Соницатион фор Целл Лисис: Целл Дисруптион анд Ектрацтион
Ultrazvučna liza ćelija je široko primenjena tehnika pripreme uzoraka u savremenim biotehnološkim laboratorijama. Njegova primarna svrha je da poremeti ćelijske membrane ili čitave ćelije kako bi se oslobodile intracelularne komponente kao što su proteini, nukleinske kiseline ili organele. U svakodnevnom laboratorijskom radu to znači da je ultrazvuk standardna metoda za kontrolisani poremećaj ćelija i efikasnu ekstrakciju biomolekula. Ključna prednost sonikatora leži u njihovoj sposobnosti da precizno moduliraju kritične parametre procesa, uključujući intenzitet ultrazvuka, pulsiranje i kontrolu temperature. Ova kontrola omogućava istraživačima da postignu pouzdanu lizu uz minimiziranje termičkog ili mehaničkog oštećenja osetljivih biomolekula, što rezultira blagim, ali visoko efikasnim procesom ekstrakcije.
Liza ćelija pomoću Sonicators
Ultrazvučna liza ćelija koristi akustičnu kavitaciju da poremeti ćelijske membrane i oslobađa intracelularne molekule. Hielscher Ultrasonics nudi klasičnu sondu tipa sonicator, kao i multi-sample sonicators za sterilnu obradu: VialTveeter za više epruveta i bočica i 96-Pa Plate Sonicator UIP400MTP za standardne mikroploče.
Хиелсцхер Ултрасоницс испоручује моћне бесконтактне соникаторе за припрему узорака и клиничку анализу. Соникатор плоча са више бунара УИП400МТП, Тхе ВиалТвеетер, тхе ЦупХорн i GDmini2 protok sonikator obraditi uzorke pod sterilnim uslovima.
Ултразвучни хомогенизатори УП100Х (100 вати) и УП400Ст (400 вати): Соникација за лизу и екстракцију ћелија.
Ултразвучни хомогенизатори за лизу и екстракцију ћелија
| Ultrazvučni tip uređaja | Fokus primene | Сампле Волуме | Tipičan slučaj upotrebe | Предности | Primeri modela |
|---|---|---|---|---|---|
| Соникатори типа сонде | Single-uzorak ultrazvuk | 0.1 mL do ~1000 mL | Liza ćelija, ekstrakcija proteina, fragmentacija DNK / RNK | Precizna kontrola energije; razni sonotrodes; optimalno za male i srednje uzorke | УП100Х, УП200Ст, УП400Ст |
| VialTweeter / CupHorn | Paralelna obrada više zapečaćenih bočica | 8–10 bočica (~ 1–20 ml svaka) | Standardizovana liza višestrukih ćelijskih suspenzija | Uniformna ultrazvučnost; izbegava unakrsnu kontaminaciju; ponovljivi rezultati | ВиалТвеетер, цупхорн |
| 96-pa ploča Sonikator | Sonikacija multivell i mikrotiter ploča | Format mikroplate | Skrining visoke propusnosti, proteomika, ćelijski testovi | Simultano, čak i ultrazvuk preko bunara; Idealan za radne tokove sa više uzoraka | УИП400МТП |
| реактори са проточним ћелијама | Kontinuirana ultrazvučna obrada za veće količine | >1 l, skalabilan | Industrijski poremećaj ćelija, proizvodnja ekstrakta | Kontinuirana obrada; skalabilan; potpuna kontrola procesa (amplituda, pritisak, temperatura) | УИП1000хдТ, УИП2000хдТ + protok ćelija |
| Sterilni / indirektni sistemi za ultrazvuk | Obrada uzoraka bez kontaminacije | Zavisna od bočice / cevi / mikroplate | Osetljivi uzorci, sterilna okruženja, regulatorna podešavanja | Nema kontakta sa sondom; izbegava prenošenje; minimalan napor čišćenja | ВиалТвеетер, цупхорн, УИП400МТП |
Предности коришћења ултразвука за лизу ћелија
У поређењу са другим методама лизе ћелија и екстракције, ултразвучна лиза ћелија има неколико предности:
- Брзина: Ултразвучна ћелијска лиза и екстракција је брза метода која може разбити отворене ћелије за неколико секунди. Ово је много брже од других метода као што су хомогенизација, замрзавање-одмрзавање или млевење куглица.
- Ефикасност: Ултразвучна ћелијска лиза и екстракција се могу користити за третирање малих, великих или више узорака одједном, што га чини ефикаснијим од других метода које захтевају индивидуалну обраду малих узорака.
- Без хемикалија: Ултразвучна ћелијска лиза и екстракција је неинвазивна метода која не захтева употребу јаких хемикалија или ензима. Ово га чини идеалним за апликације где је потребно одржавати интегритет садржаја ћелије. Нежељена контаминација узорака се може избећи.
- Висок принос: Ултразвучна ћелијска лиза и екстракција могу извући висок принос ћелијског садржаја, укључујући ДНК, РНК и протеине. То је зато што звучни таласи високе фреквенције разбијају зидове ћелије и ослобађају садржај у околни раствор.
- Контрола температуре: Софистицирани ултразвучни апарати омогућавају прецизну контролу температуре узорка. Хиелсцхер дигитални соникатори су опремљени температурним сензором који се може прикључити и софтвером за праћење температуре.
- Поновљиво: Протоколи за ултразвучну лизу ћелија могу се лако репродуковати, па чак и ускладити са различитим већим или мањим запреминама узорака једноставним линеарним повећањем.
- Свестран: Ултразвучна ћелијска лиза и екстракција се могу користити за екстракцију широког спектра типова ћелија, укључујући бактерије, квасац, гљивице, биљне ћелије и ћелије сисара. Такође се може користити за екстракцију различитих типова молекула, укључујући протеине, ДНК, РНК и липиде.
- Истовремено припрема више узорака: Хиелсцхер Ултрасоницс нуди неколико решења за удобну обраду бројних узорака под потпуно истим условима процеса. Ово чини корак припреме узорка лизом и екстракцијом веома ефикасним и штеди време.
- Једноставан за коришћење: Опрема за ултразвучну лизу и екстракцију ћелија је једноставна за употребу и захтева минималну обуку. Опрема је такође економична јер се ради о једној инвестицији без потребе за поновном куповином отпада. То га чини привлачним за широк спектар истраживача и лабораторија.
Све у свему, ултразвучна лиза и екстракција ћелија је брза, ефикасна, прецизно контролисана и свестрана метода за екстракцију ћелијског садржаја. Његове предности у односу на алтернативне методе чине га атрактивним избором за широк спектар истраживачких и индустријских примена.
Принцип рада ултразвучне лизе ћелија
Ултразвучна ћелијска лиза и екстракција користи високофреквентне звучне таласе да омета ћелије и извуче њихов садржај. Звучни таласи стварају промене притиска у околној течности, узрокујући формирање и колапс малих мехурића у процесу познатом као кавитација. Ови мехурићи стварају локализоване високо интензивне механичке силе које могу да разбију отворене ћелије и испусте њихов садржај у околни раствор.
Лиза ћелија помоћу ултразвучног апарата обично укључује следеће кораке:
- Узорак се ставља у епрувету или посуду са течним пуфером.
- У узорак се убацује ултразвучна сонда, а звучни таласи високе фреквенције цца. примењују се 20-30 кХз.
- Ултразвучни таласи изазивају осцилацију и кавитацију у околној течности, стварајући локализоване силе које разбијају ћелије и ослобађају њихов садржај.
- Узорак се центрифугира или филтрира да би се уклонили ћелијски остаци, а екстраховани садржај се сакупља за анализу низводно.
Недостаци уобичајених метода лизе
Током вашег рада у лабораторијама, можда сте већ искусили проблеме са лизом ћелија користећи традиционалне механичке или хемијске протоколе лизе.
- Механичка лиза: Методе механичке лизе, као што је млевење малтером и тучком или хомогенизација помоћу француске пресе, млина за перле или система ротор-статор, често немају прецизне опције контроле и подешавања. То значи да употреба млевења и млевења може брзо да генерише топлоту и силе смицања које могу оштетити узорак и денатурирати протеине. Они такође могу бити дуготрајни и захтевати велике количине почетног материјала.
- Хемијска лиза: Методе хемијске лизе, као што је лиза на бази детерџента, могу оштетити узорак поремећењем двослоја липида и денатурацијом протеина. Они такође могу захтевати више корака и могу оставити заостале загађиваче који ометају низводне апликације. Проналажење оптималне дозе детерџента је додатни изазов.
- Циклуси замрзавања-одмрзавања: Циклуси замрзавања-одмрзавања могу узроковати пуцање ћелијских мембрана, али поновљени циклуси такође могу узроковати денатурацију и деградацију протеина. Ова метода такође може захтевати више циклуса, што може бити дуготрајно и често резултира нижим приносима.
- Ензимска лиза: Методе ензимске лизе могу бити специфичне за одређене типове ћелија и захтевају више корака, што их чини дуготрајним. Они такође стварају отпад и захтевају пажљиву оптимизацију да би се избегла деградација узорка. Комплети за ензимску лизу су често скупи. Ако ваша тренутна процедура ензимске лизе даје недовољне резултате, ултразвук као синергистички метод се може применити да би се интензивирало оштећење ћелија.
За разлику од конвенционалних метода механичке и хемијске лизе ћелија, соникација је веома ефикасан и поуздан алат за дезинтеграцију ћелија који омогућава потпуну контролу над параметрима соникације. Ово обезбеђује високу селективност ослобађања материјала и чистоће производа. [уп. Баласундарам ет ал., 2009]
Погодан је за све типове ћелија и лако се примењује у малим и великим размерама – увек под контролисаним условима. Ултрасоникатори се лако чисте. Ултразвучни хомогенизатор увек има функцију чишћења на месту (ЦИП) и стерилизацију на месту (СИП). Сонотрода се састоји од масивног титанијумског рога који се може обрисати или испрати водом или растварачем (у зависности од радног медијума). Одржавање ултразвучних апарата је због њихове робусности готово занемарљиво.
Ултразвучна лиза и поремећај ћелија
Генерално, лиза узорака у лабораторији ће трајати између 15 секунди и 2 минута. Како је интензитет соникације врло лако подесити подешавањем амплитуде времена соникације као и одабиром праве опреме, могуће је пореметити ћелијске мембране веома нежно или веома нагло, у зависности од структуре ћелије и сврхе лизе ( нпр. екстракција ДНК захтева мекшу обраду ултразвуком, комплетна екстракција протеина бактерија захтева интензивнији ултразвучни третман). Температура током процеса се може пратити помоћу интегрисаног температурног сензора и може се лако контролисати хлађењем (ледено купатило или проточне ћелије са расхладним омотачем) или ултразвуком у пулсном режиму. Током ултразвучне обраде у пулсном режиму, кратки циклуси ултразвучне обраде у трајању од 1-15 секунди омогућавају дисипацију топлоте и хлађење током дужих повремених периода.
Сви процеси вођени ултразвуком су потпуно поновљиви и линеарно скалабилни.
Тхе ВиалТвеетер је ултразвучни хомогенизатор за истовремену, уједначену и брзу стерилну припрему бројних узорака.
- Припрема ћелијске суспензије: ћелијске пелете морају бити потпуно суспендоване у пуферском раствору хомогенизацијом (одаберите свој пуферски раствор који је компатибилан са следећом анализом, нпр. методом специфичне хроматографије). Додајте лизозиме и/или друге адитиве, ако је потребно (они такође морају бити компатибилни са средствима за одвајање/пречишћавање). Нежно мешајте/хомогенизирајте раствор уз благу соникацију док се не постигне потпуна суспензија.
Pročitajte više o sinergiji lizozima u kombinaciji sa sonikacijom! - Ултразвучна лиза: Ставите узорак у ледено купатило. За поремећај ћелија, соникирајте суспензију у рафовима од 60-90 секунди (користећи пулсни режим вашег соникатора).
- Одвајање: Центрифугирајте лизат (нпр. 10 мин. на 10,000 кг; на 4°Ц). Пажљиво одвојите супернатант од ћелијске пелете. Супернатант је укупан ћелијски лизат. Након филтрације супернатанта, добијате прочишћену течност растворљивог ћелијског протеина.
Најчешће примене ултразвучних апарата у биологији и биотехнологији су:
- Припрема ћелијског екстракта
- Поремећај квасца, бактерија, биљних ћелија, меког или тврдог ћелијског ткива, нуклеинског материјала
- Екстракција протеина
- Припрема и изолација ензима
- Производња антигена
- Екстракција ДНК и/или циљана фрагментација
- припрема липозома
Поремећај ћелија ултразвучним апаратом типа сонде је ефикасан метод припреме узорка.
Многобројне примене ултразвука гране се у секторима биотехнологије, биоинжењеринга, микробиологије, молекуларне биологије, биохемије, имунологије, бактериологије, вирологије, протеомике, генетике, физиологије, ћелијске биологије, хематологије и ботанике.
Лиза: разбијање ћелијских структура
Ћелије су заштићене полупропусном плазма мембраном која се састоји од фосфо-липидног двослоја (такође протеин-липидног двослоја; формираног од хидрофобних липида и хидрофилних молекула фосфора са уграђеним протеинским молекулима) и ствара баријеру између унутрашњости ћелије) и (цитоплазме). екстрацелуларно окружење. Биљне ћелије и прокариотске ћелије су окружене ћелијским зидом. Због вишеслојног дебелог ћелијског зида целулозе, биљне ћелије се теже лизују него животињске ћелије. Унутрашњост ћелије, као што су органеле, језгро, митохондрије, стабилизује се цитоскелетом.
Лизирањем ћелија има за циљ екстракцију и одвајање органела, протеина, ДНК, иРНК или других биомолекула.
Конвенционалне методе лизе ћелија и њихови недостаци
Постоји неколико метода за лизавање ћелија, које се могу поделити на механичке и хемијске методе, које укључују употребу детерџената или растварача, примену високог притиска или употребу млина за перле или француске пресе. Најпроблематичнији недостатак ових метода је отежана контрола и прилагођавање параметара процеса и самим тим утицаја.
Табела испод приказује главне недостатке уобичајених метода лизе:
Табела: Конвенционалне методе лизе ћелија имају велике недостатке
Процедура лизе
Лиза је осетљив процес. Током лизе заштита ћелијске мембране је уништена, али се мора спречити инактивација, денатурација и деградација екстрахованих протеина у нефизиолошком окружењу (одступање од пХ вредности). Стога се генерално лиза изводи у пуферском раствору. Већина потешкоћа произилази из неконтролисаног прекида ћелија које резултира нециљаним ослобађањем целокупног интрацелуларног материјала или/и денатурацијом циљног производа.
Често постављана питања о ултразвуку и лизи ћелија
- Можете ли да лизирате ћелије соникацијом? Да, ултразвучна обрада ефикасно лизира ћелије користећи високофреквентне ултразвучне таласе који изазивају кавитацију, феномен где се сићушни мехурићи паре формирају и насилно колабирају унутар суспензије ћелије. Настале механичке силе ометају ћелијске мембране и олакшавају ослобађање интрацелуларних компоненти у течност.
- Како користити соникатор за лизу ћелија? Коришћење соникатора за лизу ћелија укључује урањање сонде соникатора у ћелијску суспензију и подешавање параметара као што су амплитуда и трајање импулса. Процес треба пажљиво пратити како би се оптимизирало ћелијско нарушавање уз минимизирање денатурације протеина и инактивације ензима.
- Који је принцип соникације за лизу ћелија? Соникација ради на принципу акустичне кавитације. Ултразвучна енергија се преноси у течни медијум, изазивајући брзе флуктуације притиска које доводе до стварања и имплозије микромехурића. Ове имплозије стварају интензивне силе смицања и локализоване високе температуре, нарушавајући ћелијске структуре и повећавајући хомогеност лизата.
- Колико дуго траје ултразвук за лизу ћелија? Трајање соникације за лизу ћелија може значајно да варира у зависности од фактора као што су тип ћелије, густина ћелије, снага соникатора и специфичног протокола који се користи. Типичне процедуре могу да се крећу од неколико секунди до неколико минута, често се изводе у циклусима како би се управљало стварањем топлоте и обезбедило равномерно оштећење ћелија.
- Која је сврха соникације у екстракцији протеина? У екстракцији протеина, соникација служи за ефикасно пуцање ћелијских мембрана и солубилизацију протеина. Овај метод је посебно користан за ослобађање протеина из ћелијских одељака, што га чини неопходним за припрему лизата из којих ће протеини бити пречишћени или анализирани.
- Зашто се соникација користи за екстракцију? Соникација је фаворизована за екстракцију због брзог деловања и способности примене циљане енергије, разбијања ћелијских структура да би се ослободили биоактивни молекули без употребе оштрих хемијских третмана, чиме се чува функционални интегритет екстрахованих једињења.
- Да ли соникација ремети интеракције протеина и протеина? Док ултразвук може ефикасно пореметити ћелијске мембране, такође може пореметити интеракције протеина и протеина. Ниво поремећаја зависи од интензитета ултразвучне обраде и трајања експозиције, што потенцијално може довести до денатурације или дисоцијације протеинских комплекса, што може утицати на накнадне аналитичке или функционалне студије.
- Може ли се соникација користити за лизу Е. цоли? Хиелсцхер соникатори су посебно ефикасни за лизу бактеријских ћелија као што је Е. цоли, које имају чврсте ћелијске зидове. Техника пружа физичку методу за смицање ћелијског зида и мембране, што је чини пожељним методом за припрему бактеријских лизата у лабораторијама за молекуларну биологију и биохемију.
- Koji su naknadni procesi nakon koraka ultrazvuka?
Nizvodni koraci nakon ultrazvučne lize obično uključuju frakcionisanje lizata, ciljanu izolaciju organela i dalju ekstrakciju ili prečišćavanje proteina.
Obrađeni lizat se zatim odvaja i priprema za analitičke ili funkcionalne primene, kao što su proteomika visoke rezolucije, transkriptomika ili studije vezanja receptora.
Литература/Референце
- Balasundaram, B.; Harrison, S.; Bracewell, D. G. (2009): Advances in product release strategies and impact on bioprocess design. Trends in Biotechnology 27/8, 2009. pp. 477-485.
- Vilkhu, K.; Manasseh, R.; Mawson, R.; Ashokkumar, M. (2011): Ultrasonic Recovery and Modification of Food ingredients. In: Feng/ Barbosa-Cánovas/ Weiss (2011): Ultrasound Technologies for Food and Bioprocessing. New York: Springer, 2011. pp. 345-368.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
- Brandy Verhalen, Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.