Ултразвучна припрема липозома

Липозоми произведени ултразвуком показују веома високу ефикасност инкапсулације, висок капацитет пуњења и уједначено мале димензије сферних честица. Захваљујући томе, липозоми произведени ултразвуком пружају одличну биорасположивост. Hielscher Ultrasonics нуди ултразвучне уређаје за поуздану производњу липозома фармацеутског квалитета у шаржном и континуалном режиму.

Предности ултразвучне производње липозома

Ултразвучна инкапсулација у липозоме је техника којом се лекови или друга терапијска средства инкапсулирају у липозоме применом ултразвучне енергије. У поређењу са другим методама инкапсулације у липозоме, ултразвучна инкапсулација има неколико предности које је чине супериорном производном техником.

• Висок садржај активних састојака, висока ефикасност инкапсулације: Ултразвучна производња липозома добро је позната по добијању липозома са високим садржајем активних састојака, нпр. витамина C, молекула лекова итд. Истовремено, метода соникације показује високу ефикасност инкапсулације. То значи да се ултразвучном обрадом инкапсулира висок проценат активне супстанце. Све то чини ултразвучну обраду високо ефикасном методом за производњу липозома.
• Уједначено мали липозоми: Једна од предности ултразвучне инкапсулације у липозоме јесте могућност производње веома уједначених липозома са уском расподелом величина. Ултразвучна енергија може се користити за разбијање већих липозома или липидних агрегата у мање, уједначеније липозоме. То доводи до веће уједначености величине и облика липозома, што може бити важно за примене у испоруци лекова, где величина честица може утицати на њихову фармакокинетику и ефикасност.
• Применљиво на све молекуле: Још једна предност ултразвучне инкапсулације у липозоме јесте могућност инкапсулације широког спектра лекова и других терапијских средстава. Ова техника може се користити за инкапсулацију и хидрофилних и хидрофобних лекова, што другим методама може бити тешко постићи. Поред тога, ултразвучна енергија може се користити за инкапсулацију макромолекула и наночестица, које могу бити превелике за инкапсулацију другим методама.
• Брзо и поуздано: Ултразвучна инкапсулација у липозоме такође је релативно једноставан и брз процес. Не захтева употребу агресивних хемикалија или високих температура, које могу штетно утицати на терапијска средства која се инкапсулирају.
• Повећање обима производње: Поред тога, обим примене ове технике лако се може повећати за производњу великих размера, што је чини исплативом опцијом за примене у испоруци лекова.

Укратко, ултразвучна инкапсулација у липозоме је супериорна техника инкапсулације у липозоме захваљујући могућности производње уједначених липозома са уском расподелом величина, инкапсулације широког спектра терапијских средстава, као и својој једноставности и могућности повећања обима производње.

Након формирања липидног филма и накнадне рехидратације, соникација се користи за поспешивање инкапсулације активних састојака у липозом. Поред тога, соникацијом се постиже жељена величина липозома.

Ултразвучна припрема липозома за фармацеутске и козметичке производе

Липозоми (везикуле на бази липида), трансферозоми (ултрадeформабилни липозоми), етозоми (ултрадeформабилне везикуле са високим садржајем алкохола) и ниозоми (синтетичке везикуле) јесу микроскопске везикуле које се могу вештачки припремити као сферни носачи у које се могу инкапсулирати активни молекули. Ове везикуле, пречника између 25 и 5000 nm, често се користе као носачи лекова у фармацеутској и козметичкој индустрији, на пример за оралну или локалну испоруку лекова, генску терапију и имунизацију. Ултразвучна обрада је научно доказана метода за високо ефикасну производњу липозома. Ултразвучни уређаји Hielscher производе липозоме са високим садржајем активних састојака и супериорном биорасположивошћу.

Липозоми и липозомална формулација

Липосоми су униламеларни, олиголамеларни или мултиламеларни везикуларни системи и састоје се од истог материјала као ћелијска мембрана (липидни двослој). Према саставу и величини, липосоми се разликују на следећи начин:

• мултиламеларне везикуле (MLV, 0,1–10μm)
• мале униламеларне везикуле (SUV, <100 nm)
• велике униламеларне везикуле (LUV, 100–500 nm)
• гигантске униламеларне везикуле (GUV, ≥1 μm)

Основну структуру липосома чине фосфолипиди. Фосфолипиди имају хидрофилну главу и хидрофобни реп, који се састоји од дугог угљоводоничног ланца.
Мембрана липосома има састав веома сличан кожној баријери, па се липосоми могу лако интегрисати у људску кожу. Када се липосоми стапају са кожом, могу ослободити инкапсулиране супстанце директно на циљном месту, где активне супстанце могу да остваре своје функције. Тако липосоми повећавају пенетрабилност/пропустљивост коже за инкапсулиране фармацеутске и козметичке супстанце. И липосоми без инкапсулираних супстанци, односно празне везикуле, представљају снажне активне састојке за кожу, јер фосфатидилхолин садржи две есенцијалне супстанце које људски организам не може сам да произведе: линолну киселину и холин.
Липосоми се користе као биокомпатибилни носачи лекова, пептида, протеина, плазматске ДНК, антисенс олигонуклеотида или рибозима у фармацеутске, козметичке и биохемијске сврхе. Изузетна разноврсност величина честица и физичких параметара липида пружа привлачан потенцијал за израду носача прилагођених широком спектру примена. (Ulrich 2002)

Ултразвучно формирање липосома

Липосоми се могу формирати применом ултразвука. Основни материјал за припрему липосома чине амфифилни молекули добијени из липида биолошких мембрана или засновани на њима. За формирање малих униламеларних везикула (SUV), липидна дисперзија се благо соницира – нпр. ручним ултразвучним уређајем UP50H (50W, 30kHz), уређајем VialTweeter или ултразвучним реактором CupHorn – у леденом купатилу. Такав ултразвучни третман траје приближно 5 – 15 минута. Други метод за производњу малих униламеларних везикула јесте соникација липосома у облику мултиламеларних везикула.
Dinu-Pirvu et al. (2010) извештавају о добијању трансферозома соницирањем MLV на собној температури.
Hielscher Ultrasonics нуди различите ултразвучне уређаје, сонотроде и додатну опрему и стога може да обезбеди најпогоднију ултразвучну поставку за високоефикасну липосомалну инкапсулацију у било којој размери.

Ултразвучна инкапсулација активних супстанци у липосоме

Липосоми служе као носачи активних састојака као што су витамини, терапијски молекули, пептиди итд. Ултразвук је ефикасно средство за припрему и формирање липосома за заробљавање активних супстанци. Истовремено, соникација потпомаже процес инкапсулације и заробљавања, тако да се добијају липосоми са високим садржајем активних састојака. Пре инкапсулације, липосоми имају тенденцију да формирају кластере услед површинских интеракција између наелектрисања поларних глава фосфолипида (уп. Míckova et al. 2008), а поред тога морају да се отворе. На пример, Zhu et al. (2003) описују инкапсулацију биотина у праху у липосоме применом ултразвука. Након додавања биотина у праху у раствор са суспензијом везикула, раствор је сонициран. После овог третмана, биотин је био заробљен у липосомима.
Прочитајте више о ултразвучној инкапсулацији GLP-1 пептида (нпр. семаглутида) у липосоме!

Липосомалне емулзије уз примену ултразвука

Да би се појачало негујуће дејство хидратантних крема или крема против старења, лосиона, гелова и других козмецеутских формулација, липозомалним дисперзијама се додају емулгатори ради стабилизације већих количина липида. Међутим, истраживања су показала да је капацитет липозома генерално ограничен. Уз додатак емулгатора, овај ефекат ће се јавити раније, а додатни емулгатори смањују афинитет фосфатидилхолина према кожној баријери. Наночестице – састављене од фосфатидилхолина и липида – представљају решење овог проблема. Ове наночестице се састоје од капљице уља прекривене монослојем фосфатидилхолина. Употреба наночестица омогућава добијање формулација које могу да приме више липида и остану стабилне, тако да додатни емулгатори нису потребни.
Ултразвучна обрада је доказана метода за производњу наноемулзија и нанодисперзија. Ултразвук високог интензитета обезбеђује снагу потребну за дисперговање једне течне фазе (дисперговане фазе) у виду ситних капљица у другој фази (континуалној фази). У зони дисперговања, кавитациони мехурићи који имплодирају изазивају интензивне ударне таласе у околној течности и доводе до стварања млазева течности велике брзине. Да би се новоформиране капљице дисперговане фазе стабилизовале и спречила њихова коалесценција, емулзији се додају емулгатори (површински активне супстанце, сурфактанти) и стабилизатори. Пошто коалесценција капљица након уситњавања утиче на коначну расподелу величине капљица, користе се емулгатори који ефикасно стабилизују емулзију како би коначна расподела величине капљица остала једнака расподели непосредно након уситњавања капљица у зони ултразвучног дисперговања.

Липозомалне дисперзије помоћу ултразвучне обраде

Липозомалне дисперзије на бази незасићеног фосфатидилхлорина немају довољну стабилност према оксидацији. Стабилизација дисперзије може се постићи антиоксидансима, на пример комплексом витамина C и E.
 

Формирање липозома методом испаравања реверзне фазе уз соникацију

 
Ortan и сар. (2002) постигли су добре резултате у свом истраживању ултразвучне припреме етарског уља Anethum graveolens у липозомима. Након соникације, величина липозома била је између 70–150 nm, а за MLV између 230–475 nm; ове вредности су остале приближно константне и након 2 месеца, али су се повећале након 12 месеци, нарочито у SUV дисперзији (видети хистограме у наставку). Мерење стабилности, које се односило на губитак етарског уља и расподелу величине, такође је показало да су липозомалне дисперзије очувале садржај испарљивог уља. То указује на то да је инкапсулација етарског уља у липозоме повећала стабилност уља.

Ortan и сар. (2009): Стабилност MLV и SUV дисперзија након 1 године. Липозомалне формулације су чуване на 4±1 ºC.

Hielscher ултразвучни процесори су идеални уређаји за примене у козметичкој и фармацеутској индустрији. Системи који се састоје од више ултразвучних процесора, сваки снаге до 16.000 вати, обезбеђују капацитет потребан да се ова лабораторијска примена претвори у ефикасну производну методу за добијање фино диспергованих емулзија у континуалном протоку или у шаржама – уз постизање резултата упоредивих са резултатима данас доступних најбољих хомогенизатора високог притиска, као што су вентили са отвором. Поред ове високе ефикасности у континуалном емулговању, Hielscher ултразвучни уређаји захтевају веома мало одржавања и веома су једноставни за руковање и чишћење. Ултразвук заиста олакшава чишћење и испирање. Ултразвучна снага је подесива и може се прилагодити одређеним производима и захтевима емулговања. Доступни су и специјални реактори са проточном ћелијом који испуњавају напредне захтеве за CIP (чишћење на месту) и SIP (стерилизацију на месту).

Често постављана питања о липозомима

Које врсте липозома се разликују?

Липозоми се класификују у различите врсте на основу своје величине и броја двослојева које садрже. Ове категорије обухватају:

• Мале униламеларне везикуле (SUV): То су најмањи липозоми са једним липидним двослојем.
• Велике униламеларне везикуле (LUV): Веће су од SUV и такође имају један двослој.
• Мултиламеларне везикуле (MLV): Садрже више концентричних двослојева.
• Мултивезикуларне везикуле (MVV): Састоје се од више мањих везикула унутар веће везикуле.

 
Остале специјализоване врсте обухватају:

• ПЕГиловани липозоми: Липозоми модификовани полиетиленгликолом (PEG) ради повећања стабилности и продужења времена циркулације.
• Нанолипозоми: Веома мали липозоми, који се обично користе за циљану испоруку лекова.

Какве структуре везикула могу имати липозоми?

Липозоми се даље, на основу структуре везикула, класификују у седам главних врста:

• Велике мултиламеларне везикуле (MLV): Садрже више двослојева.
• Олиголамеларне везикуле (OLV): Имају неколико двослојева.
• Мале униламеларне везикуле (SUV): Најмање су и имају један двослој.
• Униламеларне везикуле средње величине (MUV): Средње су величине и имају један двослој.
• Велике униламеларне везикуле (LUV): Веће су и имају један двослој.
• Џиновске униламеларне везикуле (GUV): Веома су велике и имају један двослој.
• Мултивезикуларне везикуле (MVV): Више везикула унутар једне велике везикуле.

Које су разлике између липозома и ниозома?

Липозоми и ниозоми се разликују углавном по свом саставу:
Липозоми: Израђени су од фосфолипида са два ланца, који могу бити неутрални или наелектрисани.
Ниозоми: Израђени су од ненаелектрисаних сурфактаната са једним ланцем и холестерола.
Обе структуре настају соникацијом, која подстиче формирање везикула са двослојевима.

Која је идеална величина липозома?

За испоруку терапеутских средстава, идеална величина липозома је теоретски између 50 и 200 нанометара у пречнику. Овај опсег величине оптимизује стабилност и биорасположивост. Соникација се често користи за смањење везикуле на жељену величину.

Могу ли липозоми да преносе хидрофилне лекове?

Да, липозоми могу да преносе хидрофилне лекове. Цењени су у биомедицинским применама због своје способности да инкапсулирају и хидрофобне и хидрофилне агенсе. Поред тога, одликују се високом биокомпатибилношћу и биоразградљивошћу, што их чини ефикасним системима за испоруку.

Како се припремају липозоми?

Најчешће технике припреме липозома су метода танког филма и метода испаравања реверзне фазе.
Метода хидратације танког филма:

1. Растворите липиде у органском растварачу.
2. Испарите растварач да би се формирао танак липидни филм.
3. Хидратишите филм воденим раствором уз примену соникације како би се формирале мултиламеларне везикуле.

Метода испаравања реверзне фазе:

1. Растворите липиде у води и етанолу.
2. Соницирајте раствор на 60°C око 10 минута да бисте добили липидну пасту.
3. Охладите липидну суспензију и додајте воду или пуфер кап по кап уз мешање.
4. Хидратишите суспензију 1 сат како би се формирале мултиламеларне везикуле.
5. Смањите величину липозома даљом соникацијом.

Шта су археозоми?

Археозоми су липозоми израђени од липида археја, који су познати по својој стабилности и отпорности на екстремне услове. Ова својства чине археозоме посебно корисним за испоруку лекова и развој вакцина у захтевним условима.

Како се припремају археозоми?

Поступак соникације према Pise (2022): Археозоми се могу добити од поларне липидне фракције „PLF“ врсте Sulfolobussolfataricus соникацијом на 60°C без потребе за додавањем липида из спољашњег извора. На 0°C, поларни липиди врсте Sulfolobusacidocaldarius ефикасно су подвргнути соникацији ради формирања археозома. Археозоми са инкапсулираним BMD и конвенционални липозоми, као и липиди археја изоловани из археје H. salinarum и обогаћени фосфатидилхолином, припремљени су техникама соникације. Везикуле за локалну примену добијене су соникацијом MLV дисперзија при амплитуди од 80 процената током 4 минута помоћу соникатора са сондом Hielscher UP50H (видети слику лево).

Литература/референце

• Raquel Martínez-González, Joan Estelrich, Maria Antònia Busquets (2016): Liposomes Loaded with Hydrophobic Iron Oxide Nanoparticles: Suitable T2 Contrast Agents for MRI. International Journal of Molecular Science 2016.
• Zahra Hadian, Mohammad Ali Sahari, Hamid Reza Moghimi; Mohsen Barzegar (2014): Formulation, Characterization and Optimization of Liposomes Containing Eicosapentaenoic and Docosahexaenoic Acids; A Methodology Approach. Iranian Journal of Pharmaceutical Research (2014), 13 (2): 393-404.
• Joanna Kopecka, Giuseppina Salzano, Ivana Campia, Sara Lusa, Dario Ghigo, Giuseppe De Rosa, Chiara Riganti (2014): Insights in the chemical components of liposomes responsible for P-glycoprotein inhibition. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine 2013.
• Pise, Ganesh (2022): Archaeosomes for both cell-based delivery applications and drug-based delivery applications. Journal of Medical Pharmaceutical and Allied Sciences 11, 2022. 4995-5003.