Унапредите HPLC анализу поузданом припремом узорака
Течна хроматографија високих перформанси (HPLC) остаје једна од најважнијих аналитичких техника за идентификацију и квантификацију једињења у сложеним матриксима. Од контроле квалитета у фармацији до праћења стања животне средине и анализе хране, HPLC методе су цењене због своје осетљивости, селективности и репродуктивности. Међутим, поузданост хроматографских података у великој мери зависи од једног кључног корака: припреме узорака за HPLC.
Истраживања и рутински поступци припреме узорака показују да екстракција и припрема узорака потпомогнуте соникацијом значајно побољшавају ефикасност, тачност и брзину HPLC анализе. Применом ултразвучне енергије за разарање матрикса и побољшање преноса аналита у раствараче, лабораторије могу постићи веће приносе, краће време екстракције и репродуктивније аналитичке резултате.
Зашто је припрема узорака важна за HPLC
У многим аналитичким поступцима, матрикс узорка – као што су биљни материјал, биолошко ткиво, земљиште или вода – садржи сложене смеше једињења која могу ометати хроматографско раздвајање. Зато је ефикасна припрема узорака неопходна да би се изоловали аналити, уклониле ометајуће супстанце и концентровала циљна једињења пре убризгавања у HPLC систем.
Традиционалне технике екстракције често подразумевају дуготрајне поступке, велике запремине органских растварача и више корака пречишћавања. Ове методе могу унети варијабилност, повећати оперативне трошкове и продужити укупно време анализе.
Ултразвучна припрема узорака нуди ефикасну алтернативу. Соникацијом се у течну средину уноси акустичка енергија високе фреквенције, при чему настају микроскопски кавитациони мехурићи. Када ови мехурићи колабирају, стварају локализоване силе смицања и ефекте микромешања који разарају чврсте матриксе и убрзавају пренос масе. Овај процес изузетно повећава ефикасност екстракције.
Соникатор UIP400MTP за велики број узорака са сталком за бочице за аутоматски узоркивач
Научни докази: соникација побољшава аналитичке перформансе
Неколико рецензираних студија показало је предности ултразвучне екстракције у аналитичким поступцима који користе HPLC.
На пример, метода развијена за праћење остатака пестицида у узорцима воде користила је соникацију у комбинацији са LC–MS/MS анализом за одређивање концентрација пестицида карбарила. У овом приступу, узорци воде су пре хроматографске анализе екстраховани ацетонитрилом уз ултразвучни третман. Метода је постигла високе аналитичке перформансе, укључујући приносе између 89,53% и 101,72%, што потврђује тачност и поузданост поступка ултразвучне припреме узорака.
Корак ултразвучне екстракције омогућио је ефикасан пренос аналита из воденог матрикса у органски растварач, смањујући потрошњу растварача и елиминишући потребу за опсежним поступцима пречишћавања. Валидирана аналитичка метода показала је одличну линеарност, прецизност и границе квантификације, наглашавајући ефикасност соникације у савременим хроматографским поступцима. (уп. Roudani et al., 2018)
Друга студија увела је ултразвучно потпомогнуту дисперзију матрикса у чврстој фази (UA-MSPD) за одређивање олеуропеина у листовима маслине помоћу HPLC анализе. У овој техници, биљни прах и сорбент помешани су, а затим изложени ултразвучним таласима током корака елуирања. Ултразвук је побољшао десорпцију аналита са површине сорбента, истовремено побољшавајући екстракцију из матрикса узорка. (уп. Rashidipour и Heydari, 2018)
Оптимизовани ултразвучни поступак довео је до значајних аналитичких побољшања, укључујући:
- Линеарне калибрационе криве са R² = 0,9979
- Границе детекције од свега 0,03 µg mL⁻¹
- Приносе између 90,2% и 96,7%
Ови резултати потврђују да ултразвучно потпомогнута екстракција не само да убрзава припрему узорака већ и повећава принос екстракције у поређењу са класичним техникама дисперзије матрикса у чврстој фази.
Соникатор са сондом UP200St за припрему узорака за HPLC
Кључне предности ултразвучне припреме узорака за HPLC
Све шира примена ултразвучне екстракције у аналитичким лабораторијама заснива се на неколико мерљивих предности.
- Већа ефикасност екстракције
Акустична кавитација разара чврсте матрице и побољшава продирање растварача. Тиме се побољшава ослобађање аналита и повећава степен њиховог искоришћења, нарочито код једињења присутних у траговима у сложеним узорцима. - Краће време припреме узорака
Ултразвучна екстракција често омогућава да се припрема узорака заврши за неколико секунди или минута. На пример, оптимизованим параметрима ултразвучне екстракције у поступку UA-MSPD постигнуто је ефикасно издвајање аналита за око 30 секунди соникације, што показује колико се значајно могу убрзати аналитички радни токови. - Мања потрошња растварача
Пошто ултразвук побољшава пренос масе, обично су потребне мање запремине растварача. Смањена употреба растварача побољшава одрживост рада лабораторије и снижава оперативне трошкове. - Побољшана репродуктивност
Равномерна расподела ултразвучне енергије обезбеђује уједначено разарање и екстракцију узорака у репликама, што доводи до веће прецизности аналитичких мерења. - Компатибилност са савременим хроматографским методама
Ултразвучна екстракција се лако интегрише са системима HPLC, UHPLC и LC-MS, што је чини погодном за аналитичка окружења са великим протоком узорака.
HPLC хроматограм фенолних једињења из екстракта листова Annona muricata изолованог ултразвуком помоћу ултразвучног уређаја UP400S.
(Студија и графички приказ: ©Nolasco-González et al., 2022)
Практична решења за соникацију при припреми узорака за HPLC
Лабораторијама које примењују ултразвучну екстракцију, Hielscher соникатори омогућавају прецизну контролу параметара као што су амплитуда, време и пулсни режим рада. Зато су Hielscher лабораторијски соникатори посебно погодни за аналитичке лабораторије.
Изаберите најпогоднији лабораторијски соникатор за своје HPLC узорке
| Модел соникатора | Предности за HPLC | Најпогоднија примена у припреми узорака за HPLC |
| VialTweeter соникатор за више епрувета |
• Истовремена соникација до 10 затворених бочица уз идентичну ултразвучну енергију • Стерилно: Нема унакрсне контаминације јер узорци остају затворени • Високо репродуктивни услови екстракције у различитим серијама • Ефикасна кавитација за аналитичке узорке мале запремине |
• Припрема узорака из животне средине, хране или фармацеутских узорака уз велики проток узорака • Екстракција аналита у траговима пре HPLC, UHPLC или LC-MS анализе • Стандардизовани радни токови који захтевају идентичан третман више узорака |
| Соникатор за микроплоче UIP400MTP |
• Бесконтактна соникација целих микроплоча (формати са 96 и 384 бунарчића) • Равномерна расподела ултразвучне енергије у свим бунарчићима • Омогућава аутоматизацију и интеграцију роботских система у аналитичке радне токове • Велики проток узорака уз прецизну контролу амплитуде и времена соникације |
• Радни токови скрининга методом UHPLC са великим протоком узорака • Библиотеке фармацеутских једињења и припрема узорака за метаболомику • Екстракција у плочама за аналитичке поступке LC-MS или UHPLC |
| Лабораторијски соникатори са микроврхом (директна соникација) |
• Максималан интензитет ултразвука за ефикасно разарање матрице • Веома брза екстракција аналита из чврстих, вискозних или хетерогених узорака • Подесива амплитуда и параметри пулса за оптимизоване услове екстракције • Висока енергија кавитације побољшава степен искоришћења аналита и принос екстракције |
• Екстракција из захтевних матрица као што су биљно ткиво, узорци хране или полимери • Хомогенизација пре SPE, филтрације или екстракције течно–течно • Развој метода за ултразвучну припрему узорака за HPLC |
| CupHorn („купатило високог интензитета“ за лабораторијске чаше и епрувете) |
• Индиректна соникација спречава контаминацију сонде • Равномерно ултразвучно поље за више епрувета истовремено • Идеално за стерилне, опасне или испарљиве узорке који морају остати затворени • Поједностављује руковање уз одржавање високе енергије кавитације |
• Паралелна екстракција више HPLC узорака у затвореним епруветама за центрифугирање • Припрема биолошких, фармацеутских узорака или узорака из животне средине • Радни токови у којима је потребна индиректна соникација без контаминације |
Научни значај за аналитичку хемију
Како се аналитичка хемија усмерава ка бржим и одрживијим лабораторијским праксама, ултразвучна припрема узорака постала је моћна технологија која омогућава тај напредак. Соникација подржава развој брзих аналитичких метода уз мању потрошњу растварача, побољшану ефикасност екстракције и робусне параметре валидације.
Све обимнија литература о ултразвучној екстракцији показује да припрема узорака за HPLC уз помоћ соникације није само практична погодност – то је научно потврђен приступ који побољшава аналитичке перформансе. Комбиновањем ултразвучне екстракције са савременим хроматографским техникама, лабораторије могу постићи поуздану детекцију аналита у траговима у све сложенијим матриксима узорака.
Радни токови HPLC анализе унапређени соникацијом
Уз стални напредак аналитичких инструмената и технологија припреме узорака, ултразвучна екстракција ће вероватно имати још већу улогу у хроматографским лабораторијама. Њена способност да поједностави радне токове, побољша квалитет података и смањи утицај на животну средину добро се уклапа у променљиве захтеве савремене аналитичке науке.
За аналитичке хемичаре и индустријске лабораторије које настоје да оптимизују припрему узорака за HPLC, ултразвучна екстракција нуди проверено, скалабилно и научно утемељено решење. Укључивањем соникације у рутинске протоколе припреме узорака, лабораторије могу значајно побољшати и ефикасност и поузданост хроматографске анализе.
Пројектовање, производња и саветовање – квалитет произведен у Немачкој
Ултразвучни уређаји Hielscher добро су познати по највишим стандардима квалитета и дизајна. Робусност и једноставно руковање омогућавају несметану интеграцију наших ултразвучних уређаја у индустријска постројења. Ултразвучни уређаји Hielscher лако се носе са тешким условима и захтевним окружењима.
Hielscher Ultrasonics је компанија са ISO сертификатом и посебан нагласак ставља на ултразвучне уређаје високих перформанси који се одликују најсавременијом технологијом и једноставношћу употребе. Наравно, ултразвучни уређаји Hielscher усаглашени су са CE захтевима и испуњавају захтеве UL, CSA и RoHs.
Литература / Референце
- M. Rashidipour and R. Heydari (2018): Ultrasonic-Assisted Matrix Solid-Phase Dispersion and High-Performance Liquid Chromatography as an Improved Methodology for Determination of Oleuropein from Olive Leaves. Analytical and Bioanalytical Chemistry Research 52, 2018. 307-316.
- Roudani, A.; Rachid, Mamouni; Nabil, Saffaj; Laknifli, A.; Gharby, Said; Noureddine, El Baraka; Bakka, Abdelhamid; Abdellah, Faouzi (2018): Method validation in the determination of Carbaryl pesticide in water samples using sonication and liquid chromatography-tandem mass spectrometry. JMES 8 (7), 2017. 2409-2420.
- Bimakr M., Ganjloo A., Zarringhalami S., Ansarian E. (2017): Ultrasound-assisted extraction of bioactive compounds from Malva sylvestris leaves and its comparison with agitated bed extraction technique. Food Science and Biotechnology 2017 Nov 30;26(6):1481-1490.
Често постављана питања
Шта је HPLC?
Течна хроматографија високих перформанси (HPLC) је аналитичка техника раздвајања која се користи за идентификацију, квантификацију и пречишћавање компонената у смеши. У HPLC анализи, течна мобилна фаза под високим притиском преноси растворене аналите кроз колону испуњену стационарном фазом. Разлике у интеракцијама између аналита, стационарне фазе и мобилне фазе доводе до раздвајања једињења док се крећу кроз колону. Детектори, као што су UV-Vis, флуоресцентни или масеноспектрометријски детектори, мере раздвојена једињења, омогућавајући прецизну квалитативну и квантитативну анализу.
Које су врсте течне хроматографије?
Течна хроматографија може се класификовати према механизму раздвајања који се остварује између аналита, стационарне фазе и мобилне фазе. Најчешће врсте су реверзнофазна хроматографија, у којој неполарна стационарна фаза раздваја једињења на основу хидрофобних интеракција; нормалнофазна хроматографија, која користи поларну стационарну фазу и раздваја једињења према поларности; јоноизмењивачка хроматографија, у којој наелектрисане стационарне фазе раздвајају аналите на основу јонских интеракција; и хроматографија искључивањем по величини, која раздваја молекуле према њиховој хидродинамичкој величини и молекулској маси. Додатне специјализоване методе обухватају афинитетну хроматографију и хроматографију хидрофилних интеракција (HILIC), које су усмерене на специфичне молекулске интеракције или поларна једињења.
Које се вијале користе за HPLC?
За HPLC анализе обично се користе мале стаклене или полимерне вијале намењене чувању припремљених узорака пре убризгавања у хроматографски систем. Најчешћи формат је вијала за аутоматски узоркивач од 2-mL, која је компатибилна са већином HPLC аутоматских узоркивача. Ове вијале се обично израђују од боросиликатног стакла како би се обезбедиле хемијска отпорност и минимална интеракција са растварачима и аналитима. У зависности од врсте узорка, вијале могу имати уметке за узорке мале запремине, затвараче са навојем или затвараче који се причвршћују кримповањем, као и септуме од материјала као што је PTFE/силикон ради очувања интегритета узорка.
Шта су вијале за аутоматске узоркиваче?
Вијале за аутоматске узоркиваче су специјализоване посуде за узорке намењене системима за аутоматско убризгавање у HPLC и UHPLC инструментима. Оне садрже припремљени раствор узорка и постављају се у носач аутоматског узоркивача инструмента, одакле систем аутоматски извлачи дефинисану запремину ради убризгавања у хроматографску колону. Вијале за аутоматске узоркиваче израђују се са прецизним димензијама како би се обезбедила компатибилност са роботским иглама за узорковање и свели на минимум испаравање, контаминација или адсорпција узорка. Њихова конструкција омогућава репродуктивну анализу великог броја узорака у савременим хроматографским лабораторијама.
Који су кораци у HPLC анализи?
Типичан ток рада у течној хроматографији високих перформанси (HPLC) састоји се од неколико узастопних корака који обезбеђују поуздано раздвајање и детекцију аналита.
- Прво се обавља припрема узорка ради растварања аналита, уклањања честица и, често, екстракције или концентрисања циљних једињења из матрице узорка. Овај корак може обухватати филтрацију, разблаживање или технике екстракције као што су ултразвучна екстракција, екстракција на чврстој фази или екстракција течно–течно.
- Затим се припремљени узорак ставља у HPLC вијалу и поставља у аутоматски узоркивач. Аутоматски узоркивач убризгава прецизну запремину узорка у мобилну фазу која протиче.
- У фази довода мобилне фазе, убризгани узорак се затим преноси кроз систем помоћу пумпе високог притиска. Мобилна фаза носи аналите кроз хроматографску колону при контролисаном протоку.
- Раздвајање се одвија унутар хроматографске колоне. Колона садржи стационарну фазу, обично у виду пакованих честица са дефинисаним хемијским својствима. Док аналити пролазе кроз колону, различито ступају у интеракцију са стационарном и мобилном фазом, због чега се елуирају у различитим временима.
- Након раздвајања, једињења пролазе кроз детектор, као што је UV-Vis детектор, флуоресцентни детектор или детектор за масену спектрометрију. Детектор мери присуство и концентрацију једињења која се елуирају и претвара сигнал у електронске податке.
- На крају се прикупљање и анализа података обављају помоћу софтвера за хроматографију. Систем генерише хроматограм у ком пикови одговарају појединачним једињењима. Ретенциона времена пикова помажу у идентификацији аналита, док површине или висине пикова омогућавају квантитативно одређивање њихове концентрације.
Hielscher Ultrasonics производи ултразвучне хомогенизаторе високих перформанси од лабораторијских до индустријских размера.