Ultraljudstillämpningar i MonkeyPox Virus

Ultraljud är en viktig bearbetningsmetod för isolering av apkoppsvirus (MPXV) från analytiska prover, för virus-DNA-fragmentering samt vid tillverkning av apkoppsvaccin. För provberedning före diagnostik och analys (PCR, ELISA etc.) används ultraljud för att lysera celler för att frigöra apkoppsviruset från cellens inre och / eller för att fragmentera DNA. Inom vaccinproduktion sträcker sig applikationerna från förberedelse av viruspartiklar/DNA, inkapsling i läkemedelsbärare och formulering av inokulat.
Nedan hittar du detaljerad information om provberedning av ultraljudsapkoppsvirus samt ultraljudsassisterad MPXV-vaccinproduktion.

Vad du hittar på den här sidan:

• Ultraljudslys för extraktion av apkoppsvirus
• Ultraljudsfragmentering av DNA från apkoppsvirus
• Ultraljudstillämpningar vid produktion av MPXV-vaccin

Ultraljudslys och DNA-fragmentering före polymeraskedjereaktion (PCR)

En infektion med apkoppsvirus detekteras genom nukleinsyraamplifieringstestning (NAAT), med hjälp av realtids- eller konventionell polymeraskedjereaktion (PCR), för detektion av unika sekvenser av viralt DNA. Provet (t.ex. från nasofarynxbyte eller hudbiopsier) innehåller viruset i celler.
För analys måste viruset frisättas från cellerna och virusets DNA måste fragmenteras för PCR.

Ultraljud lys:

Ultraljud cell disruption / lys är en pålitlig och effektiv metod för att isolera virus från cellprover och därmed en föredragen teknik framför kemiska medel, såsom lysozym, proteinas K och olika rengöringsmedel som alternativt används för att uppnå celllys och frisättning av DNA.
Användningen av sådana kemiska reagenser kräver dock tidskrävande provberedning i flera steg före PCR-analys för att förhindra hämning av PCR-reaktionen. Eftersom PCR-hämmare påverkar effektiviteten av amplifiering kan små variationer av mängden inhibitorer som inte avlägsnas leda till stora variationer i PCR-produktförstärkningen (Diaco, 1995).
Fördelen med ultraljud för lys är att fullständig störning av cellulära strukturer och frisättning av DNA utan behov av lysering reagenser och tidskrävande provberedning är önskvärda. (jfr Fykse et al., 2003)

Fragmentering av ultraljud DNA:

Ultraljud DNA-fragmentering är enkel och pålitlig eftersom den producerar DNA-fragment som är justerbara i längd (baspar, bp). Med hjälp av ultraljud kan DNA effektivt fragmenteras till den avsedda DNA-längden. Exakt kontroll över ultraljudsparametrar och sofistikerade kylningsalternativ förhindrar DNA-nedbrytning.
Läs mer om DNA-fragmentering med ultraljud!

Ultraljudstillämpningar i vaccin mot apkoppsvirus

De vacciner som används mot apkoppsviruset är för närvarande levande virusvacciner. Nyutvecklade vacciner kan komma att använda andra plattformar, t.ex. DNA-baserade vacciner som för närvarande innehåller ett modifierat Vaccinia Ankara viurs, ett försvagat, icke-replikerande orthopoxvirus. Den innehåller också Tris (tris-aminometan) och natriumklorid. Vaccinet kan också innehålla små mängder DNA och protein från fibroblastceller från kycklingembryon, som används för att odla vaccinviruset, bensonas och antibiotikaföreningar som gentamicin och ciprofloxacin.

Ultraljudshomogenisering används vid produktion av levande försvagade virusvacciner, DNA-vacciner, multivalenta DNA-cocktails, mRNA-vacciner, rekombinanta proteinvacciner, virusliknande partikelvacciner, etc.

Du kan hitta mer djupgående information om ultraljudsapplikationer för förbättrad vaccintillverkning!

Protokoll för ultraljudsisolering av apkoppsviruset

Forskargruppen i Stittelaar (2005) använde ultraljudslys för att frigöra apkoppsviruset från tillväxtvärdcellkulturen samt från celler som erhållits via halsbyten från infekterade primater.

Förberedelse av vaccin mot apkoppor:

Apkoppsvirus odlades på fibroblastceller från kycklingembryon som är specifika patogenfria. Efter inkubation i 1 till 2 dagar skördades virus-cellsuspensionen genom en omgång frys-upptining och koncentrerades sedan genom centrifugering. Pelleten återsuspenderades och utsattes för flera omgångar av ultraljudshomogenisering.

Isolering av apkoppsvirus från vaccinerade makaker:

Proverna frystes upp tre gånger och sonikerades i en ultraljuds-CupHorn. Två spädningar (1:10 och 1:100) i transportmedium kompletterat med 1 % fetalt bovint serum användes för att inokulera Vero-cellmonolager i plattor med sex brunnar. Efter 1 timmes inkubation vid 37 °C avlägsnades inokuleringen och ersattes med odlingsmedium kompletterat med 1 % fetalt bovint serum. Monolagren odlades i 5 dagar vid 37°C och färgades med en kristallviolett lösning.
(jfr Stittelaar et al., 2005)

Ultraljudsapparater för virusanalys och vaccinproduktion

Hielscher Ultrasonics breda produktportfölj erbjuder den perfekta ultraljudsapparaten för forskning och analytiska laboratorier samt för industriell vaccintillverkning.
Hielscher Ultrasonics är specialiserat på design, tillverkning och distribution av högpresterande ultraljudsapparater och sono-bioreaktorer för användning i forsknings- och analyslaboratorier samt för implementering i industriell vaccinproduktion (t.ex. Vacciner, Api).
Ultraljudsbehandling kan tillämpas på öppna kärl, slutna kontinuerligt omrörda reaktorer och kontinuerliga genomströmningsreaktorer. Alla delar av ultraljudssystemen, som kommer i kontakt med det flytande mediet, är gjorda av rostfritt stål, titan eller glas. Autoklaverbara delar och sanitetskopplingar säkerställer produktionen under Tillstånd av farmaceutisk kvalitet.
Automatisk dataregistrering: Intelligent programvara registrerar parametrarna för ultraljudsbehandling processen automatiskt på det integrerade SD-minneskortet. Den exakta kontrollen av alla processparametrar säkerställer reproducerbarhet, Standardisering av produktionenoch underlättar uppfyllandet av säkerhetsstandarder för farmaceutiska produkter.
Hielscher Ultrasonics’ Ultraljudsprocessorer är mycket tillförlitliga och kan styras exakt. Alla industriella ultraljudsapparater kan justeras för att leverera hela intervallet från lägre till mycket höga amplituder. Robustheten hos Hielschers ultraljudssystem möjliggör 24/7 drift under tung belastning och i krävande miljöer.

Tabellen nedan ger dig en indikation på den ungefärliga bearbetningskapaciteten hos våra ultraljudsapparater: