Ultrazvuková izolácia kmeňových buniek
- Ultrazvuková kavitácia je vysoko účinná mechanická metóda na izoláciu kmeňových buniek z ľudského tukového tkaniva.
- Ultrazvukovo izolovaná stromálna vaskulárna frakcia (SVF) vykazuje vysoký regeneračný potenciál pre lekárske aplikácie.
- Hielscher Ultrasonics ponúka rôzne možnosti priamej a nepriamej sonikácie na zber kmeňových buniek.
Ultrazvuková izolácia kmeňových buniek
Z ľudského tela sa extrahované tukové tkanivo (liposukciou) lieči ultrazvukom, aby sa odstránilo tkanivo z kmeňových buniek a iných rastových buniek. Táto oddelená časť buniek je známa ako bunky stromálnej vaskulárnej frakcie (SVF).
Technika ultrazvukovej izolácie kmeňových buniek z tukového tkaniva je založená výlučne na princípe fungovania ultrazvukovej kavitacie, ktorou je mechanický strih. Kavitačné šmykové sily narúšajú tukové tkanivo, takže kmeňové bunky sa uvoľňujú zo štruktúry tukového tkaniva. Ultrazvuková izolácia kmeňových buniek je postup bez enzýmov, ktorý zabraňuje použitiu kolagenázy, trypsínu alebo dispase.
Na oddelenie extrahovaných kmeňových buniek, mezenchymálnych kmeňových buniek, endotelových prekurzorov a iných typov rastových buniek sa sonifikované tukové tkanivo odstredí.
Oddelené kmeňové bunky sa odoberú a analyzujú z hľadiska ich kvality vrátane počtu buniek, životaschopnosti, endotoxínu a farbenia podľa Grama pred okamžitým použitím na autológnu transplantáciu alebo sa konzervujú v kryoskladovaní.
Prečo sa vyhýbať enzýmom?
Keďže enzymatické trávenie na izoláciu kmeňových buniek je sprevádzané vysokými nákladmi a možnými bezpečnostnými rizikami, ako aj nedostatočnou účinnosťou [Oberbauer et al. 2015], uprednostňujú sa neenzymatické izolačné metódy, ako je ultrazvuková kavitácia. Krok ultrazvukovej izolácie nahrádza enzymatické trávenie mechanickým oddelením buniek a bunkových agregátov od tukového tkaniva.
GDmini2 pri prevodníku UP200St-TD (200 wattov)
- Rýchly
- Účinný
- Reprodukovateľné
- Bezpečný
- Bez enzýmov
- Nákladovo efektívne
- Sterilné možnosti
Kmeňové bunky odvodené z tuku
Výťažok kmeňových buniek
Publikovaná metóda izolácie SVF využívajúca ultrazvukový kavitačný výťažok v 1,67–2,24 × 107 bunky so životaschopnosťou 97,1–98,9 % [Victor, S., 2014]. Bunkové výťažky asi 2–4 milióny buniek/gram tukového tkaniva sa získali ultrazvukovou lýzou zrelých adipocytov v disociovanom tukovom tkanive [Bright et al., 2014].
Ultrazvukovo pripravené bunky majú rovnako vysoký adipogénny a osteogénny diferenciačný potenciál v porovnaní so štandardnou metódou enzymatickej izolácie [Oberbauer et al. 2015].
Ultrazvukové systémy na izoláciu kmeňových buniek
Pre zaistenie najvyššej bezpečnosti a najvyššej kvality je spoľahlivé ultrazvukové zariadenie, ktoré umožňuje presnú kontrolu nad liečbou kmeňovými bunkami, kľúčovým faktorom úspešnej liečby pacientov. Spoločnosť Hielscher Ultrasonics ponúka rôzne možnosti pre autológny ultrazvukový kavitačný separačný proces na izoláciu a zber kmeňových a endotelových prekurzorových buniek.
Priama sonikacia
Pre proces izolácie kmeňových buniek priamou sonikáciou je ultrazvukový roh (sonotróda, ultrazvukový hrot / sonda) ponorený do tukového tkaniva. Prostredníctvom sonotrody sa ultrazvukové vlny spájajú priamo do autológneho tuku, takže ultrazvuková kavitácia uvoľňuje kmeňové bunky a stromálne bunky zo zvyškového tkaniva. Ultrazvukové procesory Hielscher UP200Ht a UP200St so sonotródou S26d14 sú bežne používané systémy na liečbu autológnymi kmeňovými bunkami. Izolácia SVF priamou sonikáciou je väčšinou vhodná na použitie v čistých priestoroch.
nepriama sonikacia
Keďže kmeňové bunky sa používajú na autológne aplikácie, sterilita procesu je veľmi dôležitá. Preto Hielscher vyvinul niekoľko možností nepriamej sonikácie, ako napr GDmini2, VialTweeter a ďalšie prispôsobené systémy. Nepriamou sonikáciou sa ultrazvukové vlny spájajú cez nástennú nádobu do tukového tkaniva. Stromálna vaskulárna frakcia (SVF) je disociovaná z tukového tkaniva ultrazvukovou kavitáciou rovnako ako pri priamej sonikácii.
Proces nepriamej sonikácie ponúka výhodu pri spracovaní buniek v uzavretej nádobe pod Podmienky bez kontaminácie pretože riziko krížovej kontaminácie vložením ultrazvukového klaksónu (Sonotrode) je vylúčené. Izolácia buniek sa vykonáva v uzavretom systéme, ktorý zabezpečuje sterilné procesné podmienky.
Digitálne ultrazvukové zariadenia Hielscher je možné presne ovládať pomocou dotykového displeja alebo ovládania prehliadačom. Ultrazvukové postupy je možné prednastaviť prostredníctvom intuitívneho menu. Ultrazvukové prístroje sú vybavené automatickým záznamom údajov (všetky údaje o procese sonikácie sú uložené na integrovanej SD karte). Ultrazvukový príkon je možné presne nastaviť podľa protokolu izolácie buniek.
Literatúra/Referencie
- Oberbauer, Eleni; Steffenhagen, Karolína; Wurzer, Christoph; Gabriel, kresťan; Redl, Heinz; Wolbank, Susanne (2015): Enzymatické a neenzymatické izolačné systémy pre bunky odvodené z tukového tkaniva: súčasný stav techniky. Regenerácia buniek (2015) 4:7.
Fakty, ktoré stoja za to vedieť
kmeňové bunky
Kmeňové bunky sú nediferencované bunky mnohobunkového organizmu, ktoré majú schopnosť produkovať donekonečna viac buniek rovnakého typu. Vyznačujú sa pozoruhodným potenciálom vyvinúť sa do mnohých rôznych typov buniek v tele počas raného stavu života a rastu. Najvýraznejším znakom kmeňových buniek je ich schopnosť obnoviť sa delením buniek a ich schopnosť premeniť sa na bunky špecifické pre tkanivá alebo orgány so špeciálnymi funkciami. Pluripotentné kmeňové bunky majú potenciál diferencovať sa na ktorúkoľvek z troch zárodočných buniek: endoderm (vnútorná sliznica žalúdka, gastrointestinálny trakt, pľúca), mezoderm (svaly, kosti, krv, urogenitálny) alebo ektoderm (epidermálne tkanivá a nervový systém).
V niektorých orgánoch, ako je črevo a kostná dreň, sa kmeňové bunky pravidelne delia, aby opravili a nahradili opotrebované alebo poškodené tkanivá. V iných orgánoch, ako je pankreas a srdce, sa kmeňové bunky delia iba za špeciálnych podmienok.
Mezenchymálne stromálne/kmeňové bunky (MSC), ktoré ponúkajú vysoký potenciál pre rozmanité terapeutické aplikácie v regeneratívnej a estetickej medicíne, sa nachádzajú najmä v kostnej dreni, ale môžu byť izolované aj z iných tkanív (napr. chrupavky, tuku, svalových buniek). Mezenchymálne kmeňové bunky sa považujú za prototypy dospelých kmeňových buniek, ktoré sa vyznačujú schopnosťou samoobnovy.
Výskum a liečba kmeňových buniek sa používajú na kultiváciu tkanív a orgánov na transplantačné účely (tkanivové inžinierstvo). Ďalšie lekárske oblasti aplikácie kmeňových buniek možno nájsť v liečbe ochorení mozgu (napr. Parkinsonova a Alzheimerova choroba), liečbe nedostatku buniek, ochorení krvi (napr. leukémia), degenerácie kĺbov a chrupaviek (napr. osteoartróza), ako aj kozmetických ošetreniach (napr. liečba proti starnutiu). Kmeňové bunky majú vo všeobecnosti veľkosť cca. 15-25 mikrónov v priemere.
mezenchymálne kmeňové bunky (MSC) sú multipotentné stromálne bunky, ktoré majú schopnosť diferencovať sa na rôzne typy buniek, vrátane osteoblastov (kostné bunky), chondrocytov (chrupavkových buniek), myocytov (svalových buniek) a adipocytov (tukových buniek).
Stromálna vaskulárna frakcia (SVF)
Stromálna vaskulárna frakcia (SVF) je zložka lipoaspirátu, ktorú je možné extrahovať liposukciou z tukového tkaniva v ľudskom tele. Lipoaspirát pozostáva z heterogénnej zmesi buniek a má vysoký obsah kmeňových buniek, známych ako kmeňové bunky odvodené z tuku (ASC alebo ADSC), ktoré vykazujú podobnosti s kmeňovými bunkami kostnej drene, ako je ich schopnosť diferencovať sa na viaclíniové bunky.
Heterogénna populácia SVF zahŕňa okrem iného endotelové bunky, erytrocyty, fibroblasty, lymfocyty, monocyty/makrofágy a pericyty, ako aj dôležitú časť kmeňových buniek odvodených od tuku.
Stromálne/kmeňové bunky odvodené z tuku (ASC)
Stromálne/kmeňové bunky odvodené od tuku (ASC / ADSC) uvoľňujú vysoké hladiny bioaktívnych rastových faktorov, ako je epidermálny rastový faktor (EGF), vaskulárny endoteliálny rastový faktor (VEGF), základný fibroblastový rastový faktor (bFGF), keratinocytový rastový faktor (KGF), krvné doštičky (PDGF), hepatocytový rastový faktor (HGF), transformačný rastový faktor-beta (TGF-β), inzulínový rastový faktor (IGF) a neurotrofický faktor odvodený od mozgu (BDNF). ACS nielenže uvoľňuje rastové faktory, ale tiež vylučuje cytokíny vrátane ligandu tyrozínkinázy 3 (Flt-3) súvisiaceho s FMS, faktora stimulujúceho kolónie granulocytov (G-CSF), faktora stimulujúceho kolónie makrofágov granulocytov (GM-CSF), faktora stimulujúceho kolónie makrofágov (M-CSF), interleukínu (IL) ako IL-6, IL-7, IL-8, IL-11 a IL-12, inhibičného faktora leukémie (LIF) a faktora nekrózy nádoru-alfa (TNF-α).
Extrakcia typov kmeňových buniek
Autológne dospelé kmeňové bunky z ľudí je možné extrahovať z nasledujúcich zdrojov:
- Kostná dreň, ktorá vyžaduje extrakciu zberom, to znamená vŕtaním do kosti.
- Tukové tkanivo (lipidové bunky), ktoré si vyžaduje extrakciu liposukciou.
- Krv, ktorá si vyžaduje extrakciu aferézou, pri ktorej krv od darcu prechádza cez “dialýza” prístroj, kde sa kmeňové bunky extrahujú, zatiaľ čo ostatné zložky krvi sa vracajú späť darcovi.