Výroba chitínu a chitosanu z húb

Ultrazvuk je vysoko účinná metóda na uvoľňovanie chitínu a chitosanu zo zdrojov húb, ako sú huby. Chitín a chitosan musia byť depolymerizované a deacetylované v následnom spracovaní, aby sa získal vysokokvalitný biopolymér. Ultrazvukom asistovaná depolymerizácia a deacetylácia je vysoko účinná, jednoduchá a rýchla technika, ktorej výsledkom sú vysokokvalitné chitozány s vysokou molekulovou hmotnosťou a vynikajúcou biologickou dostupnosťou.

Chitín a chitosan získaný z húb prostredníctvom ultrazvuku

Jedlé a liečivé huby, ako sú Lentinus edodes (shiitake), Ganoderma lucidum (Lingzhi alebo reishi), Inonotus obliquus (chaga), Agaricus bisporus (gombíkové huby), Hericium erinaceus (levia hriva), Cordyceps sinensis (húsenica), Grifola frondosa (sliepka), Trametes versicolor (Coriolus versicolor, Polyporus versicolor, morčací chvost) a mnoho ďalších druhov húb sa široko používajú ako potrava a na extrakciu bioaktívnych zlúčenín. Tieto huby, ako aj zvyšky spracovania (hubový odpad), sa môžu použiť na výrobu chitosanu. Ultrazvuk podporuje nielen uvoľňovanie chitínu zo štruktúry bunkovej steny húb, ale tiež vedie k premene chitínu na cenný chitosan prostredníctvom ultrazvukom asistovanej depolymerizácie a deacetylácie.

Depolymerizácia a deacetylácia chitínu na chitosan je podporovaná sonikáciou

Intenzívna ultrasonikácia pomocou ultrazvukového systému typu sondy je technika používaná na podporu depolymerizácie a deacetylácie chitínu, čo vedie k tvorbe chitosanu. Chitín je prirodzene sa vyskytujúci polysacharid nachádzajúci sa v exoskeletoch kôrovcov, hmyzu a bunkových stenách určitých húb. Chitosan sa získava z chitínu odstránením acetylových skupín z molekuly chitínu.

Ultrazvukový postup na premenu hubového chitínu na chitosan

Keď sa na výrobu chitosanu z chitínu aplikuje intenzívna ultrazvuková ultrazvuk, chitínová suspenzia sa sonikuje vysokointenzívnymi, nízkofrekvenčnými ultrazvukovými vlnami, zvyčajne v rozsahu 20 kHz až 30 kHz. Tento proces vytvára intenzívnu akustickú kavitáciu, ktorá sa týka tvorby, rastu a kolapsu mikroskopických vákuových bublín v kvapaline. Kavitácia vytvára lokalizované extrémne vysoké šmykové sily, vysoké teploty (až niekoľko tisíc stupňov Celzia) a tlaky (až niekoľko stoviek atmosfér) v kvapaline obklopujúcej kavitačné bubliny. Tieto extrémne podmienky prispievajú k rozpadu chitínového polyméru a následnej deacetylácii.
 

SEM obrázky chitínov a chitosanov z dvoch druhov húb: a) Chitin z L. vellereus; b) Chitín z P. ribis; c) Chitosan od L. vellereus; d) chitosan z P. ribis.obrázok a štúdia: © Erdoğan a kol., 2017

Ultrazvuková depolymerizácia chitínu

Depolymerizácia chitínu nastáva kombinovanými účinkami mechanických síl, ako je mikroprúdenie a tryskanie kvapaliny, ako aj ultrazvukom iniciovanými chemickými reakciami indukovanými voľnými radikálmi a inými reaktívnymi látkami vznikajúcimi počas kavitácie. Vysokotlakové vlny generované počas kavitácie spôsobujú, že chitínové reťazce podliehajú šmykovému namáhaniu, čo vedie k štiepeniu polyméru na menšie fragmenty.

Ultrazvuková deacetylácia chitínu

Okrem depolymerizácie intenzívna ultrazvuková signalizácia podporuje aj deacetyláciu chitínu. Deacetylácia zahŕňa odstránenie acetylových skupín z molekuly chitínu, čo vedie k tvorbe chitosanu. Intenzívna ultrazvuková energia, najmä vysoké teploty a tlaky generované počas kavitácie, urýchľujú deacetylačnú reakciu. Reaktívne podmienky vytvorené kavitáciou pomáhajú prerušiť acetylové väzby v chitíne, čo vedie k uvoľňovaniu kyseliny octovej a premene chitínu na chitosan.
Celkovo intenzívna ultrasonikácia zlepšuje procesy depolymerizácie aj deacetylácie tým, že poskytuje potrebnú mechanickú a chemickú energiu na rozklad chitínového polyméru a uľahčuje premenu na chitosan. Táto technika ponúka rýchlu a efektívnu metódu výroby chitosanu z chitínu s mnohými aplikáciami v rôznych priemyselných odvetviach vrátane farmaceutického priemyslu, poľnohospodárstva a biomedicínskeho inžinierstva.

Priemyselná výroba chitosanu z húb s výkonovým ultrazvukom

Komerčná výroba chitínu a chitosanu je založená najmä na odpade z námorného priemyslu (t. j. rybolov, zber mäkkýšov atď.). Rôzne zdroje surovín vedú k rôznym kvalitám chitínu a chitosanu, čo je výsledkom výkyvov výroby a kvality v dôsledku sezónnych výkyvov rybolovu. Okrem toho chitosan získaný z hubových zdrojov ponúka údajne vynikajúce vlastnosti, ako je homogénna dĺžka polyméru a väčšia rozpustnosť v porovnaní s chitozánom z morských zdrojov. (porovnaj Ghormade et al., 2017) S cieľom zabezpečiť jednotný chitosan sa extrakcia chitínu z druhov húb stala stabilnou alternatívnou výrobou. Produkciu chitínu a citiosanu z húb je možné ľahko a spoľahlivo dosiahnuť pomocou ultrazvukovej extrakcie a technológie deacetylácie. Intenzívna sonikácia narúša bunkové štruktúry, aby sa uvoľnil chitín a podporuje prenos hmoty vo vodných rozpúšťadlách pre vynikajúce výťažky chitínu a účinnosť extrakcie. Následná ultrazvuková deacetylácia premieňa chitín na cenný chitosan. Ultrazvukovú extrakciu chitínu aj deacetyláciu na chitosan je možné lineárne škálovať na akúkoľvek komerčnú úroveň výroby.

Sonikácia zintenzívňuje produkciu hubového chitosanu a robí produkciu efektívnejšou a ekonomickejšou.(obrázok a štúdia: © Zhu et al., 2019)

Výsledky výskumu ultrazvukovej deacetylácie chitínu a chitosanu

Zhu et al. (2018) vo svojej štúdii dospeli k záveru, že ultrazvuková deacetylácia sa ukázala ako zásadný prelom, ktorý premenil β-chitín na chitosan s 83–94% deacetyláciou pri znížených reakčných teplotách. Na obrázku vľavo je SEM snímka ultrazvukovo deacetylovaného chitosanu (90 W, 15 min, 20 w/v% NaOH, 1:15 (g: ml) (obrázok a štúdia: © Zhu et al., 2018)
V ich protokole bol roztok NaOH (20 w/v %) pripravený rozpustením vločiek NaOH vo vode DI. Alkalický roztok sa potom pridal do sedimentu GLSP (0,5 g) v pomere pevná látka-kvapalina 1:20 (g: ml) do odstredivkovej skúmavky. Chitosan sa pridal k NaCl (40 ml, 0,2 M) a kyseline octovej (0,1 M) v objemovom pomere roztoku 1:1. Suspenzia bola potom podrobená ultrazvuku pri miernej teplote 25 °C počas 60 minút pomocou ultrazvuku typu sondy (250 W, 20 kHz). (porovnaj Zhu et al., 2018)
 
Pandit et al. (2021) zistili, že rýchlosť degradácie roztokov chitosanu je zriedka ovplyvnená koncentráciami kyseliny použitej na rozpustenie polyméru a do značnej miery závisí od teploty, intenzity ultrazvukových vĺn a iónovej sily média použitého na rozpustenie polyméru. (porovnaj Pandit a kol., 2021)
 
V ďalšej štúdii Zhu et al. (2019) použili prášky spór Ganoderma lucidum ako hubovú surovinu a skúmali ultrazvukom asistovanú deacetyláciu a účinky parametrov spracovania, ako je doba sonikacie, pomer pevnej látky k kvapaline, koncentrácia NaOH a ožiaracia sila na stupeň deacetylácie (DD) chitosanu. Najvyššia hodnota DD bola získaná pri nasledujúcich ultrazvukových parametroch: 20 min sonikácia pri 80 W, 10 % (g: ml) NaOH, 1:25 (g: ml). Povrchová morfológia, chemické skupiny, tepelná stabilita a kryštalinita ultrazvukom získaného chitozánu boli skúmané pomocou SEM, FTIR, TG a XRD. Výskumný tím uvádza významné zvýšenie stupňa deacetylácie (DD), dynamickej viskozity ([η]) a molekulovej hmotnosti (Mv ̄) ultrazvukom produkovaného chitosanu. Výsledky zdôraznili ultrazvukovú deacetylačnú techniku húb, vysoko účinnú výrobnú metódu pre chitosan, ktorá je vhodná pre biomedicínske aplikácie. (porovnaj Zhu et al., 2019)

Vynikajúca kvalita chitosanu s ultrazvukovou depolymerizáciou a deacetyláciou

Ultrazvukom riadené procesy extrakcie a depolymerizácie chitínu? chitosanu sú presne kontrolovateľné a parametre ultrazvukového procesu je možné prispôsobiť surovinám a cieľovej kvalite konečného produktu (napr. molekulová hmotnosť, stupeň deacetylácie). To umožňuje prispôsobiť ultrazvukový proces vonkajším faktorom a nastaviť optimálne parametre pre vynikajúci výsledok a účinnosť.
Ultrazvukovo deacetylovaný chitosan vykazuje vynikajúcu biologickú dostupnosť a biokompatibilitu. Keď sa ultrazvukom pripravené chitozánové biopolyméry porovnajú s tepelne odvodeným chitozánom z hľadiska biomedicínskych vlastností, ultrazvukom vyrobený chitosan vykazuje významne zlepšenú životaschopnosť fibroblastov (bunka L929) a zvýšenú antibakteriálnu aktivitu pre Escherichia coli (E. coli) aj Staphylococcus aureus (S. aureus).
(porovnaj Zhu et al., 2018)
 

Snímky skenovacej elektrónovej mikroskopie (SEM) vo zväčšení 100× a) gladius, b) ultrazvukom ošetrený gladius, c) β-chitín, d) ultrazvukom ošetrený β-chitín a e) chitosan (zdroj: Preto et al. 2017)

Vysokovýkonné ultrazvukové zariadenie na spracovanie chitínu a chitosanu

Fragmentácia chitínu a detylácia chitínu na chitozán si vyžaduje výkonné a spoľahlivé ultrazvukové zariadenie, ktoré dokáže poskytnúť vysoké amplitúdy, ponúka presnú kontrolovateľnosť parametrov procesu a môže byť prevádzkované 24 hodín denne, 7 dní v týždni pri veľkom zaťažení a v náročných prostrediach. Sortiment výrobkov Hielscher Ultrasonics tieto požiadavky spoľahlivo spĺňa. Okrem vynikajúceho ultrazvukového výkonu sa ultrazvukové prístroje Hielscher môžu pochváliť vysokou energetickou účinnosťou, čo je významná ekonomická výhoda – najmä pri komerčnej veľkovýrobe.
Ultrazvukové prístroje Hielscher sú vysokovýkonné systémy, ktoré môžu byť vybavené príslušenstvom, ako sú sonotrody, zosilňovače, reaktory alebo prietokové články, aby optimálne vyhovovali potrebám vášho procesu. Vďaka digitálnemu farebnému displeju, možnosti prednastavenia ultrazvukových cyklov, automatickému záznamu údajov na integrovanú SD kartu, diaľkovému ovládaniu prehliadača a mnohým ďalším funkciám zaisťujú ultrazvukové procesory Hielscher najvyššiu kontrolu procesu a užívateľskú prívetivosť. V spojení s robustnosťou a veľkou nosnosťou sú ultrazvukové systémy Hielscher vaším spoľahlivým ťažným koňom vo výrobe. 
Fragmentácia a deacetylácia chitínu si vyžaduje výkonný ultrazvuk na získanie cielenej konverzie a konečného produktu chitosanu vysokej kvality. Najmä pri fragmentácii chitínových vločiek a krokoch depolymerizácie? deacetylácie sú rozhodujúce vysoké amplitúdy a zvýšené tlaky. Priemyselné ultrazvukové procesory Hielscher Ultrasonics ľahko poskytujú veľmi vysoké amplitúdy. Amplitúdy až 200 μm je možné nepretržite prevádzkovať v prevádzke 24 hodín denne, 7 dní v týždni. Pre ešte vyššie amplitúdy sú k dispozícii prispôsobené ultrazvukové sonotródy. Výkonová kapacita ultrazvukových systémov Hielscher umožňuje efektívnu a rýchlu depolymerizáciu a deacetyláciu v bezpečnom a užívateľsky prívetivom procese.
 

Synergická liečba chitínom vylepšená ultrazvukom

S cieľom prekonať nevýhody (t. j. nízka účinnosť, vysoké náklady na energiu, dlhý čas spracovania, toxické rozpúšťadlá) tradičnej chemickej a enzymatickej deacetlycie chitínu bol do spracovania chitínu a chitosanu integrovaný ultrazvuk s vysokou intenzitou. Vysoká intenzita sonikácie a výsledné účinky akustické kavitácie vedú k rýchlemu štiepeniu polymérnych reťazcov a znižujú polydisperzitu, čím podporujú syntézu chitosanu. Okrem toho ultrazvukové šmykové sily zintenzívňujú prenos hmoty v roztoku, takže sa zvyšuje chemická, hydrolytická alebo enzymatická reakcia. Ultrazvukové ošetrenie chitínom je možné kombinovať s už existujúcimi technikami spracovania chitínu, ako sú chemické metódy, hydrolýza alebo enzymatické postupy.

Ultrazvukom asistovaná chemická deacetylácia a depolymerizácia

Pretože chitín je nereaktívny a nerozpustný biopolymér, musí prejsť procesnými krokmi demineralizácie, deproteinizácie a depolymerizácie? deacetylácie, aby sa získal rozpustný a bioacetabilný chitosan. Tieto procesné kroky zahŕňajú ošetrenie silnými kyselinami, ako je HCl, a silnými zásadami, ako sú NaOH a KOH. Keďže tieto konvenčné procesné kroky sú neefektívne, pomalé a vyžadujú vysoké energie, intenzifikácia procesu sonikáciou výrazne zlepšuje produkciu chitosanu. Aplikácia výkonového ultrazvuku zvyšuje výťažnosť a kvalitu chitosanu, skracuje proces z dní na niekoľko hodín, umožňuje jemnejšie rozpúšťadlá a robí celý proces energeticky efektívnejším.

Ultrazvukovo vylepšená deproteinizácia chitínu

Vallejo-Dominguez et al. (2021) pri svojom skúmaní deproteinizácie chitínu zistili, že “Aplikácia ultrazvuku na výrobu biopolymérov znížila obsah bielkovín, ako aj veľkosť častíc chitínu. Chitosan s vysokým stupňom deacetylácie a strednou molekulovou hmotnosťou bol vyrobený ultrazvukovou asistenciou.”

Ultrazvuková hydrolýza na depolymerizáciu chitínu

Na chemickú hydrolýzu sa na deacetyláciu chitínu používajú kyseliny alebo zásady, ale častejšie sa používa alkalická deacetylácia (napr. hydroxid sodný NaOH). Kyslá hydrolýza je alternatívnou metódou k tradičnej chemickej deacetylácii, kde sa roztoky organických kyselín používajú na depolymerizáciu chitínu a chitosanu. Metóda kyslej hydrolýzy sa väčšinou používa, keď molekulová hmotnosť chitínu a chitosanu musí byť homogénna. Tento konvenčný proces hydrolýzy je známy ako pomalý a energeticky a nákladovo náročný. Požiadavka na silné kyseliny, vysoké teploty a tlaky sú faktory, ktoré menia proces hydrolytického chitosanu na veľmi nákladný a časovo náročný postup. Použité kyseliny vyžadujú následné procesy, ako je neutralizácia a odsolenie.
Integráciou vysokovýkonného ultrazvuku do procesu hydrolýzy je možné výrazne znížiť požiadavky na teplotu a tlak pre hydrolytické štiepenie chitínu a chitosanu. Okrem toho sonikacia umožňuje nižšie koncentrácie kyselín alebo použitie miernejších kyselín. Vďaka tomu je proces udržateľnejší, efektívnejší, nákladovo efektívnejší a šetrnejší k životnému prostrediu.

Ultrazvukom asistovaná chemická deacetylácia

Chemický rozpad a deakteylácia chitínu a chitosanu sa dosahuje hlavne ošetrením chitínu alebo chitosanu minerálnymi kyselinami (napr. kyselina chlorovodíková HCl), dusitanom sodným (NaNO₂) alebo peroxid vodíka (H₂O₂). Ultrazvuk zlepšuje rýchlosť deacetylácie, čím skracuje reakčný čas potrebný na dosiahnutie cieľového stupňa deacetylácie. To znamená, že sonikácia skracuje požadovaný čas spracovania z 12-24 hodín na niekoľko hodín. Okrem toho sonikácia umožňuje výrazne nižšie chemické koncentrácie, napríklad 40 % (w/w) hydroxidu sodného pomocou sonikácie, zatiaľ čo 65 % (w/w) je potrebných bez použitia ultrazvuku.

Ultrazvukovo-enzymatická deacetylácia

Zatiaľ čo enzymatická deacetylácia je mierna, environmentálne neškodná forma spracovania, jej účinnosť a náklady sú neekonomické. Vzhľadom na zložitú, pracnú a nákladnú následnú izoláciu a čistenie enzýmov z konečného produktu sa enzymatická deacetylácia chitínu nerealizuje v komerčnej výrobe, ale používa sa iba vo vedecko-výskumnom laboratóriu.
Ultrazvuková predbežná úprava pred enzymatickou deacetlytáciou fragmentuje molekuly chitínu, čím sa zväčšuje povrch a sprístupňuje sa viac povrchu pre enzýmy. Vysokovýkonná sonikácia pomáha zlepšovať enzymatickú deacetyláciu a robí proces ekonomickejším.