Ultrazvuková izolácia kmeňových buniek
Sonikácia je vysoko účinná mechanická metóda izolácie kmeňových buniek z ľudského tukového tkaniva. Ultrazvukom izolovaná stromálna vaskulárna frakcia (SVF) vykazuje významný regeneračný potenciál pre medicínske aplikácie. Hielscher Ultrasonics ponúka celý rad možností priamej a nepriamej sonikácie na získavanie kmeňových buniek. Nájdite ideálny sonikátor pre svoj proces izolácie kmeňových buniek!
Ultrazvuková izolácia kmeňových buniek
Tukové tkanivo odobraté z ľudského tela (liposukciou) sa ošetruje ultrazvukom, aby sa tkanivo oddelilo od kmeňových buniek a ďalších rastových buniek. Táto oddelená časť buniek je známa ako bunky stromálnej vaskulárnej frakcie (SVF).
Technika ultrazvukovej izolácie kmeňových buniek z tukového tkaniva je založená výlučne na princípe pôsobenia kavitácie vyvolanej ultrazvukom, pri ktorej ide o čisto mechanický šmyk. Tieto kavitačné šmykové sily narúšajú tukové tkanivo, takže sa kmeňové bunky uvoľňujú zo štruktúry tukového tkaniva. Ultrazvuková izolácia kmeňových buniek je postup bez použitia enzýmov, pri ktorom sa nepoužíva kolagenáza, trypsín ani dispáza.
Na oddelenie extrahovaných kmeňových buniek, mezenchýmových kmeňových buniek, endotelových prekurzorov a ďalších typov rastových buniek sa sonikované tukové tkanivo centrifuguje.
Oddelené kmeňové bunky sa zozbierajú a analyzuje sa ich kvalita vrátane počtu buniek, životaschopnosti, endotoxínu a farbenia podľa Grama pred tým, ako sa okamžite použijú na autológnu transplantáciu alebo sa uchovajú kryogénnym skladovaním.
Prečo sa vyhýbať enzýmom?
Keďže enzymatické štiepenie pri izolácii kmeňových buniek sprevádzajú vysoké náklady a možné bezpečnostné riziká, ako aj nedostatočná účinnosť [Oberbauer et al. 2015], uprednostňujú sa neenzymatické metódy izolácie, ako je ultrazvuková kavitácia. Krok ultrazvukovej izolácie nahrádza enzymatické štiepenie mechanickým oddelením buniek a bunkových agregátov od tukového tkaniva.
GDmini2 na ultrazvukovom meniči UP200St-TD (200 wattov)
- Rýchla
- Účinná
- Reprodukovateľná
- Bezpečná
- Bez enzýmov
- Nákladovo efektívna
- Sterilné možnosti
Kmeňové bunky pochádzajúce z tukového tkaniva
Výťažok kmeňových buniek získaný sonikáciou
Publikovaná metóda izolácie stromálnej vaskulárnej frakcie pomocou ultrazvukovej kavitácie poskytuje výťažok 1,67–2,24 × 107 buniek so životaschopnosťou 97,1–98,9% [Victor, S., 2014]. Ultrazvukovou lýzou zrelých adipocytov v disociovanom tukovom tkanive sa dosiahli výťažky približne 2–4 milióny buniek/gram tukového tkaniva [Bright et al., 2014].
Bunky pripravené ultrazvukom majú rovnako vysoký potenciál adipogénnej a osteogénnej diferenciácie ako bunky získané štandardnou enzymatickou metódou izolácie [Oberbauer et al. 2015].
Ultrazvukové systémy na izoláciu kmeňových buniek
Na zaistenie najvyššej bezpečnosti a najlepšej kvality je kľúčovým faktorom úspešnej liečby pacientov spoľahlivé ultrazvukové zariadenie, ktoré umožňuje presné riadenie spracovania kmeňových buniek. Hielscher Ultrasonics ponúka rôzne možnosti autológneho separačného procesu pomocou ultrazvukovej kavitácie na izoláciu a získavanie kmeňových buniek a endotelových prekurzorových buniek.
Priama sonikácia na izoláciu kmeňových buniek
Pri procese izolácie kmeňových buniek priamou sonikáciou sa ultrazvukový nadstavec (sonotróda, ultrazvukový hrot / sonda) ponorí do tukového tkaniva. Prostredníctvom sonotródy sa ultrazvukové vlny prenášajú priamo do autológneho tuku, takže ultrazvuková kavitácia uvoľňuje kmeňové bunky a stromálne bunky zo zvyškového tkaniva. Sonikátory Hielscher UP200Ht a UP200St so sonotródou S26d14 sú bežne používané systémy na spracovanie autológnych kmeňových buniek. Izolácia stromálnej vaskulárnej frakcie priamou sonikáciou je vhodná najmä na použitie v čistých priestoroch.
Nepriama sonikácia na izoláciu kmeňových buniek
Keďže sa kmeňové bunky používajú na autológne aplikácie, sterilita procesu je veľmi dôležitá. Preto spoločnosť Hielscher vyvinula niekoľko možností nepriamej sonikácie, ako sú GDmini2, VialTweeter a ďalšie systémy prispôsobené individuálnym požiadavkám. Pri nepriamej sonikácii sa ultrazvukové vlny prenášajú cez stenu nádoby do tukového tkaniva. Stromálna vaskulárna frakcia (SVF) sa oddeľuje od tukového tkaniva ultrazvukovou kavitáciou rovnako ako pri priamej sonikácii.
Nepriama sonikácia ponúka výhodu spracovania buniek v uzavretej nádobe za podmienok bez kontaminácie keďže sa eliminuje riziko krížovej kontaminácie pri zavádzaní ultrazvukového rohu (sonotródy). Izolácia buniek sa vykonáva v uzavretom systéme, ktorý zabezpečuje sterilné procesné podmienky.
Prečítajte si viac o sterilných sonikátoroch Hielscher!
Digitálne sonikátory Hielscher možno presne ovládať prostredníctvom dotykového displeja alebo webového prehliadača. Postupy sonikácie možno vopred nastaviť prostredníctvom intuitívneho menu. Ultrazvukové zariadenia sú vybavené automatickým zaznamenávaním údajov (všetky údaje o procese sonikácie sa ukladajú na integrovanú SD kartu). Privádzaný ultrazvukový výkon možno presne prispôsobiť protokolu izolácie buniek.
Sonikátor VialTweeter je sterilný homogenizátor na rovnomernú a rýchlu sterilnú prípravu vzoriek.
Literatúra/Referencie
- Oberbauer, Eleni; Steffenhagen, Carolin; Wurzer, Christoph; Gabriel, Christian; Redl, Heinz; Wolbank, Susanne (2015): Enzymatic and non-enzymatic isolation systems for adipose tissue-derived cells: current state of the art. Cell Regeneration (2015) 4:7.
- Stadlmann, J., Taubenschmid, J., Wenzel, D. et al. (2017): Comparative glycoproteomics of stem cells identifies new players in ricin toxicity. Nature 549, 2017. 538–542
- Haghjoo M., Azarbayjani M.A., Peeri M., Hosseini S.A. (2019): Effect of Training, Hyaluronic Acid, and Mesenchymal Stem Cell Therapies on Osteocalcin Gene Expression in Cartilage Tissue of Rats with Knee Osteoarthritis. Gene Cell Tissue 6, 2019.
- Zhu M., Kong D., Tian R., Pang M. , Mo M., Cheng, Y., Yang G., Cheng H.L., Lei X., Fang K., Cheng B., Wu Y. (2020): Platelet sonicates activate hair follicle stem cells and mediate enhanced hair follicle regeneration. Journal of Cellular and Molecular Medicine 24, 2020. 1786–1794.
Užitočné informácie
Čo sú kmeňové bunky?
Kmeňové bunky sú nediferencované bunky mnohobunkového organizmu, ktoré majú schopnosť neobmedzene vytvárať ďalšie bunky rovnakého typu. Vyznačujú sa pozoruhodným potenciálom vyvíjať sa na mnoho rôznych typov buniek v tele v ranom štádiu života a rastu. Najvýraznejšou vlastnosťou kmeňových buniek je ich schopnosť obnovovať sa bunkovým delením a premieňať sa na bunky špecifické pre tkanivá alebo orgány s osobitnými funkciami. Pluripotentné kmeňové bunky majú potenciál diferencovať sa na ktorúkoľvek z troch zárodočných buniek: endoderm (vnútorná výstelka žalúdka, gastrointestinálny trakt, pľúca), mezoderm (svaly, kosti, krv, urogenitálny systém) alebo ektoderm (epidermálne tkanivá a nervový systém).
V niektorých orgánoch, ako sú črevo a kostná dreň, sa kmeňové bunky pravidelne delia, aby opravovali a nahrádzali opotrebované alebo poškodené tkanivá. V iných orgánoch, ako sú pankreas a srdce, sa kmeňové bunky delia iba za osobitných podmienok.
Mezenchýmové stromálne/kmeňové bunky (MSC), ktoré ponúkajú vysoký potenciál na rozmanité terapeutické využitie v regeneratívnej a estetickej medicíne, sa nachádzajú najmä v kostnej dreni, možno ich však izolovať aj z iných tkanív (napr. chrupavky, tuku, svalových buniek). Mezenchýmové kmeňové bunky sa považujú za prototypické dospelé kmeňové bunky, ktoré sa vyznačujú schopnosťou sebaobnovy.
Výskum kmeňových buniek a liečebné postupy s ich využitím sa používajú na kultiváciu tkanív a orgánov na transplantačné účely (tkanivové inžinierstvo). Medzi ďalšie medicínske oblasti využitia kmeňových buniek patrí liečba ochorení mozgu (napr. Parkinsonovej a Alzheimerovej choroby), liečba nedostatku buniek, ochorení krvi (napr. leukémie), degenerácie kĺbov a chrupaviek (napr. osteoartrózy), ako aj kozmetické ošetrenia (napr. ošetrenia proti starnutiu). Kmeňové bunky majú vo všeobecnosti priemer približne 15–25 mikrometrov.
Mezenchýmové kmeňové bunky (MSC) sú multipotentné stromálne bunky, ktoré majú schopnosť diferencovať sa na rôzne typy buniek vrátane osteoblastov (kostných buniek), chondrocytov (buniek chrupavky), myocytov (svalových buniek) a adipocytov (tukových buniek).
Čo je stromálna vaskulárna frakcia (SVF)?
Stromálna vaskulárna frakcia (SVF) je zložkou lipoaspirátu, ktorý možno získať liposukciou z tukového tkaniva v ľudskom tele. Lipoaspirát pozostáva z heterogénnej zmesi buniek a má vysoký obsah kmeňových buniek, známych ako kmeňové bunky pochádzajúce z tukového tkaniva (ASC alebo ADSC), ktoré vykazujú podobnosti s kmeňovými bunkami kostnej drene, napríklad schopnosť diferencovať sa na bunky viacerých línií.
Heterogénna populácia stromálnej vaskulárnej frakcie zahŕňa okrem iného endotelové bunky, erytrocyty, fibroblasty, lymfocyty, monocyty/ makrofágy a pericyty, ako aj významný podiel kmeňových buniek pochádzajúcich z tukového tkaniva.
Čo sú stromálne/kmeňové bunky pochádzajúce z tukového tkaniva (ASC)?
Stromálne/kmeňové bunky pochádzajúce z tukového tkaniva (ASC / ADSC) uvoľňujú vysoké množstvá bioaktívnych rastových faktorov, ako sú epidermálny rastový faktor (EGF), vaskulárny endotelový rastový faktor (VEGF), bázický fibroblastový rastový faktor (bFGF), rastový faktor keratinocytov (KGF), rastový faktor odvodený od krvných doštičiek (PDGF), rastový faktor hepatocytov (HGF), transformujúci rastový faktor beta (TGF-β), inzulínový rastový faktor (IGF) a neurotrofický faktor odvodený z mozgu (BDNF). ACS nielen uvoľňujú rastové faktory, ale secernujú aj cytokíny vrátane ligandu tyrozínkinázy 3 príbuznej fms (Flt-3), faktora stimulujúceho kolónie granulocytov (G-CSF), faktora stimulujúceho kolónie granulocytov a makrofágov (GM-CSF), faktora stimulujúceho kolónie makrofágov (M-CSF), interleukínov (IL), ako sú IL-6, IL-7, IL-8, IL-11 a IL-12, faktora inhibujúceho leukémiu (LIF) a faktora nekrózy nádorov alfa (TNF-α).
Ako sa získavajú kmeňové bunky?
Autológne dospelé kmeňové bunky človeka možno získať z nasledujúcich zdrojov:
- Kostná dreň, ktorá si vyžaduje získanie buniek odberom, teda vŕtaním do kosti.
- Tukové tkanivo (tukové bunky), ktoré si vyžaduje získanie buniek liposukciou.
- Krv, ktorá si vyžaduje získanie buniek aferézou, pri ktorej krv darcu prechádza cez „dialyzačný“ prístroj, kde sa odoberajú kmeňové bunky, zatiaľ čo ostatné zložky krvi sa vracajú späť darcovi.