Ultraljud applikationer i MonkeyPox Virus
Ultraljud är en viktig bearbetningsmetod för isolering av monkeypox-viruset (MPXV) från analytiska prover, för virus-DNA-fragmentering samt vid tillverkning av monkeypox-vaccin. För provberedning före diagnostik och analys (PCR, ELISA etc.) ultraljud används för att lysera celler för att frigöra monkeypox-viruset från cellens inre och / eller för att fragmentera DNA. Vid vaccinproduktion sträcker sig applikationerna från viruspartikel / DNA-beredning, inkapsling i läkemedelsbärare och formulering av inokula.
Nedan hittar du detaljerad information om ultraljud monkeypox virus provberedning samt ultraljud assisterad MPXV-vaccinproduktion.
Vad du hittar på den här sidan:
- Ultraljud Lysis för Monkeypox Virus utvinning
- Ultraljud fragmentering av Monkeypox Virus DNA
- Ultraljud applikationer i MPXV-vaccinproduktion
Ultraljud lys och DNA-fragmentering före polymeraskedjereaktion (PCR)
En monkeypox-virusinfektion detekteras genom nukleinsyraförstärkningstestning (NAAT), med användning av realtid eller konventionell polymeraskedjereaktion (PCR), för detektion av unika sekvenser av viralt DNA. Provet (t.ex. från nasofaryngeal swap eller hudbiopsier) innehåller viruset i celler.
För analys måste viruset frigöras från cellerna och virus-DNA måste fragmenteras för PCR.
Ultraljud Lysis:
Ultraljud cellstörning / lys är en pålitlig och effektiv metod för att isolera virus från cellprover och därmed en föredragen teknik framför kemiska medel, såsom lysozym, proteinas K och olika tvättmedel som alternativt används för att uppnå celllys och frisättning av DNA.
Användningen av sådana kemiska reagenser kräver dock tidskrävande provberedning i flera steg före PCR-analys för att förhindra hämning av PCR-reaktionen. Eftersom PCR-hämmare påverkar effektiviteten av förstärkning kan små variationer av mängden hämmare som inte avlägsnas leda till stora variationer i PCR-produktförstärkningen (Diaco, 1995).
Fördelen med ultraljud för lys är att fullständig störning av cellulära strukturer och frisättning av DNA utan behov av lyserande reagens och tidskrävande provberedning är önskvärda. (jfr Fykse m.fl., 2003)
Ultraljud DNA-fragmentering:
Ultraljud DNA-fragmentering är enkel och pålitlig som producerar DNA-fragment avstämbara i längd (basepairs, bp). Med hjälp av ultraljud kan DNA effektivt fragmenteras till den riktade DNA-längden. Exakt kontroll över ultraljudsparametrar och sofistikerade kylalternativ förhindrar DNA-nedbrytning.
Läs mer om ultraljud DNA-fragmentering!
Ultraljud applikationer i Monkeypox Virus Vaccin
Vacciner som används mot monkeypox-viruset är för närvarande levande virusvacciner. Nyutvecklade vacciner kan använda andra plattformar som DNA-baserade Den innehåller för närvarande en modifierad Vaccinia Ankara-viurs, ett försvagat, icke-replikerande ortokoppsvirus. Den innehåller också Tris (tris-aminometan) och natriumklorid. Vaccinet kan också innehålla små mängder DNA och protein från kycklingembryon fibroblastcellerna, som används för att odla vaccinviruset, bensonas och antibiotikaföreningar såsom gentamicin och ciprofloxacin.
Ultraljudshomogenisering används vid produktion av levande försvagade virusvacciner, DNA-vacciner, multivalenta DNA-cocktails, mRNA-vacciner, rekombinanta proteinvacciner, virusliknande partikelvacciner etc.
- spridning av viruspartiklar och virusmedel
- emulgering
- inaktivering av virus
- läkemedelsbärarformulering (NLC, SLN)
- Inkapsling
- upplösning av medel
- beredning av adjuvanser
- Avgasning / De-Aeration
Protokoll för ultraljud isolering av Monkeypox Virus
Forskargruppen i Stittelaar (2005) använde ultraljudslys för att frigöra monkeypox-viruset från tillväxtvärdcellkulturen samt från celler som erhållits via halsbyten från infekterade primater.
Monkeypox vaccinberedning:
Monkeypox-virus odlades på specifika patogenfria kycklingembryemfibroblastceller. Efter inkubation i 1 till 2 dagar skördades viruscellssuspensionen genom en omgång frys-upptining och koncentrerades sedan genom centrifugering. Pelleten återsuspenderades och utsattes för flera omgångar av ultraljudshomogenisering.
Monkeypox Virusisolering från vaccinerade makaker:
Prover frys-tinades tre gånger och sonicated i en ultraljud CupHorn. Två utspädningar (1:10 och 1:100) i transportmedium kompletterat med 1% fetalt bovint serum användes för att inokulera Vero-cellmonolager i sexbrunnsplattor. Efter 1 timmes inkubation vid 37 °C avlägsnades inokula och ersattes med odlingsmedium kompletterat med 1 % fetalt bovint serum. Monolagren odlades i 5 dagar vid 37 ° C och färgades med en kristallviolett lösning.
(jfr Stittelaar m.fl., 2005)
Ultrasonicators för virusanalys och vaccinproduktion
Hielscher Ultrasonics breda produktportfölj erbjuder den perfekta ultrasonicator för forskning och analytiska laboratorier samt för industriell vaccintillverkning.
Hielscher Ultrasonics är specialiserat på design, tillverkning och distribution av högpresterande ultrasonicators och sono-bioreaktorer för användning i forsknings- och analyslaboratorier samt för implementering i industriell vaccinproduktion (t.ex. Vacciner, Api).
Ultraljudsbehandling kan appliceras på öppna kärl, stängda kontinuerligt omrörda reaktorer och kontinuerliga genomströmningsreaktorer. Alla delar av ultraljudssystemen, som kommer i kontakt med det flytande mediet, är gjorda av rostfritt stål, titan eller glas. Autoklaverbara delar och sanitetsbeslag säkerställer produktionen under villkor av läkemedelsklass.
Automatisk dataregistrering: Intelligent program vara registrerar parametrarna för ultraljudsbehandling processen automatiskt på den integrerade SD-minneskort. Den exakta styrningen av alla process parametrar säkerställer Reproducerbarhet, standardisering av produktionen, och underlättar uppfyllandet av säkerhetsstandarder för läkemedelsprodukter.
Hielscher Ultrasonics’ ultraljud processorer är mycket tillförlitliga och kan kontrolleras exakt. Alla industriella ultrasonicators kan justeras för att leverera hela intervallet från lägre till mycket höga amplituder. Robustheten hos Hielschers ultraljudssystem möjliggör 24/7 drift under tunga och i krävande miljöer.
Nedanstående tabell ger dig en indikation på hur mycket våra ultraljudsapparater kan hantera:
batch Volym | Flödeshastighet | Rekommenderade Devices |
---|---|---|
multi-well / microtiter plattor | Ej tillämpligt | UIP400MTP |
1 till 500 ml | 10 till 200 ml / min | UP100H |
10 till 2000 ml | 20 till 400 ml / min | Uf200 ः t, UP400St |
0.1 till 20L | 0.2 till 4L / min | UIP2000hdT |
10 till 100 liter | 2 till 10 1 / min | UIP4000hdT |
Ej tillämpligt | 10 till 100 l / min | UIP16000 |
Ej tillämpligt | större | kluster av UIP16000 |
Kontakta oss! / Fråga oss!
Litteratur / Referenser
- Stittelaar, Koert; Amerongen, Geert; Kondova, Ivanela; Kuiken, Thijs; Lavieren, Rob; Pistoor, Frank; Niesters, Hubert; Doornum, Gerard; Van der Zeijst, Bernard; Mateo, Luis; Chaplin, Paul; Osterhaus, Albert (2005): Modified Vaccinia Virus Ankara Protects Macaques against Respiratory Challenge with Monkeypox Virus. Journal of Virology 79, 2005. 7845-51.
- Shah Purvin, Parameswara Rao Vuddanda, Sanjay Kumar Singh, Achint Jain, and Sanjay Singh (2014): Pharmacokinetic and Tissue Distribution Study of Solid Lipid Nanoparticles of Zidov in Rats. Journal of Nanotechnology, Volume 2014.
- J. Robin Harris, Andrei Soliakova, Richard J. Lewis, Frank Depoix, Allan Watkinson, Jeremy H. Lakeya (2012): Alhydrogel® adjuvant, ultrasonic dispersion and protein binding: a TEM and analytical study. Micron Volume 43, Issues 2–3, February 2012, 192-200.
- Doron Melamed, Gabriel Leitner, E. Dan Heller (1991): A Vaccine against Avian Colibacillosis Based on Ultrasonic Inactivation of Escherichia coli. Avian Diseases Vol. 35, No. 1 (Jan. – Mar., 1991), 17-22.
- Huang C-F, Wu T-C, Wu C-C, Lee C-C, Lo W-T, Hwang K-S, Hsu M-L, Peng H-J. (2011): Sublingual vaccination with sonicated Salmonella proteins and mucosal adjuvant induces mucosal and systemic immunity and protects mice from lethal enteritis. APMIS 119, 2011. 468–78.
Fakta Värt att veta
Monkeypox Virus
Monkeypox (MPV, MPXV eller hMPXV) är en art av dubbelsträngat DNA-virus, vilket orsakar en viral zoonotisk sjukdom. Denna sjukdom är känd som monkeypox infektion och kan förekomma hos människor och djur. Det tillhör släktet Orthopoxvirus i familjen Poxviridae. Monkeypox-virus är ett av de mänskliga ortopoxvirusen tillsammans med variola (VARV), kokoppor (CPX) och vaccinia (VACV) virus. Orthopoxvirus kännetecknas av stora tegelformade viruspartiklar, innehållande ett dubbelsträngat DNA-genom på cirka 200 000 bp.
ELISA-analys
ELISA står för Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay och är en märkt immunoassay som anses vara guldstandarden för immunanalyser. ELISA är ett immunologiskt test, värderat för sin höga diagnostiska känslighet, används för att detektera och kvantifiera molekyler, inklusive antikroppar, antigener, proteiner, glykoproteiner och hormoner. Principen för ELISA är baserad på en antigen-antikroppsinteraktion. Genom denna antigen-antikroppsinteraktion binder de specifika antikropparna till dess målantigen. Endast när interaktionen äger rum kan substratet binda till enzymet och en efterföljande substratomvandling kan observeras, vilket innebär att ett positivt resultat erhålls.

Hielscher Ultrasonics tillverkar högpresterande ultraljud homogenisatorer från Labb till industriell storlek.