PMCA สำหรับการตรวจหาพรีออนจำนวนมากโดยใช้เครื่องอัลตราโซนิก UIP400MTP

เครื่องอัลตราโซนิกสำหรับเพลตหลายหลุม UIP400MTP เป็นโซลูชันที่ทรงประสิทธิภาพสำหรับการเตรียมตัวอย่างจำนวนมากในการเพิ่มปริมาณโปรตีนที่พับผิดรูปแบบเป็นวัฏจักร (PMCA) ด้วยการกระจายพลังงานอย่างสม่ำเสมอทั่วหลายหลุมและรักษาพารามิเตอร์การใช้คลื่นอัลตราโซนิกอย่างแม่นยำ ระบบนี้จึงสามารถประมวลผลตัวอย่างจำนวนมากพร้อมกันโดยให้ผลที่ทำซ้ำได้อย่างดีเยี่ยม ความสามารถเหล่านี้มีความสำคัญอย่างยิ่งต่อการปรับ PMCA ให้เหมาะสมสำหรับการตรวจหาพรีออนที่มีความเข้มข้นต่ำในตัวอย่างทางชีวภาพที่วิเคราะห์ได้ยาก เช่น น้ำลาย ซึ่งสารยับยั้งการทดสอบอาจบดบังผลการตรวจได้

โรคพรีออน เช่น โรคผอมแห้งเรื้อรัง (CWD) ในสัตว์วงศ์กวาง และโรคครอยตซ์เฟลดต์–ยาคอบ (CJD) ในมนุษย์ เป็นโรคความเสื่อมของระบบประสาทที่เกิดจากโปรตีนพรีออนที่พับผิดรูป (PrP^Sc) โรคเหล่านี้มักเกี่ยวข้องกับพรีออนที่ก่อการติดเชื้อในระดับต่ำในของเหลวในร่างกาย เช่น น้ำลาย เลือด และปัสสาวะ ซึ่งทำให้การวินิจฉัยและการวิจัยมีความซับซ้อน การแพร่เชื้อ CWD ในแนวราบผ่านพรีออนที่ถูกขับออกมาในตัวกลางสิ่งแวดล้อมมีผลกระทบอย่างมีนัยสำคัญเป็นพิเศษต่อการจัดการสัตว์ป่าและสุขภาวะของระบบนิเวศ ในทำนองเดียวกัน สำหรับโรคต่าง ๆ เช่น โรคครอยตซ์เฟลดต์–ยาคอบ การเพิ่มปริมาณโปรตีนพรีออนที่พับผิดรูปจากตัวอย่างมนุษย์อย่างเชื่อถือได้มีความสำคัญอย่างยิ่งต่อการพัฒนาการวินิจฉัยและการทำความเข้าใจการดำเนินโรค

การใช้วิธีดำเนินการ PMCA ที่ปรับปรุงแล้วช่วยหลีกเลี่ยงผลของสารยับยั้งการทดสอบที่พบบ่อย (เช่น มิวซินในน้ำลาย) และให้ความไวสูงในการตรวจหาพรีออนที่หากใช้เทคนิคอื่น เช่น การเปลี่ยนรูปที่เหนี่ยวนำด้วยการเขย่าแบบเรียลไทม์ (RT-QuIC) อาจตรวจไม่พบหรือให้ผลการตรวจที่ไม่ชัดเจน ความก้าวหน้าเหล่านี้ช่วยเพิ่มความสามารถในการตรวจหาพรีออนสำหรับโรคต่าง ๆ ทำให้ PMCA เป็นเครื่องมือที่ขาดไม่ได้สำหรับการวิจัยและการวินิจฉัยพรีออน เครื่องอัลตราโซนิกสำหรับเพลตหลายหลุม UIP400MTP ช่วยให้ทำ PMCA กับตัวอย่างจำนวนมากได้โดยใช้คลื่นอัลตราโซนิกกับตัวอย่างจำนวนมากในไมโครเพลต (เช่น เพลต 6, 24 หรือ 96 หลุม) หรือขวดตัวอย่างในแร็กหลอด

วิธีดำเนินการเพิ่มปริมาณโปรตีนที่พับผิดรูปแบบเป็นวัฏจักร (PMCA) สำหรับตัวอย่างจำนวนมาก

วิธีดำเนินการต่อไปนี้ช่วยให้ประมวลผลตัวอย่างจำนวนมากได้อย่างมีประสิทธิภาพภายใต้สภาวะที่เหมือนกันทุกประการ เพื่อให้ได้ผลการวิจัยที่น่าเชื่อถือ

การเตรียมตัวอย่าง

วัสดุเริ่มต้น:
เตรียมตัวอย่างโดย:

• แขวนลอยตะกอนจากการสกัดด้วย sarkosyl อีกครั้งในซับสเตรต PMCA
• เติมเชื้อพรีออนตั้งต้นลงในโฮโมจีเนตสมองหรือตัวอย่างเลือดโดยตรง

ซับสเตรต:

• ใช้โฮโมจีเนตสมอง 10% (wt/vol) ที่เตรียมจากหนูดัดแปลงพันธุกรรมที่แสดงออก PrP^C ในระดับสูงกว่าปกติ (เช่น หนู Tg)
• ทำให้เนื้อเยื่อสมองเป็นเนื้อเดียวกันใน:
  – 1× PBS
  – 150 mM NaCl
  – 1% Triton X-100
• เก็บซับสเตรตไว้ที่ -80ºC จนกว่าจะใช้

การจัดเตรียมตัวอย่างในไมโครเพลตหรือหลอด:
หลอด:

• เติมซับสเตรตโฮโมจีเนตสมอง 90 μL และเติมตัวอย่าง 10 μL เป็นเชื้อตั้งต้น (เช่น เลือด โฮโมจีเนตสมอง หรือตะกอน sarkosyl)
• ใส่เม็ด Teflon 3 เม็ด (เส้นผ่านศูนย์กลาง 1.59-mm หรือ 2.38-mm) ในหลอดขนาด 0.2 mL แต่ละหลอด
• ติดตั้งหลอดในแร็กที่ใช้ร่วมกับเครื่องอัลตราโซนิก UIP400MTP ได้

ไมโครเพลต 6 หลุม:

• เติมซับสเตรตโฮโมจีเนตสมอง 5 mL และเติมตัวอย่าง 500 μL เป็นเชื้อตั้งต้นต่อหลุม
• เติมเม็ด Teflon 3 เม็ดลงในแต่ละหลุม

ขั้นตอน PMCA

การจัดวาง:
วางแร็กหลอดหรือไมโครเพลต 6 หลุมลงในเครื่องอัลตราโซนิก UIP400MTP ตามคำแนะนำของผู้ผลิต

โปรแกรมวัฏจักร:
ดำเนินการ PMCA 144 วัฏจักรดังนี้:

• การบ่ม: 29 นาทีและ 30 วินาทีที่ 37°C
• การใช้คลื่นอัลตราโซนิก: 30 วินาทีที่แอมพลิจูด 60%
• ติดตามอุณหภูมิ: ใช้เซนเซอร์อุณหภูมิแบบเสียบต่อเพื่อติดตามอุณหภูมิตัวอย่าง และตั้งโปรแกรม UIP400MTP ให้มีอุณหภูมิสูงสุด 48–50°C

รอบถัดไป:
หลังจากเสร็จสิ้นรอบแรกที่มี 144 วัฏจักร ให้ถ่ายส่วนแบ่งของวัสดุที่เพิ่มปริมาณแล้ว:

• เจือจาง 10 เท่าในซับสเตรตโฮโมจีเนตสมองหนูดัดแปลงพันธุกรรมที่เตรียมใหม่
• ดำเนินการ PMCA 96 วัฏจักรสำหรับรอบถัดไป โดยรักษาพารามิเตอร์การใช้คลื่นอัลตราโซนิกเดิม
• ดำเนินการต่อให้ครบจำนวนรอบที่ต้องการ (โดยทั่วไปสูงสุด 5 รอบ)

การตรวจหา PrP^Sc

1. การย่อยด้วย Proteinase K:
   – จัดการตัวอย่างด้วย Proteinase K (50 μg/mL) ที่ 37°C เป็นเวลา 1 ชั่วโมง
   – หยุดการย่อยโดยเติมบัฟเฟอร์ตัวอย่าง SDS และต้มเป็นเวลา 10 นาที
2. การวิเคราะห์เวสเทิร์นบลอต:
   – วิเคราะห์ตัวอย่างที่ผ่านการย่อยโดยใช้:
   – แอนติบอดีต่อ PrP ชนิด 6H4 หรือ PRC1
   – ทำ SDS-PAGE และถ่ายโอนไปยังเมมเบรน PVDF เพื่อการตรวจหา

 

Hielscher UIP400MTP เป็นเครื่องอัลตราโซนิกที่รองรับการใช้งานได้ยืดหยุ่นสูงสุดสำหรับเพลตหลายหลุม เพลต PCR หรือหลอดตัวอย่าง ด้วยกำลังอัลตราโซนิกต่อเนื่อง 400 วัตต์ เครื่องนี้ออกแบบมาสำหรับงานต่าง ๆ เช่น การสลายเซลล์ การทำอิมัลชัน การสกัดโปรตีน การตัดชิ้นส่วน DNA / RNA การสลายกลุ่มอนุภาค การสกัดจากตัวอย่าง FFPE การแยกเซลล์และไบโอฟิล์มออกจากพื้นผิว หรือการทำอิมัลชัน UIP400MTP ไม่ใช่อ่างอัลตราโซนิก แต่เป็นฮอร์นแบบถ้วยความเข้มสูงสำหรับส่งพลังงานอัลตราโซนิกอย่างตรงจุด เครื่องอัลตราโซนิกแบบไม่สัมผัสที่ทรงพลังนี้ให้การประมวลผลด้วยอัลตราโซนิกอย่างสม่ำเสมอทั่วทุกหลุมของเพลตมาตรฐานของคุณ คุณสามารถควบคุมแอมพลิจูด กำลัง และการทำงานแบบพัลส์ได้อย่างแม่นยำ ตัวตั้งเวลาและโพรบวัดอุณหภูมิในตัวช่วยให้ได้ผลลัพธ์ที่สม่ำเสมอ เครื่องอัลตราโซนิกสำหรับเพลต UIP400MTP ระบายความร้อนให้ตัวอย่างด้วยอ่างน้ำ โดยสามารถเลือกใช้เครื่องทำน้ำเย็นภายนอกได้

 

ประมวลผลตัวอย่างมากขึ้นเพื่อผลลัพธ์ที่น่าเชื่อถือยิ่งขึ้น

เครื่องอัลตราโซนิกสำหรับเพลตหลายหลุม UIP400MTP เพิ่มประสิทธิภาพและความสามารถในการขยายขนาดของการเพิ่มปริมาณโปรตีนที่พับผิดรูปแบบเป็นวัฏจักร (PMCA) อย่างมีนัยสำคัญ โดยแก้ปัญหาที่ขั้นตอนนี้แต่เดิมใช้เวลานาน ด้วยการประมวลผลตัวอย่างได้สูงสุด 96 ตัวอย่างพร้อมกันในเพลต 96 หลุม ระบบนี้จึงทำให้กระบวนการทำงาน PMCA คล่องตัวขึ้น พร้อมรักษาสภาวะการใช้คลื่นอัลตราโซนิกที่แม่นยำและสม่ำเสมอทั่วทุกหลุม ความสามารถในการประมวลผลตัวอย่างจำนวนมากนี้ช่วยลดการจัดการด้วยมือให้น้อยที่สุด ลดขั้นตอนที่ใช้แรงงานมาก และทำให้มั่นใจว่าผลลัพธ์ทำซ้ำได้ จึงเป็นเครื่องมือที่ขาดไม่ได้สำหรับการวิจัยพรีออน ไม่ว่าจะศึกษาโรคผอมแห้งเรื้อรังหรือโรคครอยตซ์เฟลดต์–ยาคอบ UIP400MTP ช่วยให้ดำเนินการศึกษาขนาดใหญ่ได้อย่างมีประสิทธิภาพยิ่งขึ้น ทำให้นักวิจัยสามารถตอบสนองความต้องการของการใช้งานด้านการวินิจฉัยและวิทยาศาสตร์สมัยใหม่ได้

---

---

วรรณกรรม / เอกสารอ้างอิง

• FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
• De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
• Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
• Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
• Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
• Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.