ทําให้เหมาะสําหรับการค้นหาการเกิดโปรตีนอะไมลอยด์ทั่วทั้งจีโนม

ด้วยการรวมอัลตราโซนิกเข้ากับการตรวจจับการเรืองแสง ThT วิธีนี้เป็นแพลตฟอร์มที่รวดเร็วปรับขนาดได้และเชื่อถือได้สําหรับการศึกษาภาวะหัวใจแบบอะไมลอยด์ ด้วยประสิทธิภาพและศักยภาพในการรับส่งข้อมูลสูงวิธีการนี้อาจอํานวยความสะดวกในการสังเคราะห์เส้นใยอะไมลอยด์ที่ง่ายดายสําหรับการวิจัยทางชีวฟิสิกส์และเภสัชกรรมซึ่งเป็นเครื่องมือที่มีแนวโน้มสําหรับการศึกษาที่เกี่ยวข้องกับอะไมลอยด์และการคัดกรองยา