Ultraljudstillämpningar för apkoppsvirus

Ultraljudsbehandling är en viktig bearbetningsmetod för isolering av apkoppsvirus (MPXV) från analysprover, för fragmentering av virus-DNA samt vid tillverkning av vaccin mot apkoppor. Vid provberedning inför diagnostik och analys (PCR, ELISA etc.) används ultraljudsbehandling för att lysera celler så att apkoppsviruset frigörs från cellernas inre och / eller för att fragmentera DNA. Vid vaccinproduktion omfattar tillämpningarna beredning av viruspartiklar / DNA, inkapsling i läkemedelsbärare och formulering av inokula.
Nedan hittar du detaljerad information om ultraljudsbaserad provberedning av apkoppsvirus samt ultraljudsassisterad produktion av MPXV-vaccin.

Det här hittar du på denna sida:

• Ultraljudslys för extraktion av apkoppsvirus
• Ultraljudsfragmentering av apkoppsvirusets DNA
• Ultraljudstillämpningar vid produktion av MPXV-vaccin

Ultraljudslys och DNA-fragmentering före polymeraskedjereaktion (PCR)

En infektion med apkoppsvirus påvisas genom nukleinsyraamplifieringstest (NAAT), med realtids-PCR eller konventionell polymeraskedjereaktion (PCR), för detektion av unika sekvenser av virus-DNA. Provet (t.ex. från nasofarynxprovtagning med provpinne eller hudbiopsier) innehåller viruset i celler.
För analys måste viruset frigöras från cellerna och virusets DNA måste fragmenteras inför PCR.

Ultraljudslys:

Ultraljudsbaserad cellsönderdelning / lys är en tillförlitlig och effektiv metod för att isolera virus från cellprover och är därmed en teknik att föredra framför kemiska ämnen, såsom lysozym, proteinas K och olika detergenter, som alternativt används för att åstadkomma celllys och frigöra DNA.
Användningen av sådana kemiska reagenser kräver dock tidskrävande provberedning i flera steg före PCR-analys för att förhindra hämning av PCR-reaktionen. Eftersom PCR-hämmare påverkar amplifieringens effektivitet kan små variationer i mängden hämmare som inte avlägsnas leda till stora variationer i amplifieringen av PCR-produkten (Diaco, 1995).
Fördelen med ultraljudsbehandling för lys är att fullständig sönderdelning av cellstrukturer och frisättning av DNA utan behov av lysreagenser och tidskrävande provberedning är önskvärda. (jfr Fykse et al., 2003)

Ultraljudsfragmentering av DNA:

Ultraljudsfragmentering av DNA är enkel och tillförlitlig eftersom den ger DNA-fragment vars längd kan justeras (baspar, bp). Med ultraljud kan DNA effektivt fragmenteras till den avsedda DNA-längden. Exakt kontroll över ultraljudsparametrarna och avancerade kylningsalternativ förhindrar DNA-nedbrytning.
Läs mer om ultraljudsfragmentering av DNA!

Ultraljudstillämpningar för vaccin mot apkoppsvirus

Vacciner som används mot apkoppsvirus är för närvarande levande virusvacciner. Nyutvecklade vacciner kan komma att använda andra plattformar såsom DNA-baserade Den för närvarande innehåller ett modifierat Vaccinia Ankara-viurs, ett försvagat, icke-replikerande ortopoxvirus. Det innehåller även Tris (tris-aminometan) och natriumklorid. Vaccinet kan också innehålla små mängder DNA och protein från fibroblastceller från kycklingembryon, vilka används för att odla vaccinviruset, bensonas och antibiotiska föreningar såsom gentamicin och ciprofloxacin.

Ultraljudshomogenisering används vid produktion av levande försvagade virusvacciner, DNA-vacciner, multivalenta DNA-cocktailar, mRNA-vacciner, rekombinanta proteinvacciner, vacciner med virusliknande partiklar etc.

Här hittar du mer ingående information om ultraljudstillämpningar för förbättrad vaccintillverkning!

Protokoll för ultraljudsisolering av apkoppsvirus

Stittelaars forskargrupp (2005) använde ultraljudslys för att frigöra apkoppsviruset från den värdcellskultur där det odlades samt från celler som erhållits genom svalgprovtagning med provpinne från infekterade primater.

Beredning av vaccin mot apkoppor:

Apkoppsvirus odlades på specifikpatogenfria fibroblastceller från kycklingembryon. Efter inkubation i 1 till 2 dagar skördades virus-cell-suspensionen genom en omgång frys-tining och koncentrerades därefter genom centrifugering. Pelletten resuspenderades och undergavs flera omgångar av ultraljudshomogenisering.

Isolering av apkoppsvirus från vaccinerade makaker:

Proverna frys-tinades tre gånger och sonikerades i en ultraljuds CupHorn. Två spädningar (1:10 och 1:100) i transportmedium kompletterat med 1 % fetalt bovint serum användes för att inokulera Vero-cellsmonolager i sexbrunnsplattor. Efter 1 h inkubation vid 37°C togs inokula bort och ersattes med odlingsmedium kompletterat med 1 % fetalt bovint serum. Monolagrarna odlades i 5 dagar vid 37°C och färgades med en kristallviolett lösning.
(jfr Stittelaar et al., 2005)

Ultraljudsapparater för virusanalys och vaccinproduktion

Hielscher Ultrasonics breda produktportfölj erbjuder den idealiska ultraljudsapparaten för forsknings- och analyslaboratorier samt för industriell vaccintillverkning.
Hielscher Ultrasonics är specialiserat på konstruktion, tillverkning och distribution av högpresterande ultraljudsapparater och ultraljudsbioreaktorer för användning i forsknings- och analyslaboratorier samt för implementering i industriell vaccinproduktion (t.ex. vacciner, aktiva farmaceutiska substanser).
Ultraljudsbehandling kan utföras i öppna kärl, slutna reaktorer med kontinuerlig omrörning och reaktorer med kontinuerligt genomflöde. Alla delar av ultraljudssystemen som kommer i kontakt med det flytande mediet är tillverkade av rostfritt stål, titan eller glas. Autoklaverbara delar och hygieniska kopplingar säkerställer produktion under förhållanden som uppfyller läkemedelskrav.
Automatisk dataregistrering: Intelligent programvara registrerar automatiskt ultraljudsprocessens parametrar på det inbyggda SD-minneskortet. Den exakta kontrollen av alla processparametrar säkerställer reproducerbarhet, standardisering av produktionen, och underlättar uppfyllandet av säkerhetsstandarder för läkemedelsprodukter.
Ultraljudsprocessorerna från Hielscher Ultrasonics är mycket tillförlitliga och kan styras exakt. Alla industriella ultraljudsapparater kan ställas in för att leverera hela intervallet från lägre till mycket höga amplituder. Robustheten hos Hielschers ultraljudssystem möjliggör drift 24/7 under hög belastning och i krävande miljöer.

Tabellen nedan ger en uppfattning om den ungefärliga bearbetningskapaciteten hos våra ultraljudsapparater: