PMCA สําหรับการตรวจจับพรีออนที่มีปริมาณงานสูงโดยใช้ UIP400MTP Sonicator

เครื่อง sonicator แบบเพลทหลายหลุม UIP400MTP นําเสนอโซลูชันที่มีประสิทธิภาพสําหรับการเตรียมตัวอย่างที่มีปริมาณงานสูงในการขยายไซโคริชโปรตีน ด้วยการกระจายพลังงานที่สม่ําเสมอในหลายหลุมและรักษาพารามิเตอร์ sonication ที่แม่นยําระบบนี้ช่วยให้สามารถประมวลผลตัวอย่างจํานวนมากพร้อมกันด้วยความสามารถในการทําซ้ําที่ยอดเยี่ยม ความสามารถเหล่านี้มีความสําคัญอย่างยิ่งสําหรับการเพิ่มประสิทธิภาพ PMCA เพื่อตรวจจับพรีออนที่ความเข้มข้นต่ําในตัวอย่างทางชีวภาพที่ท้าทาย เช่น น้ําลาย ซึ่งสารยับยั้งการทดสอบสามารถบดบังผลลัพธ์ได้

โรคพรีออน เช่น โรคการสูญเสียเรื้อรัง (CWD) ในปากมดลูกและโรค Creutzfeldt-Jakob (CJD) ในมนุษย์ เป็นความผิดปกติของระบบประสาทที่เกิดจากโปรตีนพรีออนที่พับผิด (PrP^{เอสซี}). โรคเหล่านี้มักเกี่ยวข้องกับพรีออนที่ติดเชื้อในระดับต่ําในของเหลวในร่างกาย เช่น น้ําลาย เลือด และปัสสาวะ ทําให้การวินิจฉัยและการวิจัยซับซ้อนขึ้น การแพร่กระจายของ CWD ในแนวนอนผ่านพรีออนที่หลั่งออกมาในเมทริกซ์สิ่งแวดล้อมมีนัยสําคัญอย่างยิ่งต่อการจัดการสัตว์ป่าและสุขภาพระบบนิเวศ ในทํานองเดียวกันในโรคเช่นโรค Creutzfeldt-Jakob การขยายโปรตีนพรีออนที่พับผิดจากตัวอย่างของมนุษย์อย่างน่าเชื่อถือเป็นสิ่งสําคัญสําหรับการพัฒนาการวินิจฉัยและทําความเข้าใจการลุกลามของโรค

การใช้โปรโตคอล PMCA ที่ดัดแปลงช่วยให้สามารถข้ามสารยับยั้งการทดสอบทั่วไป (เช่น เมือกในน้ําลาย) และบรรลุความไวสูงในการตรวจจับพรีออนที่ตรวจไม่พบหรือคลุมเครือโดยใช้เทคนิคต่างๆ เช่น การแปลงที่เกิดจากการสั่นสะเทือนแบบเรียลไทม์ (RT-QuIC) ความก้าวหน้าเหล่านี้ช่วยเพิ่มการตรวจจับพรีออนสําหรับโรคต่างๆ ทําให้ PMCA เป็นเครื่องมือที่ขาดไม่ได้สําหรับการวิจัยและการวินิจฉัยพรีออน เครื่องสะท้อนเสียงแบบหลายหลุม UIP400MTP อํานวยความสะดวกในการ PMCA ที่มีปริมาณงานสูงในการ sonicating ตัวอย่างจํานวนมากในไมโครเพลท (เช่นแผ่น 6, 24 หรือ 96 หลุม) หรือขวดในชั้นวางหลอด

โปรโตคอลสําหรับการขยายไซคลิกการพับโปรตีนปริมาณงานสูง (PMCA)

โปรโตคอลต่อไปนี้ช่วยให้สามารถประมวลผลจํานวนตัวอย่างสูงได้อย่างมีประสิทธิภาพภายใต้สภาวะเดียวกันทุกประการเพื่อผลการวิจัยที่มีประสิทธิภาพ

การเตรียมตัวอย่าง

วัสดุเริ่มต้น:
เตรียมตัวอย่างโดย:

• ระงับเม็ดสกัด sarkosyl ในสารตั้งต้น PMCA
• การทําให้เป็นเนื้อเดียวกันในสมองหรือตัวอย่างเลือดโดยตรงด้วยเมล็ดพรีออน

พื้น ผิว:

• ใช้โฮโมจีเนตสมอง 10% (wt/vol) ที่เตรียมจากหนูดัดแปลงพันธุกรรมที่แสดง PrP มากเกินไป^C (เช่น หนู Tg)
• ทําให้เนื้อเยื่อสมองเป็นเนื้อเดียวกันใน:
  – 1× พีบีเอส
  – 150 มิลลิเมตร NaCl
  – ไทรทัน เอ็กซ์-100 1%
• เก็บวัสดุพิมพ์ไว้ที่ -80ºC จนกว่าจะใช้งาน

การตั้งค่าตัวอย่างในไมโครเพลทหรือหลอด:
หลอด:

• เติมสารตั้งต้นที่เป็นเนื้อเดียวกันของสมอง 90 μL และเมล็ดด้วยตัวอย่าง 10 μL (เช่น เลือด โฮโมจีเนตในสมอง หรือเม็ด sarkosyl)
• วางลูกปัดเทฟลอน 3 เม็ด (เส้นผ่านศูนย์กลาง 1.59 มม. หรือ 2.38 มม.) ในแต่ละหลอดขนาด 0.2 มล.
• ติดตั้งท่อในชั้นวางที่เข้ากันได้กับเครื่องสะท้อนเสียง UIP400MTP

ไมโครเพลท 6 หลุม:

• เติมสารตั้งต้นที่เป็นเนื้อเดียวกันของสมอง 5 มล. และเมล็ดด้วยตัวอย่าง 500 μL ต่อหลุม
• เพิ่มลูกปัดเทฟลอน 3 เม็ดลงในแต่ละหลุม

ขั้นตอน PMCA

ตำแหน่ง:
วางชั้นวางท่อหรือไมโครเพลท 6 หลุมลงในเครื่องสะท้อนเสียง UIP400MTP ตามคําแนะนําของผู้ผลิต

โปรแกรมปั่นจักรยาน:
ดําเนินการ 144 รอบ PMCA ดังนี้:

• การฟักตัว: 29 นาที 30 วินาทีที่ 37°C
• Sonication: 30 วินาทีที่แอมพลิจูด 60%
• ตรวจสอบอุณหภูมิ: ใช้เซ็นเซอร์อุณหภูมิแบบเสียบได้เพื่อตรวจสอบ samp อุณหภูมิและตั้งโปรแกรม UIP400MTP ให้สูงสุด อุณหภูมิ 48–50°C

รอบต่อมา:
หลังจากเสร็จสิ้นรอบแรกของ 144 รอบแล้ว ให้โอนส่วนแบ่งของวัสดุที่ขยาย:

• เจือจาง 10 เท่าลงในสารตั้งต้นที่เป็นเนื้อเดียวกันของสมองหนูดัดแปลงพันธุกรรมสด
• ดําเนินการ 96 รอบ PMCA สําหรับรอบถัดไปโดยรักษาพารามิเตอร์ sonication เดียวกัน
• ดําเนินการต่อตามจํานวนรอบที่ต้องการ (โดยทั่วไปไม่เกิน 5 รอบ)

การตรวจจับ PrP^{เอสซี}

1. การย่อยโปรตีน K:
   – รักษาตัวอย่างด้วยโปรตีน K (50 ไมโครกรัม/มล.) ที่อุณหภูมิ 37°C เป็นเวลา 1 ชั่วโมง
   – ยุติการย่อยโดยเติมบัฟเฟอร์ตัวอย่าง SDS และต้มเป็นเวลา 10 นาที
2. การวิเคราะห์ Western Blot:
   – วิเคราะห์ตัวอย่างที่ย่อยได้โดยใช้:
   – แอนติบอดีต่อต้าน PrP 6H4 หรือ PRC1
   – ดําเนินการ SDS-PAGE และถ่ายโอนไปยังเมมเบรน PVDF เพื่อตรวจจับ

 

 

ประมวลผลตัวอย่างได้มากขึ้นเพื่อผลลัพธ์ที่มีประสิทธิภาพมากขึ้น

เครื่อง sonicator แบบเพลทหลายหลุม UIP400MTP ช่วยเพิ่มประสิทธิภาพและความสามารถในการปรับขนาดของการขยายแบบวนรอบการพับโปรตีนผิดพลาด (PMCA) อย่างมีนัยสําคัญ โดยจัดการกับลักษณะที่ใช้เวลานานตามประเพณีของขั้นตอน ด้วยการอนุญาตให้ประมวลผลตัวอย่างได้ถึง 96 ตัวอย่างพร้อมกันในแผ่น 96 หลุมระบบจะช่วยเพิ่มความคล่องตัวให้กับเวิร์กโฟลว์ PMCA ในขณะที่รักษาสภาพการ sonication ที่แม่นยําและสม่ําเสมอในทุกหลุม ความสามารถในการรับส่งข้อมูลสูงนี้ช่วยลดการจัดการด้วยตนเองลดขั้นตอนที่ใช้แรงงานมากและรับประกันความสามารถในการทําซ้ําทําให้เป็นเครื่องมือที่ขาดไม่ได้สําหรับการวิจัยพรีออน ไม่ว่าจะเป็นการตรวจสอบโรคการสูญเสียเรื้อรังหรือโรค Creutzfeldt-Jakob UIP400MTP อํานวยความสะดวกในการศึกษาขนาดใหญ่ที่มีประสิทธิภาพมากขึ้นช่วยให้นักวิจัยสามารถตอบสนองความต้องการของการวินิจฉัยและการประยุกต์ใช้ทางวิทยาศาสตร์ที่ทันสมัย

---

---

วรรณกรรม / อ้างอิง

• FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
• De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
• Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
• Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
• Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
• Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.