Dezintegracija ćelija ili liza je čest deo svakodnevne pripreme uzoraka u biotehnološkim laboratorijama. Cilj lize je da poremeti delove ćelijskih zidova ili kompletnu ćeliju za oslobađanje bioloških molekula. Ultrazvučni homogenizatori se široko koriste za uspešnu ćelijsku lizu. Glavna prednost sofisticiranih ultrazvučnika je precizna kontrola procesnih parametara kao što su intenzitet i temperatura, što omogućava nežno, ali veoma efikasno ometanje ćelija i vađenje.

Cell Lysis pomoću ultrazvuka

Ultrazvučna ćelijska liza i vađenje je metod koji se koristi za razbijanje otvorenih ćelija i izdvajanje sadržaja pomoću visokofrekventnih zvučnih talasa, već ultrazvuka. Sonication je tehnika lize, koja se široko koristi kao utvrđena i pouzdana metoda poremećaja ćelija i vađenja intracelularnog materijala. Ultrazvučna liza je pouzdana tehnika pripreme lisata koji sadrži npr. plazmid, receptorni asays, proteine, DNK, RNK itd. Kako se ultrazvučni intenzitet može nivelisati prilagođavanjem parametara procesa, optimalni intenzitet sonication-a od veoma mekog do intenzivnog može se postaviti pojedinačno za svaku supstancu i srednju da bi se zadovoljili specifični zahtevi aplikacije. Sledeći koraci lize su razlomci, izolacija organela ili/i vađenje proteina i pročišćavanje. Izdvojeni materijal (= lisate) mora biti razdvojen i podložan je daljim istragama ili aplikacijama, npr.

U poređenju sa drugim ćelijskim lizama i metodama ekstrakcije, ultrazvučna ćelijska liza ima nekoliko prednosti:

1. Brzina: Ultrazvučna ćelijska liza i ekstrakcija je brza metoda koja može da razbije otvorene ćelije u roku od nekoliko sekundi. Ovo je mnogo brže od drugih metoda kao što su homogenizacija, otopljavanje zamrzavanja ili mlevenje bead-a.
2. Efikasnost: Ultrazvučna ćelijska liza i ekstrakcija mogu se koristiti za tretiranje malih, velikih ili više uzoraka odjednom, što je čini efikasnijom od drugih metoda koje zahtevaju individualnu obradu malih uzoraka.
3. Bez hemikalija: Ultrazvučna ćelijska liza i ekstrakcija je neinvazivna metoda koja ne zahteva upotrebu surovih hemikalija ili enzima. To ga čini idealnim za aplikacije u kojima je potrebno održavati integritet sadržaja ćelije. Neželjena kontaminacija uzoraka se može izbeći.
4. Visok prinos: Ultrazvučna ćelijska liza i ekstrakcija mogu da izvuku visok prinos ćelijskog sadržaja, uključujući DNK, RNK i proteine. To je zato što visokofrekventni zvučni talasi razbijaju zidove ćelija i oslobađaju sadržaj u okolno rešenje.
5. Kontrola temperature: Sofisticirani ultrasonciatori omogućavaju preciznu kontrolu temperature uzorka. Hielscher digitalni sonicatori su opremljeni senzorom za temperaturu i softverom za praćenje temperature.
6. Reproduktivno: Protokoli za ultrazvučnu ćelijsku lizu mogu se lako reprodukovali i čak podudarati sa različitim većim ili manjim probnim volumenima jednostavnim linearnim razmerom.
7. Svestran: Ultrazvučna ćelijska liza i ekstrakcija mogu se koristiti za izdvajanje širokog spektra tipova ćelija, uključujući bakterije, kvasac, gljive, biljne i sisarske ćelije. Takođe se može koristiti za vađenje različitih vrsta molekula, uključujući proteine, DNK, RNK i lipide.
8. Istovremena priprema brojnih uzoraka: Hielscher Ultrasonics nudi nekoliko rešenja za udobnu obradu brojnih uzoraka pod potpuno istim uslovima procesa. Na taj način je korak pripreme uzorka lize i ekstrakcije veoma efikasan i ušteda vremena.
9. Jednostavan za korišćenje: Ultrazvučna ćelijska liza i oprema za ekstrakciju je jednostavna za upotrebu i zahteva minimalnu obuku. Oprema je takođe ekonomična, s obzirom da se radi o jedinstvenoj investiciji bez uslova za ponovnu kupovinu rashoda. To ga čini privlačnim za širok spektar istraživača i laboratorija.

Sveukupna, ultrazvučna ćelijska liza i ekstrakcija su brza, efikasna, precizno kontrolisava i svestrana metoda za izdvajanje sadržaja mobilne telefonije. Njene prednosti u odnosu na alternativne metode čine ga atraktivnim izborom za širok spektar istraživanja i industrijskih primena.

Radni princip ultrazvučne ćelije Lysis

Ultrazvučna ćelijska liza i ekstrakcija koriste visokofrekventne zvučne talase da poremete ćelije i izdvoje njihov sadržaj. Zvučni talasi stvaraju promene pritiska u okolnoj tečnosti, uzrokujući formiranje i kolaps malih mehurića u procesu poznatom kao kavitacija. Ovi mehurići generišu lokalizovane visoko intenzivne mehaničke sile koje mogu da razbiju otvorene ćelije i puste njihov sadržaj u okolno rešenje.

Cell lysis pomoću ultrazvučnog obično uključuje sledeće korake:

• Uzorak se nalazi u cevi ili posudi sa tečnim baferom.
• Ultrazvučna sonda se ubacuje u uzorak, a primenjuju se visokofrekventni zvučni talasi sa okom. Primenjuje se 20-30 kHz.
• Ultrazvučni talasi izazivaju oscilacije i kavitacije u okolnoj tečnosti, stvarajući lokalizovane sile koje razbijaju otvorene ćelije i oslobađaju njihov sadržaj.
• Uzorak je centrifugiran ili filtriran da bi se uklonile sve ćelijske krhotine, a izdvojeni sadržaj se prikuplja za nizvodnu analizu.

Snažni ultrazvučni talasi remete ćelijske matrice bioloških struktura i oslobađaju bioaktivna jedinjenja. Masovni prenos između biljnog materijala i rastvarača (npr. bafera) se intenzivira. (grafika: ©Vilkhu et al., 2006)

Mane uobičajenih metoda lize

Tokom rada u laboratorijama, možda ste već iskusili problem sa ćelijskom lizom koristeći tradicionalne protokole mehaničke ili hemijske lize.

• Mehanička liza: Metode mehaničke lize, kao što su mlevenje malterom i šljuska ili homogenizacija pomoću francuske štampe, mlina za prevede ili rotor-stator sistema često nemaju precisnu kontrolu i opcije prilagođavanja. To znači da upotreba mlevenja i mlevenja može brzo da generiše toplotu i sile koje mogu da oštete uzorke i proteine denature. Takođe mogu da oduzimaju mnogo vremena i zahtevaju velike količine početnog materijala.
• Hemijska liza: Metode hemijske lize, kao što je liza na bazi deterdženta, mogu da oštete uzorak remećenjem lipidnog biojera i denaturisanjem proteina. Takođe mogu da zahtevaju više koraka i mogu da ostave zagađivače koji ometaju nizvodne aplikacije. Pronalaženje optimalne doza deterdženta je dodatni izazov.
• Ciklusi otapanja zamrzavanja: Ciklusi otopljavanja zamrzavanja mogu dovesti do pucanja ćelijskih membrana, ali ponovljeni ciklusi takođe mogu da izazovu denaturaciju i razgradnju proteina. Ovaj metod takođe može zahtevati više ciklusa, što može da oduzme mnogo vremena i često rezultira manjim prinosima.
• Enzimska liza: Metode enzimske lize mogu biti specifične za određene tipove ćelija i zahtevaju više koraka, što ih čini vremenski zahtevnim. Oni takođe generišu otpad i zahtevaju pažljivu optimizaciju kako bi se izbegla degradacija uzorka. Kompleti za enzimsku lizu su često skupi. Ako vaša trenutna procedura enzimske lize daje nedovoljne rezultate, sonication as synergistic method can be applied to intensify cell disruption.

Za razliku od konvencionalnih metoda mehaničke i hemijske ćelijske lize, sonicija je veoma efikasno i pouzdano sredstvo za dezintegracije ćelija koje omogućava potpunu kontrolu nad parametrima sonication. Na taj način se obezbeđuje visoka selektivnost na materijale koji oslobađaju i čistoću proizvoda. [cf. Balasundaram et al., 2009]
Pogodan je za sve tipove ćelija i lako se primenjuje u malom i velikom obimu – uvek pod kontrolisanim uslovima. Ultrazvučni su jednostavni za čišćenje. Ultrazvučni homogenizer uvek sadrži funkciju clean-in-place (CIP) i sterilize-in-place (SIP). Sonotrode se sastoji u masivnom titanijumskom rogu koji se može obrisati ili pustiti u vodu ili rastvarač (u zavisnosti od radnog medijuma). Održavanje ultrazvučnika je posledica njihove robusnosti gotovo zanemarljive.

Ultrazvučna liza i poremećaj ćelija

Uopšteno, limfom uzoraka u laboratoriji trajaće između 15 i 2 minute. S obzirom da je intenzitet sonnosti veoma lak za prilagođavanje pojačanjem vremena, kao i odabirom prave opreme, moguće je da se u zavisnosti od ćelijske strukture, veoma nežno ili veoma naglo ometa, što zavisi od ćelijskih struktura i namene Lyze ( na primer, ekstrakcija DNK zahteva mekane sonsikaciju, kompletna ekstrakcija bakterija zahteva intenzivniji Ultrazvučni tretman. Temperatura tokom procesa može da se nadgleda integrisanim temperaturnim senzorom i lako se može kontrolisati hladjenje (sladoledi ili ćelije toka sa rashladnim jakni) ili pomoću sonacija u pulsnom režimu. Za vreme trajanja u pulsnom režimu, kratki sonovi u trajanju od 1-15 sekunde traju tokom dužeg povremenih perioda.
Svi procesi koji se pokreću sa ultrazvukom su potpuno prerađivi i nerani podesivi.

Ultrazvučni homogenizatori za ćelijsku lizu i vađenje

Različite vrste ultrazvučnih uređaja omogućavaju podudaranje cilja pripreme uzorka i uvažava udobnost korisnika i operacije. Ultrazvučni uređaji tipa sonde su najčešći uređaji u laboratoriji. Najpogodniji su za pripremu malih i srednjih uzoraka sa zapreminom od 0,1mL do 1000mL. Različite veličine energije i sonotrodi omogućavaju prilagođavanje ultrazvučnog na volumen uzorka i posudu za najefikasnije i najefikasnije rezultate sonicije. Uređaj ultrazvučne sonde je najbolji izbor kada jedan uzorak mora da se pripremi.

Ako mora da se pripremi više uzoraka, npr. 8-10 bočica ćelijskog rastvora, intenzivna indirektna sonicija sa ultrazvučnim sistemima kao što su VialTweeter ili ultrazvučni cuphorn su najpogodniji metod homogenizacije za efikasnu lizu. Nekoliko bočica je sonicirano u isto vreme, istim intenzitetom. Na taj način se ne samo štedi vreme, već obezbeđuje i isti tretman svih uzoraka, što rezultate među uzorcima čini pouzdanim i uporedivim. Pored toga, tokom indirektne sonication unakrsne kontaminacije uranjanjem ultrazvučnog sonotroda (poznatog i kao ultrazvučna sonda, rog, vrh ili prst) se izbegava. Pošto se pojedinačno koristi uzorak veličine podudanih bočica, izostavljeno je dugotrajan čišćenje i gubitak uzorka usled dekantovanja posuda. Za ujednačenu sonikaciju multiwell ili mikrotiterskih ploča, Hielscher nudi UIP400MTP.
Za veće volumene, npr. za komercijalnu proizvodnju ekstrakta ćelija, stalni ultrasonični sistemi sa reakcijom u ćeliji toka su najpogodniji. Kontinuiran i cak tok obrađenog materijala osigurava čak i sonaciju. Sve parametre procesa ultrasonve mogu se optimizovati i prilagoditi zahtevima aplikacije i specifičnim materijalom u ćeliji.
 
 
Primer procedure za ultrasonični izbacivanje bakterijskih ćelija:

• Priprema ćelijske suspenzije: ćelijske peleti moraju da budu potpuno suspendovane u tampon rešenju tako što ćete homogenizirati (odaberite rešenje bafera kompatibilno sa sledećom analizom, npr. poseban metod hromatografije). Dodajte lysozymes i/ili druge aditiva, ako je potrebno (oni moraju biti kompatibilni sa odvajanjem/pročišćajnim sredstvima). Mix/Homogenizacija rešenja lagano pod blagim sononizmom dok se ne postigne potpuna suspenzija.
• Ultrasonični tekstis: Postavite uzorak u kupku za led. Za poremećene ćelije Sonje suspenzija na 60-90 sekundi (koristeći svoj Ultrazvučni režim).
• Odvajanje: centrifugi lysate (npr. 10 min. na 10.000 x g; u 4degC). Pažljivo odvojite supernatog na ćelijskom Pelet. Supernatant je ukupna lysate ćelija. Nakon filtriranja supernatanta, dobili ste pojašnjeno fluidan rastvornog ćelijskih proteina.

 
Najčešći zahtevi za ultrasonicatore u biologiji i biotehnologiji su:

• Priprema za izdvajanje ćelije
• Prekid kvasca, bakterija, biljnih ćelija, mekog ili tvrdog ćelijskog tkiva, nuklearskog materijala
• Vađenje proteina
• Priprema i izolacija enzima
• Proizvodnja antigensa
• Ekstrakcija DNK i/ili usmerena Fragmentacija
• priprema za liposome