Ultrazvuková deacetylácia chitínu na chitozán
Ultrazvuková výroba chitozánu
Chitozán sa získava N-deacetyláciou chitínu. Pri konvenčnej deacetylácii sa chitín namáča vo vodných alkalických rozpúšťadlách (zvyčajne 40 až 50% (w/w) NaOH). Proces namáčania vyžaduje vysoké teploty 100 až 120ºC a je veľmi časovo náročný, pričom výťažok chitozánu získaného v jednom kroku namáčania je nízky. Použitie vysokovýkonného ultrazvuku výrazne zintenzívňuje proces deacetylácie chitínu a pri rýchlom spracovaní pri nižšej teplote vedie k vysokému výťažku chitozánu s nízkou molekulovou hmotnosťou. Ultrazvukovou deacetyláciou vzniká chitozán vynikajúcej kvality, ktorý sa používa ako potravinárska a farmaceutická zložka, ako hnojivo a v mnohých ďalších priemyselných aplikáciách.
Ultrazvukové spracovanie vedie k výnimočnému stupňu acetylácie (DA) chitínu, pričom znižuje stupeň acetylácie z chitínu s DA≥90 na chitozán s DA≤10.
Mnohé výskumné štúdie potvrdzujú účinnosť ultrazvukovej deacetylácie chitínu na chitozán. Weiss J. a kol. (2008) zistili, že sonikácia výrazne zlepšuje premenu chitínu na chitozán. Ultrazvukové spracovanie chitínu prináša výraznú úsporu času, pretože skracuje potrebný čas procesu z 12–24 hodín na niekoľko hodín. Okrem toho sa na dosiahnutie úplnej premeny vyžaduje menej rozpúšťadla, čím sa znižuje environmentálny vplyv vyraďovania a likvidácie použitého alebo nezreagovaného rozpúšťadla, t. j. koncentrovaného NaOH.
Sonikácia podporuje deacetyláciu chitínu na chitozán
UIP4000hdT – ultrazvukový systém s výkonom 4kW
Princíp ultrazvukového spracovania chitozánu
Vysokovýkonná nízkofrekvenčná sonikácia (∼20–26kHz) vytvára akustickú kavitáciu v kvapalinách a suspenziách. Vysokovýkonný ultrazvuk podporuje premenu chitínu na chitozán, pretože rozpúšťadlo (napr. NaOH) rozrušuje pevné častice chitínu a preniká do nich, čím zväčšuje povrch a zlepšuje prenos hmoty medzi pevnou a kvapalnou fázou. Vysoké šmykové sily ultrazvukovej kavitácie navyše vytvárajú voľné radikály, ktoré zvyšujú reaktivitu činidla (t. j. NaOH) počas hydrolýzy. Sonikácia ako netepelná technika spracovania zabraňuje tepelnej degradácii a vedie k vzniku vysokokvalitného chitozánu. Ultrazvuk skracuje čas spracovania potrebný na extrakciu chitínu z kôrovcov a zároveň poskytuje chitín (a teda následne aj chitozán) s vyššou čistotou v porovnaní s tradičnými podmienkami spracovania. Pri výrobe chitínu a chitozánu má teda ultrazvuk potenciál znížiť výrobné náklady, skrátiť čas spracovania, umožniť lepšie riadenie výrobného procesu a znížiť environmentálny vplyv odpadu z procesu.
- Vyšší výťažok chitozánu
- Vynikajúca kvalita
- Kratší čas
- Nižšia procesná teplota
- Zvýšená účinnosť
- Jednoduchá a bezpečná obsluha
- Šetrnosť k životnému prostrediu
Ultrazvuková deacetylácia chitínu na chitozán – protokol
1) Pripravte chitín:
Ak sa ako východiskový materiál používajú krabie panciere, mali by sa dôkladne umyť, aby sa odstránili všetky rozpustné organické látky a priľnuté nečistoty vrátane pôdy a bielkovín. Následne sa materiál pancierov musí úplne vysušiť (napr. pri 60ºC počas 24h v sušiarni). Vysušené panciere sa potom pomelú (napr. pomocou kladivového mlyna), deproteinizujú v alkalickom prostredí (napr. NaOH s koncentráciou 0,125 až 5,0 M) a demineralizujú v kyseline (napr. zriedenej kyseline chlorovodíkovej).
2) Ultrazvuková deacetylácia
Na uskutočnenie typickej ultrazvukovej deacetylačnej reakcie sa častice beta-chitínu (0,125 mm < d < 0,250 mm) suspendujú v 40% (w/w) vodnom roztoku NaOH v pomere beta-chitínu k vodnému roztoku NaOH 1/10(g mL-1), suspenzia sa prenesie do dvojstennej sklenenej kadičky a sonikuje sa pomocou ultrazvukového homogenizátora Hielscher UP400St . Pri ultrazvukovej deacetylácii chitínu sa udržiavajú konštantné nasledujúce parametre (porov. Fiamingo et al. 2016): (i) ultrazvuková sonda (sonotróda Hielscher S24d22D, priemer hrotu = 22 mm); (ii) pulzný režim sonikácie (IP = 0,5sec); (iii) intenzita ultrazvuku na povrchu sondy
(I = 52,6 W cm-2), (iv) reakčná teplota (60ºC ±1ºC), (v) reakčný čas (50 min), (vi) pomer hmotnosti beta-chitínu k objemu 40% (w/w) vodného roztoku hydroxidu sodného (BCHt/NaOH = 1/10 g mL-1); (vii) objem suspenzie beta-chitínu (50mL).
Prvá reakcia prebieha 50min za neustáleho magnetického miešania a následne sa preruší rýchlym ochladením suspenzie na 0ºC. Potom sa pridá zriedená kyselina chlorovodíková na dosiahnutie pH 8,5 a vzorka CHs1 sa izoluje filtráciou, dôkladne sa premyje deionizovanou vodou a vysuší sa pri podmienkach okolitého prostredia. Keď sa rovnaká ultrazvuková deacetylácia zopakuje ako druhý krok so vzorkou CHs1, vznikne vzorka CHs2.
Snímky zo skenovacej elektrónovej mikroskopie (SEM) pri 100× zväčšení: a) gladius, b) gladius ošetrený ultrazvukom, c) β-chitín, d) β-chitín ošetrený ultrazvukom a e) chitosan (zdroj: Preto et al. 2017)
Fiamingo et al. zistili, že ultrazvukovou deacetyláciou beta-chitínu sa účinne získava chitosan s vysokou molekulovou hmotnosťou a nízkym stupňom acetylácie bez použitia prísad, inertnej atmosféry či dlhých reakčných časov. A to aj napriek tomu, že reakcia ultrazvukovej deacetylácie prebieha za miernejších podmienok – t. j. pri nízkej reakčnej teplote v porovnaní s väčšinou termochemických deacetylácií. Ultrazvuková deacetylácia beta-chitínu umožňuje prípravu náhodne deacetylovaného chitosanu s premenlivým stupňom acetylácie (4% ≤ DA ≤ 37%), vysokou hmotnostne priemernou molekulovou hmotnosťou (900 000 g mol-1 ≤ Mw ≤ 1 200 000 g mol-1 ) a nízkou disperzitou (1,3 ≤ Ð ≤ 1,4) uskutočnením troch po sebe nasledujúcich reakcií (50 min/krok) pri 60ºC.
Vysokovýkonné ultrazvukové procesory od laboratórnej cez poloprevádzkovú až po priemyselnú mierku.
Vysokovýkonné ultrazvukové systémy na výrobu chitosanu
Fragmentácia chitínu a deacetylácia chitínu na chitosan si vyžadujú výkonné a spoľahlivé ultrazvukové zariadenia, ktoré dokážu dosahovať vysoké amplitúdy, umožňujú presné riadenie procesných parametrov a možno ich prevádzkovať 24/7 pri vysokom zaťažení a v náročnom prostredí. Sortiment výrobkov Hielscher Ultrasonics pokrýva vaše potreby aj požiadavky vášho procesu. Ultrazvukové prístroje Hielscher sú vysokovýkonné systémy, ktoré možno vybaviť príslušenstvom, ako sú sonotródy, zosilňovače amplitúdy, reaktory alebo prietokové cely, aby optimálne zodpovedali potrebám vášho procesu.
Digitálny farebný displej, možnosť vopred nastaviť sonikačné cykly, automatické zaznamenávanie údajov na integrovanú SD kartu, diaľkové ovládanie cez prehliadač a mnohé ďalšie funkcie zaručujú najvyššiu úroveň riadenia procesu a používateľskej prívetivosti. V spojení s robustnosťou a schopnosťou znášať vysoké zaťaženie sú ultrazvukové systémy Hielscher vaším spoľahlivým pomocníkom vo výrobe.
Fragmentácia a deacetylácia chitínu si vyžadujú výkonný ultrazvuk na dosiahnutie požadovanej konverzie a vysokokvalitného konečného produktu – chitosanu. Najmä pri fragmentácii chitínových vločiek sú rozhodujúce vysoké amplitúdy a zvýšené tlaky. Priemyselné ultrazvukové procesory Hielscher Ultrasonics ľahko dosahujú veľmi vysoké amplitúdy. Amplitúdy až do 200µm možno nepretržite udržiavať pri prevádzke 24/7. Pre ešte vyššie amplitúdy sú k dispozícii ultrazvukové sonotródy vyrobené na mieru. Výkonová kapacita ultrazvukových systémov Hielscher umožňuje účinnú a rýchlu deacetyláciu v bezpečnom a používateľsky prívetivom procese.
Nasledujúca tabuľka poskytuje orientačné údaje o približnej spracovateľskej kapacite našich ultrazvukových prístrojov:
| Objem dávky | Prietok | Odporúčané prístroje |
|---|---|---|
| 1 až 500mL | 10 až 200mL/min | UP100H |
| 10 až 2000mL | 20 až 400mL/min | UP200Ht, UP400St |
| 0,1 až 20L | 0,2 až 4L/min | UIP2000hdT |
| 10 až 100L | 2 až 10L/min | UIP4000hdT |
| n.a. | 10 až 100L/min | UIP16000 |
| n.a. | vyšší | zoskupenie zariadení UIP16000 |
Kontaktujte nás! / Opýtajte sa nás!
Literatúra / referencie
- Butnaru E., Stoleru E., Brebu M.A., Darie-Nita R.N., Bargan A., Vasile C. (2019): Bionanokompozitné fólie na báze chitozánu pripravené emulznou technikou na konzervovanie potravín. Materials 2019, 12(3), 373.
- Fiamingo A., de Moura Delezuk J.A., Trombotto St. David L., Campana-Filho S.P. (2016): Vysokomolekulový chitozán s vysokým stupňom deacetylácie získaný viacstupňovou deacetyláciou beta-chitínu za pomoci ultrazvuku. Ultrasonics Sonochemistry 32, 2016. 79–85.
- Kjartansson, G., Wu, T., Zivanovic, S., Weiss, J. (2008): Sonochemicky podporovaná premena chitínu na chitozán, stretnutie hlavných riešiteľov Národnej výskumnej iniciatívy USDA, New Orleans, LA, June 28th.
- Kjartansson, G., Kristbergsson, K. Zivanovic, S., Weiss, J. (2008): Vplyv teploty pri deacetylácii chitínu na chitozán s predúpravou ultrazvukom s vysokou intenzitou, výročné stretnutie Inštitútu potravinárskych technológov, New Orleans, LA, June 30th, 95-18.
- Kjartansson, G., Kristbergsson, K., Zivanovic, S., Weiss, J. (2008): Vplyv ultrazvuku s vysokou intenzitou na urýchlenie premeny chitínu na chitozán, výročné stretnutie Inštitútu potravinárskych technológov, New Orleans, LA, June 30th, 95-17.
- Preto M.F., Campana-Filho S.P., Fiamingo A., Cosentino I.C., Tessari-Zampieri M.C., Abessa D.M.S., Romero A.F., Bordon I.C. (2017): Gladius a jeho deriváty ako potenciálne biosorbenty lodnej motorovej nafty. Environmental Science and Pollution Research (2017) 24:22932–22939.
- Wijesena R.N., Tissera N., Kannangara Y.Y., Lin Y., Amaratunga G.A.J., de Silva K.M.N. (2015): Metóda prípravy chitozánových nanočastíc a nanovlákien postupom zhora nadol. Carbohydrate Polymers 117, 2015. 731–738.
- Wu, T., Zivanovic, S., Hayes, D.G., Weiss, J. (2008). Účinné znižovanie molekulovej hmotnosti chitozánu ultrazvukom s vysokou intenzitou: Základný mechanizmus a vplyv parametrov spracovania. Journal of Agricultural and Food Chemistry 56(13):5112–5119.
- Yadav M.; Goswami P.; Paritosh K.; Kumar M.; Pareek N.; Vivekanand V. (2019): Odpad z morských plodov: zdroj na prípravu komerčne využiteľných chitínových/chitozánových materiálov. Bioresources and Bioprocessing 6/8, 2019.
Užitočné fakty
Ako funguje ultrazvuková deacetylácia chitínu?
Keď sa vysokovýkonný nízkofrekvenčný ultrazvuk (napr. 20–26kHz) prenáša do kvapaliny alebo suspenzie, kvapalina je vystavená striedajúcim sa cyklom vysokého a nízkeho tlaku, ktoré spôsobujú stláčanie a zrieďovanie. Počas týchto striedajúcich sa cyklov vysokého a nízkeho tlaku vznikajú malé vákuové bubliny, ktoré rastú počas niekoľkých tlakových cyklov. Keď vákuové bubliny už nedokážu absorbovať viac energie, prudko skolabujú. Pri tejto implózii bublín vznikajú lokálne veľmi intenzívne podmienky: vysoké teploty až do 5000K, tlaky až do 2000atm, veľmi vysoké rýchlosti ohrevu/chladenia a tlakové rozdiely. Keďže dynamika kolapsu bublín je rýchlejšia než prenos hmoty a tepla, energia v kolabujúcej dutine je sústredená vo veľmi malej oblasti, nazývanej aj „horúce miesto“. Implózia kavitačnej bubliny spôsobuje aj mikroturbulencie, prúdy kvapaliny s rýchlosťou až do 280m/s a z nich vyplývajúce šmykové sily. Tento jav je známy ako ultrazvuková alebo akustická kavitácia.
Na kvapôčky a častice v kvapaline vystavenej ultrazvuku pôsobia tieto kavitačné sily, a keď sa urýchlené častice navzájom zrazia, pri vzájomných zrážkach sa roztrieštia. Akustická kavitácia je princípom fungovania ultrazvukového mletia, dispergovania, emulgácie a sonochémie.
Pri deacetylácii chitínu ultrazvuk s vysokou intenzitou zväčšuje plochu povrchu tým, že aktivuje povrch a podporuje prenos hmoty medzi časticami a činidlom.
Chitozán
Chitozán je modifikovaný, katiónový, netoxický sacharidový polymér so zložitou chemickou štruktúrou tvorenou β-(1,4) glukozamínovými jednotkami ako hlavnou zložkou (>80%) a N-acetylglukozamínovými jednotkami (<20%), ktoré sú náhodne rozmiestnené pozdĺž reťazca. Chitozán sa získava z chitínu chemickou alebo enzymatickou deacetyláciou. Stupeň deacetylácie (DA) určuje obsah voľných aminoskupín v štruktúre a používa sa na rozlíšenie chitínu a chitozánu. Chitozán vykazuje dobrú rozpustnosť v šetrných rozpúšťadlách, ako je zriedená kyselina octová, a poskytuje niekoľko voľných aminoskupín ako aktívnych miest. Vďaka tomu je chitozán v mnohých chemických reakciách výhodnejší než chitín.
Chitozán sa cení pre svoju vynikajúcu biokompatibilitu a biologickú odbúrateľnosť, netoxickosť, dobrú antimikrobiálnu aktivitu (proti baktériám a hubám), nepriepustnosť pre kyslík a schopnosť tvoriť filmy. Na rozdiel od chitínu má chitozán výhodu v tom, že je rozpustný vo vode, a preto sa s ním ľahšie manipuluje a ľahšie sa používa vo formuláciách.
Chitín je po celulóze druhým najrozšírenejším polysacharidom a jeho obrovský výskyt z neho robí lacnú a udržateľnú surovinu.
Výroba chitozánu
Chitozán sa vyrába v dvoch krokoch. V prvom kroku sa surovina, napríklad panciere kôrovcov (t. j. kreviet, krabov, homárov), zbaví bielkovín, demineralizuje a vyčistí, čím sa získa chitín. V druhom kroku sa chitín spracuje silnou zásadou (napr. NaOH), aby sa odstránili bočné acetylové skupiny a získal sa chitozán. Je známe, že konvenčná výroba chitozánu je časovo veľmi náročná a nákladná.
Chitín
Chitín (C8H13O5N)n je polymér β-1,4-N-acetylglukozamínu s priamym reťazcom a rozlišuje sa na α-, β- a γ-chitín. Chitín je derivát glukózy a tvorí hlavnú zložku vonkajších kostier článkonožcov, ako sú kôrovce a hmyz, rádul mäkkýšov, zobákov hlavonožcov a šupín rýb a recentných obojživelníkov. Nachádza sa aj v bunkových stenách húb. Štruktúra chitínu je porovnateľná so štruktúrou celulózy a vytvára kryštalické nanofibrily alebo ihlicovité kryštály. Celulóza je najrozšírenejším polysacharidom na svete a po nej nasleduje chitín ako druhý najrozšírenejší polysacharid.
Glukozamín
Glukozamín (C6H13NO5) je aminocukor a dôležitý prekurzor pri biochemickej syntéze glykozylovaných bielkovín a lipidov. Glukozamín je v prírode hojne sa vyskytujúca zlúčenina, ktorá je súčasťou štruktúry oboch polysacharidov, chitozánu aj chitínu, čo z neho robí jeden z najrozšírenejších monosacharidov. Väčšina komerčne dostupného glukozamínu sa vyrába hydrolýzou vonkajších kostier kôrovcov, t. j. pancierov krabov a homárov.
Glukozamín sa používa najmä ako výživový doplnok vo forme glukozamínsulfátu, glukozamínhydrochloridu alebo N-acetylglukozamínu. Doplnky s glukozamínsulfátom sa podávajú perorálne na liečbu bolestivého ochorenia spôsobeného zápalom, rozpadom a napokon stratou chrupavky (osteoartrózy).