Výroba chitínu a chitozánu z húb

Pôsobenie ultrazvuku je vysoko účinná metóda uvoľňovania chitínu a chitozánu z hubových zdrojov, ako sú klobúkaté huby. Na získanie vysokokvalitného biopolyméru sa chitín a chitozán musia pri následnom spracovaní depolymerizovať a deacetylovať. Ultrazvukom podporovaná depolymerizácia a deacetylácia je vysoko účinná, jednoduchá a rýchla technika, ktorej výsledkom sú vysokokvalitné chitozány s vysokou molekulovou hmotnosťou a vynikajúcou biologickou dostupnosťou.

Chitín a chitozán získavané z húb pomocou ultrazvuku

Jedlé a liečivé huby, ako sú Lentinus edodes (šiitake), Ganoderma lucidum (Lingzhi alebo reiši), Inonotus obliquus (čaga), Agaricus bisporus (šampiňón dvojvýtrusný), Hericium erinaceus (koralovec ježovitý), Cordyceps sinensis (žezlovka čínska), Grifola frondosa (trsovnica lupeňovitá), Trametes versicolor (Coriolus versicolor, Polyporus versicolor, trúdnikovec pestrý) a mnohé ďalšie druhy húb, sa vo veľkej miere používajú ako potraviny a na extrakciu bioaktívnych zlúčenín. Tieto huby, ako aj zvyšky z ich spracovania (hubový odpad), sa môžu použiť na výrobu chitozánu. Pôsobenie ultrazvuku nielen podporuje uvoľňovanie chitínu zo štruktúry bunkovej steny húb, ale aj napomáha premene chitínu na hodnotný chitozán prostredníctvom ultrazvukom podporovanej depolymerizácie a deacetylácie.

Toto video predvádza vysoko účinnú extrakciu koralovca ježovitého pomocou ultrazvukového homogenizátora Hielscher UP200Ht. Ultrazvuková extrakcia je ideálnou technikou na výrobu vysokokvalitných plnospektrálnych extraktov obsahujúcich polysacharidy, ako sú beta-glukány, ako aj hericenóny a erinacíny.

 

Intenzívne pôsobenie ultrazvuku pomocou ultrazvukového systému so sondou je technika používaná na podporu depolymerizácie a deacetylácie chitínu, ktorá vedie k tvorbe chitozánu. Chitín je prirodzene sa vyskytujúci polysacharid nachádzajúci sa vo vonkajších kostrách kôrovcov a hmyzu a v bunkových stenách niektorých húb. Chitozán sa získava z chitínu odstránením acetylových skupín z molekuly chitínu.

Ultrazvukový postup premeny hubového chitínu na chitozán

Pri použití intenzívneho ultrazvuku na výrobu chitozánu z chitínu sa suspenzia chitínu sonikuje ultrazvukovými vlnami s vysokou intenzitou a nízkou frekvenciou, zvyčajne v rozsahu od 20 kHz do 30 kHz. Tento proces vytvára intenzívnu akustickú kavitáciu, ktorá označuje vznik, rast a kolaps mikroskopických vákuových bublín v kvapaline. Kavitácia vytvára v kvapaline obklopujúcej kavitačné bubliny lokálne extrémne vysoké šmykové sily, vysoké teploty (až niekoľko tisíc stupňov Celzia) a tlaky (až niekoľko stoviek atmosfér). Tieto extrémne podmienky prispievajú k rozkladu chitínového polyméru a následnej deacetylácii.
 

 

Ultrazvuková depolymerizácia chitínu

Depolymerizácia chitínu prebieha kombinovaným pôsobením mechanických síl, ako sú mikroprúdenie a kvapalinové mikroprúdy, ako aj ultrazvukom iniciovaných chemických reakcií vyvolaných voľnými radikálmi a ďalšími reaktívnymi časticami vznikajúcimi počas kavitácie. Vlny vysokého tlaku vznikajúce počas kavitácie vystavujú chitínové reťazce šmykovému napätiu, čo vedie k štiepeniu polyméru na menšie fragmenty.

Ultrazvuková deacetylácia chitínu

Okrem depolymerizácie intenzívne pôsobenie ultrazvuku podporuje aj deacetyláciu chitínu. Deacetylácia zahŕňa odstránenie acetylových skupín z molekuly chitínu, čo vedie k vzniku chitozánu. Intenzívna ultrazvuková energia, najmä vysoké teploty a tlaky vznikajúce počas kavitácie, urýchľujú deacetylačnú reakciu. Reakčné podmienky vytvorené kavitáciou pomáhajú štiepiť väzby acetylových skupín v chitíne, čo vedie k uvoľneniu kyseliny octovej a premene chitínu na chitozán.
Celkovo intenzívne pôsobenie ultrazvuku zintenzívňuje procesy depolymerizácie aj deacetylácie tým, že poskytuje potrebnú mechanickú a chemickú energiu na rozklad chitínového polyméru a uľahčuje jeho premenu na chitozán. Táto technika ponúka rýchlu a účinnú metódu výroby chitozánu z chitínu s početnými aplikáciami v rôznych odvetviach vrátane farmaceutického priemyslu, poľnohospodárstva a biomedicínskeho inžinierstva.

Priemyselná výroba chitozánu z húb pomocou výkonového ultrazvuku

Komerčná výroba chitínu a chitozánu je založená najmä na odpade z odvetví využívajúcich morské zdroje (t. j. rybolov, zber kôrovcov a mäkkýšov atď.). Rôzne zdroje surovín vedú k rozdielnej kvalite chitínu a chitozánu, pričom sezónne výkyvy v rybolove spôsobujú kolísanie výroby a kvality. Okrem toho má chitozán získaný z hubových zdrojov podľa uvádzaných údajov lepšie vlastnosti, ako sú homogénna dĺžka polymérnych reťazcov a vyššia rozpustnosť, v porovnaní s chitozánom z morských zdrojov. (porov. Ghormade et al., 2017) Na zabezpečenie dodávok chitozánu s jednotnými vlastnosťami sa extrakcia chitínu z rôznych druhov húb stala stabilnou alternatívou výroby. Výrobu chitínu a chitozánu z húb možno ľahko a spoľahlivo realizovať pomocou technológie ultrazvukovej extrakcie a deacetylácie. Intenzívna sonikácia narúša bunkové štruktúry, čím uvoľňuje chitín, a podporuje prenos hmoty vo vodných rozpúšťadlách, čím zabezpečuje vyššie výťažky chitínu a vyššiu účinnosť extrakcie. Následná ultrazvuková deacetylácia premieňa chitín na cenný chitozán. Ultrazvukovú extrakciu chitínu aj jeho deacetyláciu na chitozán možno lineárne škálovať na ľubovoľnú úroveň komerčnej výroby.

Výsledky výskumu ultrazvukovej deacetylácie chitínu a chitozánu

Zhu et al. (2018) vo svojej štúdii dospeli k záveru, že ultrazvuková deacetylácia sa osvedčila ako zásadný prelom, ktorý umožňuje premenu β-chitínu na chitozán so stupňom deacetylácie 83–94% pri znížených reakčných teplotách. Obrázok vľavo zobrazuje snímku ultrazvukom deacetylovaného chitozánu získanú skenovacou elektrónovou mikroskopiou (SEM) (90 W, 15 min, 20 w/v% NaOH, 1:15 (g: mL) (obrázok a štúdia: © Zhu et al., 2018)
Vo svojom protokole pripravili roztok NaOH (20 w/v %) rozpustením vločiek NaOH v deionizovanej vode. Alkalický roztok potom pridali k sedimentu GLSP (0,5 g) v centrifugačnej skúmavke pri pomere pevnej fázy ku kvapalnej fáze 1:20 (g: mL). Chitosan pridali k NaCl (40 mL, 0,2 M) a kyseline octovej (0,1 M) pri objemovom pomere roztokov 1:1. Suspenziu potom vystavili pôsobeniu ultrazvuku pri miernej teplote 25°C počas 60 min pomocou sondového ultrazvukového prístroja (250W, 20kHz). (porov. Zhu et al., 2018)
 
Pandit et al. (2021) zistili, že rýchlosť degradácie roztokov chitosanu je zriedkavo ovplyvnená koncentráciami kyseliny použitej na rozpustenie polyméru a do veľkej miery závisí od teploty, intenzity ultrazvukových vĺn a iónovej sily média použitého na rozpustenie polyméru. (porov. Pandit et al., 2021)
 
V ďalšej štúdii Zhu et al. (2019) použili prášky zo spór Ganoderma lucidum ako hubovú surovinu a skúmali ultrazvukom podporovanú deacetyláciu a vplyv procesných parametrov, ako sú čas sonikácie, pomer pevnej fázy ku kvapalnej fáze, koncentrácia NaOH a výkon ožarovania, na stupeň deacetylácie (DD) chitosanu. Najvyššiu hodnotu DD dosiahli pri nasledujúcich ultrazvukových parametroch: sonikácia počas 20 min pri 80W, 10% (g:ml) NaOH, 1:25 (g:ml). Povrchovú morfológiu, chemické skupiny, tepelnú stabilitu a kryštalinitu chitosanu získaného ultrazvukom skúmali pomocou SEM, FTIR, TG a XRD. Výskumný tím uvádza významné zvýšenie stupňa deacetylácie (DD), dynamickej viskozity ([η]) a molekulovej hmotnosti (Mv¯) chitosanu vyrobeného ultrazvukom. Výsledky zdôraznili, že technika ultrazvukovej deacetylácie húb je vysoko účinnou metódou výroby chitosanu, ktorý je vhodný na biomedicínske aplikácie. (porov. Zhu et al., 2019)

Špičková kvalita chitosanu vďaka ultrazvukovej depolymerizácii a deacetylácii

Ultrazvukom riadené procesy extrakcie a depolymerizácie chitínu / chitosanu možno presne regulovať a parametre ultrazvukového procesu možno prispôsobiť surovinám a cieľovej kvalite konečného produktu (napr. molekulovej hmotnosti, stupňu deacetylácie). To umožňuje prispôsobiť ultrazvukový proces vonkajším faktorom a nastaviť optimálne parametre na dosiahnutie špičkových výsledkov a účinnosti.
Ultrazvukom deacetylovaný chitosan vykazuje vynikajúcu biologickú dostupnosť a biokompatibilitu. Pri porovnaní biopolymérov chitosanu pripravených ultrazvukom s tepelne získaným chitosanom z hľadiska biomedicínskych vlastností vykazuje chitosan vyrobený ultrazvukom výrazne vyššiu životaschopnosť fibroblastov (buniek L929) a zvýšenú antibakteriálnu aktivitu proti Escherichia coli (E. coli) aj Staphylococcus aureus (S. aureus).
(porov. Zhu et al., 2018)
 

Vysokovýkonné ultrazvukové zariadenia na spracovanie chitínu a chitosanu

Fragmentácia chitínu a deacetylácia chitínu na chitozán si vyžadujú výkonné a spoľahlivé ultrazvukové zariadenia, ktoré dokážu dosahovať vysoké amplitúdy, umožňujú presné riadenie procesných parametrov a môžu pracovať v režime 24/7 pri vysokom zaťažení a v náročných prostrediach. Sortiment produktov Hielscher Ultrasonics tieto požiadavky spoľahlivo spĺňa. Okrem vynikajúceho ultrazvukového výkonu sa ultrazvukové prístroje Hielscher vyznačujú vysokou energetickou účinnosťou, čo predstavuje významnú ekonomickú výhodu – najmä pri použití vo veľkokapacitnej komerčnej výrobe.
Ultrazvukové prístroje Hielscher sú vysokovýkonné systémy, ktoré možno vybaviť príslušenstvom, ako sú sonotródy, zosilňovače amplitúdy, reaktory alebo prietokové cely, aby optimálne vyhovovali potrebám vášho procesu.
 Vďaka digitálnemu farebnému displeju, možnosti prednastaviť sonikačné cykly, automatickému zaznamenávaniu údajov na integrovanú SD kartu, diaľkovému ovládaniu cez prehliadač a mnohým ďalším funkciám zabezpečujú ultrazvukové prístroje Hielscher najvyššiu úroveň riadenia procesu a používateľskej prívetivosti. V spojení s robustnosťou a schopnosťou znášať vysoké zaťaženie sú ultrazvukové systémy Hielscher vaším spoľahlivým pracovným pomocníkom vo výrobe. 
Fragmentácia a deacetylácia chitínu si vyžadujú výkonný ultrazvuk na dosiahnutie požadovanej konverzie a vysokokvalitného konečného produktu z chitozánu. Najmä pri fragmentácii chitínových vločiek a krokoch depolymerizácie / deacetylácie sú rozhodujúce vysoké amplitúdy a zvýšené tlaky. Priemyselné ultrazvukové procesory Hielscher Ultrasonics ľahko dosahujú veľmi vysoké amplitúdy. Amplitúdy až do 200µm možno nepretržite udržiavať v prevádzke 24/7. Pre ešte vyššie amplitúdy sú k dispozícii ultrazvukové sonotródy vyrobené na mieru. Výkonová kapacita ultrazvukových systémov Hielscher umožňuje účinnú a rýchlu depolymerizáciu a deacetyláciu v bezpečnom a používateľsky prívetivom procese.
 

Nasledujúca tabuľka poskytuje orientačný prehľad o približnej spracovateľskej kapacite našich ultrazvukových prístrojov:

---

---

Synergické spracovanie chitínu zlepšené pôsobením ultrazvuku

S cieľom prekonať nevýhody (t. j. nízku účinnosť, vysoké náklady na energiu, dlhý čas spracovania, toxické rozpúšťadlá) tradičnej chemickej a enzymatickej deacetylácie chitínu bol do spracovania chitínu a chitozánu začlenený ultrazvuk s vysokou intenzitou. Sonikácia s vysokou intenzitou a z nej vyplývajúce účinky akustickej kavitácie vedú k rýchlemu štiepeniu polymérnych reťazcov a znižujú polydisperzitu, čím podporujú syntézu chitozánu. Ultrazvukové šmykové sily navyše zintenzívňujú prenos hmoty v roztoku, čím sa podporujú chemické, hydrolytické alebo enzymatické reakcie. Ultrazvukové spracovanie chitínu možno kombinovať s už existujúcimi technikami spracovania chitínu, ako sú chemické metódy, hydrolýza alebo enzymatické postupy.

Chemická deacetylácia a depolymerizácia podporované ultrazvukom

Keďže chitín je nereaktívny a nerozpustný biopolymér, na získanie rozpustného a biologicky prístupného chitozánu musí prejsť procesnými krokmi demineralizácie, deproteinizácie a depolymerizácie / deacetylácie. Tieto procesné kroky zahŕňajú spracovanie silnými kyselinami, ako je HCl, a silnými zásadami, ako sú NaOH a KOH. Keďže tieto konvenčné procesné kroky sú neúčinné, pomalé a vyžadujú veľké množstvo energie, intenzifikácia procesu sonikáciou výrazne zlepšuje výrobu chitozánu. Použitie výkonového ultrazvuku zvyšuje výťažnosť a kvalitu chitozánu, skracuje proces z dní na niekoľko hodín, umožňuje používať miernejšie rozpúšťadlá a zvyšuje energetickú účinnosť celého procesu.

Deproteinizácia chitínu zlepšená pôsobením ultrazvuku

Vallejo-Dominguez et al. (2021) pri skúmaní deproteinizácie chitínu zistili, že „použitie ultrazvuku pri výrobe biopolymérov znížilo obsah bielkovín aj veľkosť častíc chitínu. Pomocou ultrazvuku sa vyrobil chitosan s vysokým stupňom deacetylácie a strednou molekulovou hmotnosťou.“

Ultrazvuková hydrolýza na depolymerizáciu chitínu

Pri chemickej hydrolýze sa na deacetyláciu chitínu používajú kyseliny alebo zásady, častejšie sa však používa alkalická deacetylácia (napr. hydroxidom sodným NaOH). Kyslá hydrolýza je alternatívnou metódou k tradičnej chemickej deacetylácii, pri ktorej sa na depolymerizáciu chitínu a chitosanu používajú roztoky organických kyselín. Metóda kyslej hydrolýzy sa používa najmä vtedy, keď musí byť molekulová hmotnosť chitínu a chitosanu homogénna. Tento konvenčný proces hydrolýzy je známy svojím pomalým priebehom a vysokou energetickou a finančnou náročnosťou. Potreba silných kyselín, vysokých teplôt a tlakov patrí medzi faktory, ktoré robia z hydrolytického spracovania chitosanu veľmi nákladný a časovo náročný postup. Použité kyseliny si vyžadujú následné procesy, ako sú neutralizácia a odsoľovanie.
Začlenením vysokovýkonného ultrazvuku do procesu hydrolýzy možno výrazne znížiť požiadavky na teplotu a tlak pri hydrolytickom štiepení chitínu a chitosanu. Sonikácia navyše umožňuje použiť nižšie koncentrácie kyselín alebo miernejšie kyseliny. Vďaka tomu je proces udržateľnejší, účinnejší, nákladovo efektívnejší a šetrnejší k životnému prostrediu.

Chemická deacetylácia podporovaná ultrazvukom

Chemický rozklad a deacetylácia chitínu a chitosanu sa dosahujú najmä ošetrením chitínu alebo chitosanu minerálnymi kyselinami (napr. kyselinou chlorovodíkovou HCl), dusitanom sodným (NaNO₂), alebo peroxidom vodíka (H₂O₂). Ultrazvuk zvyšuje rýchlosť deacetylácie, a tým skracuje reakčný čas potrebný na dosiahnutie požadovaného stupňa deacetylácie. To znamená, že sonikácia skracuje potrebný čas spracovania z 12–24 hodín na niekoľko hodín. Sonikácia navyše umožňuje použiť výrazne nižšie koncentrácie chemikálií, napríklad 40% (w/w) hydroxid sodný pri použití sonikácie, zatiaľ čo bez použitia ultrazvuku je potrebná koncentrácia 65% (w/w).

Ultrazvukovo-enzymatická deacetylácia

Hoci je enzymatická deacetylácia miernym spôsobom spracovania šetrným k životnému prostrediu, z hľadiska účinnosti a nákladov je nehospodárna. Vzhľadom na zložitú, prácnu a nákladnú následnú izoláciu a purifikáciu enzýmov z konečného produktu sa enzymatická deacetylácia chitínu neuplatňuje v komerčnej výrobe, ale používa sa iba vo vedeckovýskumných laboratóriách.
Ultrazvuková predúprava pred enzymatickou deacetyláciou fragmentuje molekuly chitínu, čím zväčšuje ich povrch a sprístupňuje enzýmom väčšiu plochu. Vysokovýkonná sonikácia pomáha zlepšiť enzymatickú deacetyláciu a zvyšuje hospodárnosť procesu.