Соникација за лизу ћелија: разарање ћелија и екстракција
Ултразвучна лиза ћелија је широко примењивана техника припреме узорака у савременим биотехнолошким лабораторијама. Њена основна сврха је разарање ћелијских мембрана или целих ћелија ради ослобађања унутарћелијских компоненти као што су протеини, нуклеинске киселине или органеле. У свакодневном лабораторијском раду то значи да је соникација стандардна метода за контролисано разарање ћелија и ефикасну екстракцију биомолекула. Кључна предност соникатора лежи у њиховој способности да прецизно подешавају критичне параметре процеса, укључујући интензитет ултразвука, пулсирање и контролу температуре. Ова контрола омогућава истраживачима да постигну поуздану лизу уз свођење топлотног или механичког оштећења осетљивих биомолекула на најмању могућу меру, што резултира благим, а ипак високо ефикасним процесом екстракције.
Лиза ћелија помоћу соникатора
Ултразвучна лиза ћелија користи акустичну кавитацију за разарање ћелијских мембрана и ослобађање унутарћелијских молекула. Hielscher Ultrasonics нуди класични соникатор са сондом, као и соникаторе за више узорака за стерилну обраду: VialTweeter за више епрувета и бочица и соникатор плоча са 96 бунарчића UIP400MTP за стандардне микроплоче.
Hielscher Ultrasonics испоручује снажне бесконтактне соникаторе за припрему узорака и клиничку анализу. Соникатор плоча са више бунарчића UIP400MTP, VialTweeter, CupHorn и проточни соникатор GDmini2 обрађују узорке у стерилним условима.
Ултразвучни хомогенизатори UP100H (100 вати) и UP400St (400 вати): соникација за лизу ћелија и екстракцију.
Ултразвучни хомогенизатори за лизу ћелија и екстракцију
| Тип ултразвучног уређаја | Главна област примене | Запремина узорка | Типичан пример примене | Предности | Примери модела |
|---|---|---|---|---|---|
| Соникатори са сондом | Соникација појединачног узорка | 0,1 mL до ~1000 mL | Лиза ћелија, екстракција протеина, фрагментација ДНК/РНК | Прецизна контрола енергије; различите сонотроде; оптимално за мале до средње узорке | UP100H, UP200St, UP400St |
| VialTweeter / CupHorn | Паралелна обрада више затворених бочица | 8–10 бочица (свака ~1–20 mL) | Стандардизована лиза више ћелијских суспензија | Уједначена соникација; спречава унакрсну контаминацију; поновљиви резултати | VialTweeter, CupHorn |
| Соникатор плоча са 96 бунарчића | Соникација плоча са више бунарчића и микротитарских плоча | Формат микроплоче | Скрининг великог броја узорака, протеомика, ћелијски тестови | Истовремена, равномерна соникација у свим бунарчићима; идеално за радне поступке са више узорака | UIP400MTP |
| Реактори са проточном ћелијом | Континуирана соникација за веће запремине | >1 L, могуће повећање размера | Разарање ћелија у индустријским размерама, производња екстраката | Континуирана обрада; могуће повећање размера; потпуна контрола процеса (амплитуда, притисак, температура) | UIP1000hdT, UIP2000hdT + проточна ћелија |
| Системи за стерилну / индиректну соникацију | Обрада узорака без контаминације | Зависи од бочице/епрувете/микроплоче | Осетљиви узорци, стерилна окружења, рад у условима регулисаним прописима | Без контакта са сондом; спречава преношење остатака између узорака; минималан напор за чишћење | VialTweeter, CupHorn, UIP400MTP |
Предности примене соникације за лизу ћелија
У поређењу са другим методама лизе ћелија и екстракције, ултразвучна лиза ћелија има неколико предности:
- Брзина: Ултразвучна лиза ћелија и екстракција је брза метода која може да разори ћелије за свега неколико секунди. То је много брже од других метода као што су хомогенизација, замрзавање и одмрзавање или млевење куглицама.
- Ефикасност: Ултразвучна лиза ћелија и екстракција може се користити за обраду малих, великих или више узорака одједном, што је чини ефикаснијом од других метода које захтевају појединачну обраду малих узорака.
- Без хемикалија: Ултразвучна лиза ћелија и екстракција је неинвазивна метода која не захтева употребу агресивних хемикалија или ензима. То је чини идеалном за примене у којима је потребно очувати интегритет ћелијског садржаја. Нежељена контаминација узорака може се избећи.
- Висок принос: Ултразвучном лизом ћелија и екстракцијом може се постићи висок принос ћелијског садржаја, укључујући ДНК, РНК и протеине. То је зато што високофреквентни звучни таласи разарају ћелијске зидове и ослобађају садржај у околни раствор.
- Контрола температуре: Софистицирани ултрасоникатори омогућавају прецизну контролу температуре узорка. Дигитални соникатори Hielscher опремљени су прикључним температурним сензором и софтвером за праћење температуре.
- Репродуктивност: Протоколи за ултразвучну лизу ћелија могу се лако репродуковати, па чак и прилагодити различитим већим или мањим запреминама узорака једноставним линеарним скалирањем.
- Свестраност: Ултразвучна лиза ћелија и екстракција могу се користити за екстракцију из широког спектра типова ћелија, укључујући бактерије, квасце, гљиве, биљне ћелије и ћелије сисара. Такође се могу користити за екстракцију различитих врста молекула, укључујући протеине, ДНК, РНК и липиде.
- Истовремена припрема бројних узорака: Hielscher Ultrasonics нуди неколико решења за једноставну обраду бројних узорака под потпуно истим процесним условима. Тиме фаза припреме узорака која обухвата лизу и екстракцију постаје веома ефикасна и штеди време.
- Једноставна употреба: Опрема за ултразвучну лизу ћелија и екстракцију једноставна је за употребу и захтева минималну обуку. Опрема је такође економична јер представља једнократно улагање без потребе за поновном куповином потрошног материјала. То је чини привлачном за широк круг истраживача и лабораторија.
Свеукупно, ултразвучна лиза ћелија и екстракција представљају брзу, ефикасну, прецизно контролисану и свестрану методу за екстракцију ћелијског садржаја. Њене предности у односу на алтернативне методе чине је привлачним избором за широк спектар истраживачких и индустријских примена.
Принцип рада ултразвучне лизе ћелија
Ултразвучна лиза ћелија и екстракција користе звучне таласе високе фреквенције за разарање ћелија и екстракцију њиховог садржаја. Звучни таласи стварају промене притиска у околној течности, што доводи до настанка и колапса малих мехурића у процесу познатом као кавитација. Ови мехурићи стварају локализоване механичке силе веома високог интензитета које могу да разоре ћелије и ослободе њихов садржај у околни раствор.
Лиза ћелија помоћу ултрасоникатора обично обухвата следеће кораке:
- Узорак се ставља у епрувету или посуду са течним пуфером.
- Ултразвучна сонда се урања у узорак и примењују се звучни таласи високе фреквенције од приближно 20–30 kHz.
- Ултразвучни таласи изазивају осциловање и кавитацију у околној течности, стварајући локализоване силе које разарају ћелије и ослобађају њихов садржај.
- Узорак се центрифугира или филтрира како би се уклонили сви ћелијски остаци, а екстраховани садржај се прикупља за даљу анализу.
Недостаци уобичајених метода лизе
Током рада у лабораторијама можда сте се већ сусрели са потешкоћама при лизи ћелија применом традиционалних протокола механичке или хемијске лизе.
- Механичка лиза: Методама механичке лизе, као што су уситњавање у авану тучком или хомогенизација помоћу француске пресе, млина са куглицама или система ротор–статор, често недостају могућности прецизне контроле и подешавања. То значи да млевење и уситњавање могу брзо да створе топлоту и силе смицања које могу да оштете узорак и денатуришу протеине. Ове методе такође могу да захтевају много времена и велике количине почетног материјала.
- Хемијска лиза: Методе хемијске лизе, као што је лиза помоћу детерџената, могу да оштете узорак нарушавањем липидног двослоја и денатурацијом протеина. Такође могу да захтевају више корака и могу да оставе заостале контаминанте који ометају наредне примене. Проналажење оптималне дозе детерџента представља додатни изазов.
- Циклуси замрзавања и одмрзавања: Циклуси замрзавања и одмрзавања могу да изазову пуцање ћелијских мембрана, али поновљени циклуси могу да доведу и до денатурације и разградње протеина. Ова метода такође може да захтева више циклуса, што може да одузме много времена и често доводи до нижих приноса.
- Ензимска лиза: Методе ензимске лизе могу бити специфичне за одређене типове ћелија и захтевати више корака, због чега одузимају много времена. Оне такође стварају отпад и захтевају пажљиву оптимизацију како би се избегла деградација узорка. Комплети за ензимску лизу често су скупи. Ако ваш тренутни поступак ензимске лизе даје недовољне резултате, соникација се може применити као синергистичка метода за интензивирање разарања ћелија.
За разлику од конвенционалних механичких и хемијских метода лизе ћелија, соникација је веома ефикасно и поуздано средство за дезинтеграцију ћелија које омогућава потпуну контролу параметара соникације. Тиме се обезбеђују висока селективност ослобађања материјала и чистоћа производа. [уп. Balasundaram et al., 2009]
Погодна је за све типове ћелија и лако се примењује у малим и великим размерама – увек у контролисаним условима. Ултразвучни уређаји се лако чисте. Ултразвучни хомогенизатор увек има функције чишћења на месту (CIP) и стерилизације на месту (SIP). Сонотрода се састоји од масивног титанијумског рога који се може обрисати или испрати водом или растварачем (у зависности од радног медијума). Захваљујући робусности ултразвучних уређаја, потреба за њиховим одржавањем је готово занемарљива.
Ултразвучна лиза и разарање ћелија
Лиза узорака у лабораторији углавном траје између 15 секунди и 2 минута. Пошто се интензитет соникације веома лако подешава преко амплитуде и времена соникације, као и избором одговарајуће опреме, ћелијске мембране могу се разарати веома благо или веома нагло, у зависности од структуре ћелије и сврхе лизе (нпр. екстракција ДНК захтева блажу соникацију, док потпуна екстракција протеина из бактерија захтева интензивнији ултразвучни третман). Температура током процеса може се пратити интегрисаним температурним сензором и лако контролисати хлађењем (ледено купатило или проточне ћелије са расхладним плаштом) или соникацијом у пулсном режиму. Током соникације у пулсном режиму, кратки циклуси соникационих импулса у трајању од 1–15 секунди омогућавају одвођење топлоте и хлађење током дужих пауза између њих.
Сви процеси који се одвијају под дејством ултразвука потпуно су поновљиви и могу се линеарно пренети на веће или мање размере.
VialTweeter је ултразвучни хомогенизатор за истовремену, уједначену и брзу стерилну припрему бројних узорака.
- Припрема ћелијске суспензије: Ћелијски талог мора се потпуно суспендовати у пуферском раствору хомогенизацијом (изаберите пуферски раствор компатибилан са накнадном анализом, нпр. одређеном хроматографском методом). По потреби додајте лизозиме и/ или друге адитиве (они такође морају бити компатибилни са средствима за раздвајање/ пречишћавање). Пажљиво мешајте/ хомогенизујте раствор уз благу соникацију док се не постигне потпуно суспендовање.
Прочитајте више о синергистичким ефектима лизозима у комбинацији са соникацијом! - Ултразвучна лиза: Поставите узорак у ледено купатило. За разарање ћелија, соницирајте суспензију у импулсима од 60–90 секунди (користећи пулсни режим свог соникатора).
- Раздвајање: Центрифугирајте лизат (нпр. 10 мин. при 10.000 x g; на 4degC). Пажљиво одвојите супернатант од ћелијског талога. Супернатант је укупни ћелијски лизат. Након филтрације супернатанта добијате бистру течност са растворљивим ћелијским протеинима.
Најчешће примене ултразвучних уређаја у биологији и биотехнологији су:
- Припрема ћелијског екстракта
- Разарање квасаца, бактерија, биљних ћелија, меког или тврдог ћелијског ткива, нуклеинског материјала
- Екстракција протеина
- Припрема и изоловање ензима
- Производња антигена
- Екстракција ДНК и/ или циљана фрагментација
- Припрема липозома
Разарање ћелија ултразвучним уређајем са сондом је ефикасна метода припреме узорака.
Многобројне примене ултразвука обухватају области биотехнологије, биоинжењерства, микробиологије, молекуларне биологије, биохемије, имунологије, бактериологије, вирусологије, протеомике, генетике, физиологије, ћелијске биологије, хематологије и ботанике.
Лиза: разарање ћелијских структура
Ћелије су заштићене полупропустљивом плазма мембраном која се састоји од фосфолипидног двослоја (такође протеинско-липидног двослоја; формираног од хидрофобних липида и хидрофилних молекула фосфора са уграђеним молекулима протеина) и ствара баријеру између унутрашњости ћелије (цитоплазме) и ванћелијске средине. Биљне и прокариотске ћелије окружене су ћелијским зидом. Због целулозног ћелијског зида дебљине више слојева, биљне ћелије се теже лизирају од животињских. Унутрашње структуре ћелије, као што су органеле, једро и митохондрија, стабилизоване су цитоскелетом.
Лизирање ћелија има за циљ екстракцију и одвајање органела, протеина, ДНК, мРНК или других биомолекула.
Конвенционалне методе лизе ћелија и њихови недостаци
Постоји неколико метода за лизирање ћелија, које се могу поделити на механичке и хемијске методе, а обухватају употребу детерџената или растварача, примену високог притиска или употребу млина са куглицама или француске пресе. Најпроблематичнији недостатак ових метода јесте отежана контрола и подешавање параметара процеса, а тиме и њиховог дејства.
Табела у наставку приказује главне недостатке уобичајених метода лизе:
Табела: Конвенционалне методе лизе ћелија имају велике недостатке
Поступак лизе
Лиза је осетљив процес. Током лизе уништава се заштитна функција ћелијске мембране, али се морају спречити инактивација, денатурација и разградња екстрахованих протеина услед нефизиолошке средине (одступања од pH вредности). Због тога се лиза углавном спроводи у пуферском раствору. Највише потешкоћа настаје услед неконтролисаног разарања ћелија, које доводи до нециљаног ослобађања целокупног унутарћелијског материјала и/или денатурације циљног производа.
Често постављана питања о соникацији и лизи ћелија
- Могу ли се ћелије лизирати соникацијом? Да, соникација ефикасно лизира ћелије помоћу високофреквентних ултразвучних таласа који изазивају кавитацију, појаву при којој се у ћелијској суспензији формирају ситни мехурићи паре и нагло колабирају. Настале механичке силе разарају ћелијске мембране и олакшавају ослобађање унутарћелијских компонената у течност.
- Како се соникатор користи за лизу ћелија? Употреба соникатора за лизу ћелија подразумева урањање сонде соникатора у ћелијску суспензију и подешавање параметара као што су амплитуда и трајање импулса. Процес треба пажљиво пратити како би се оптимизовало разарање ћелија уз свођење денатурације протеина и инактивације ензима на најмању могућу меру.
- На ком принципу се заснива соникација за лизу ћелија? Соникација се заснива на принципу акустичке кавитације. Ултразвучна енергија се преноси у течну средину, изазивајући брзе промене притиска које доводе до формирања и имплозије микромехурића. Ове имплозије стварају интензивне смицајне силе и локализоване високе температуре, разарајући ћелијске структуре и повећавајући хомогеност лизата.
- Колико траје соникација за лизу ћелија? Трајање соникације за лизу ћелија може знатно да варира у зависности од фактора као што су тип ћелија, густина ћелија, снага соникатора и конкретан протокол који се користи. Уобичајени поступци могу трајати од неколико секунди до неколико минута, а често се спроводе у циклусима како би се контролисало стварање топлоте и обезбедило равномерно разарање ћелија.
- Која је сврха соникације при екстракцији протеина? При екстракцији протеина, соникација служи за ефикасно разарање ћелијских мембрана и солубилизацију протеина. Ова метода је нарочито корисна за ослобађање протеина из унутарћелијских одељака, што је чини неопходном за припрему лизата из којих се протеини пречишћавају или анализирају.
- Зашто се соникација користи за екстракцију? Соникација је пожељна за екстракцију због свог брзог дејства и могућности циљане примене енергије, при чему разара ћелијске структуре ради ослобађања биоактивних молекула без употребе агресивних хемијских третмана, чиме се очувава функционални интегритет екстрахованих једињења.
- Да ли соникација нарушава интеракције између протеина? Иако соникација може ефикасно да разори ћелијске мембране, она може и да наруши интеракције између протеина. Степен нарушавања зависи од интензитета соникације и трајања излагања, што потенцијално доводи до денатурације или дисоцијације протеинских комплекса, а то би могло да утиче на накнадна аналитичка или функционална испитивања.
- Може ли се соникација користити за лизу ћелија E. coli? Hielscher соникатори су посебно ефикасни за лизу бактеријских ћелија као што су ћелије E. coli, које имају чврсте ћелијске зидове. Ова техника представља физичку методу разарања ћелијског зида и мембране смицањем, што је чини пожељном методом за припрему бактеријских лизата у лабораторијама за молекуларну биологију и биохемију.
- Који процеси следе након корака соникације?
Кораци након ултразвучне лизе обично обухватају фракционисање лизата, циљану изолацију органела и даљу екстракцију или пречишћавање протеина.
Обрађени лизат се затим раздваја и припрема за аналитичке или функционалне примене, као што су протеомика високе резолуције, транскриптомика или испитивања везивања за рецепторе.
Литература/Референце
- Balasundaram, B.; Harrison, S.; Bracewell, D. G. (2009): Advances in product release strategies and impact on bioprocess design. Trends in Biotechnology 27/8, 2009. pp. 477-485.
- Vilkhu, K.; Manasseh, R.; Mawson, R.; Ashokkumar, M. (2011): Ultrasonic Recovery and Modification of Food ingredients. In: Feng/ Barbosa-Cánovas/ Weiss (2011): Ultrasound Technologies for Food and Bioprocessing. New York: Springer, 2011. pp. 345-368.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
- Brandy Verhalen, Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.