Zväčšovanie rozsahu syntézy peptidov: Ultrazvukové stratégie pre šaržovú a kontinuálnu výrobu
Syntéza peptidov s využitím ultrazvuku kombinuje osvedčené postupy peptidovej chémie s vysokofrekvenčnou mechanickou energiou s cieľom urýchliť reakčné a transportné procesy. Akustická kavitácia – tvorba a kolaps mikroskopických bublín – vytvára intenzívne lokálne premiešavanie, mikroprúdy a šmykové sily. Pri syntéze peptidov tieto účinky zlepšujú transport reagentov, zvlhčenie živice, rozpúšťanie a rozrušovanie agregátov. Nízkofrekvenčný ultrazvuk preto pôsobí predovšetkým ako nástroj na intenzifikáciu procesu: nenahrádza chemické viazanie, ale môže podstatne urýchliť a zefektívniť viazanie, odstránenie ochranných skupín, preplachovanie, štiepenie a následnú úpravu.
Výzva spočívajúca v zvýšení objemu výroby peptidov
Zväčšenie výroby peptidov z laboratórneho meradla na priemyselnú úroveň je náročné, pretože sa počas mnohých cyklov kopulácie a deprotekcie hromadia drobné neefektívnosti, čo znižuje výťažok a zvyšuje množstvo ťažko odstrániteľných nečistôt. Väčšie reaktory so sebou prinášajú aj obmedzenia v oblasti miešania, prenosu tepla, bobtnania živice a transportu reagentov, pričom spotreba rozpúšťadla, nároky na čistenie a výrobné náklady prudko stúpajú. Úspešné zväčšenie mierky musí preto zachovať rovnomernosť reakcie a kvalitu produktu a zároveň zabezpečiť reprodukovateľnú priepustnosť, efektívne využívanie zdrojov a presnú kontrolu všetkých kritických parametrov procesu.
Farmaceutická šarža s ultrazvukovým zariadením UIP2000hdT na zlepšenie syntézy peptidov
Stratégie syntézy peptidov s využitím ultrazvuku
Ultrazvuková syntéza peptidov v pevnej fáze
Syntéza peptidov v pevnej fáze (SPPS) pomocou Fmoc je najpodrobnejšie skúmanou ultrazvukovou stratégiou. Ošetrenie ultrazvukom zlepšuje prenikanie odstraňovacích a kopulačných činidiel do napučaných polymérnych guličiek a zároveň znižuje rozsah stagnujúcich hraničných vrstiev okolo živice. Môže tiež narušiť agregáciu na živici, čo je dôležitou príčinou neúplnej konverzie v hydrofóbnych a iných “náročné” sekvencie.
Experimentálne štúdie preukázali, že za uvedených podmienok je možné pomocou ultrazvuku syntetizovať biologicky aktívne peptidy obsahujúce až 44 aminokyselinových zvyškov, a to pri nižšej spotrebe surovín a kratších reakčných časoch, pričom nebolo pozorované zvýšenie hlavných vedľajších reakcií. (porov. Merlino a kol., 2019)
Ďalšia štúdia uvádzala štvornásobné až štrnásťnásobné skrátenie času potrebného na zostavenie vybraných peptidov; 25-mer bohatý na hydrofóbne zvyšky bol zostavený za 347 minút. (porov. Silva a kol., 2021)
Ultrazvukové vyšetrenie je možné vykonať počas:
- Napučanie živice a výmena činidiel
- Odstránenie ochranných skupín Fmoc alebo Boc
- Aktivácia a väzba aminokyselín
- Medzipranie
- Cykalizácia priamo na živici
- Odštiepenie hotového peptidu z nosiča
Syntéza v kvapalnej fáze a syntéza s využitím značiek
Ultrazvuk môže tiež zintenzívniť konvenčnú syntézu peptidov v kvapalnej fáze tým, že urýchľuje rozpúšťanie, disperziu činidiel a prenos hmoty v heterogénnych alebo viskóznych zmesiach. Jeho prínos je spravidla najväčší v prípadoch, keď je proces obmedzený miešaním alebo prenosom; pri úplne homogénnej reakcii, ktorú ovplyvňuje iba vnútorná chemická kinetika, môže byť zlepšenie menšie.
Pri syntéze peptidov s využitím značiek sa rastúci peptid viaže na rozpustnú alebo zrážateľnú organickú kotvu. Reakcie prebiehajú v roztoku, po čom sa značený medziprodukt izoluje zrážaním alebo filtráciou. Ultrazvukové ožiarenie môže urýchliť kopuláciu, odstránenie ochranných skupín, cyklizáciu a odštiepenie značky, pričom udržuje slabo rozpustné medziprodukty v dispergovanom stave.
| Technika | Ako to podporuje ultrazvukové ošetrzovanie | Význam a obmedzenia |
|---|---|---|
| Syntéza peptidov v pevnej fáze metódou Fmoc | Ultrazvuková liečba urýchľuje prenikanie piperidínu a odstraňovanie produktov Fmoc; zlepšuje transport aktivovaných aminokyselín do napučenej živice; narúša agregáciu na živici | Najpresvedčivejšie dôkazy a zvyčajne najväčší prínos |
| Boc-syntéza v pevnej fáze | Ultrazvukové ožiarenie zlepšuje prenikanie kyseliny, výmenu činidiel, kopuláciu a preplachovanie podobne ako v prípade Fmoc-chémie | Pri manipulácii s kyselinami a pri ich ohrievaní je potrebná opatrnosť |
| Syntéza v roztoku/v kvapalnej fáze | Ultrazvukové ožarovanie zlepšuje rozpúšťanie chránených aminokyselín, rozptyľuje zrazeniny a zvyšuje kontakt v dvojfázových reakciách alebo reakciách so suspenziami | Výhoda je menšia, ak je reakcia už homogénna a jej rýchlosť je obmedzená chemickými faktormi. |
| Syntéza s využitím rozpustného tagu alebo na báze zrážania | Ultrazvukové ožarovanie zabezpečuje, že značené medziprodukty zostávajú rozptýlené počas kopulácie, a môže zlepšiť rozpúšťanie pred filtráciou alebo zrážaním | Vhodné pre ťažko rozpustné alebo sypké prípravky; ultrazvuk slúži hlavne na uľahčenie manipulácie a prenosu hmoty |
| Priebežná alebo kontinuálna syntéza | Ultrazvuk pomáha udržiavať kontakt medzi živicou a kvapalinou a zabraňuje vzniku miestnych oblastí stagnácie alebo zhlukovaniu | Zväčšenie rozsahu pomocou konštrukcie prietokovej komory na zabezpečenie rovnomerného pôsobenia ultrazvuku |
| Ligácia a cyklizácia fragmentov | Ultrazvukom je možné rozpustiť hydrofóbne fragmenty, rozbiť agregáty a zlepšiť medzimolekulárny kontakt | To samo o sebe nezrýchľuje každú prirodzenú chemickú ligáciu alebo makrocyklizáciu; dominantným faktorom môže naďalej zostať nadmerné zriedenie alebo medzimolekulárna agregácia |
| Enzymatická syntéza peptidov | Pri vhodnej intenzite môže ultrazvuková liečba ovplyvniť dynamiku enzýmov a zlepšiť prenos substrátu, najmä v prípade imobilizovaných enzýmov alebo dvojfázových médií | Veľmi závisí od enzýmov; nadmerná energia spôsobuje rozvinutie alebo inaktiváciu |
| Ribozomálna/rekombinantná syntéza | Žiadny priamy vplyv na preklad | Ultrazvuk sa používa hlavne na rozrušenie buniek po expresii |
Ultrazvukové zväčšovanie mierky: spracovanie v dávkach, s recirkuláciou a s kontinuálnym prietokom
Ultrazvukové zariadenia spoločnosti Hielscher je možné bezproblémovo integrovať do vášho konkrétneho výrobného zariadenia na syntézu peptidov.
Pre zväčšenie rozsahu sú relevantné tri konfigurácie reaktora:
- Sériová sonikácia je jednoduchá a flexibilná, avšak s rastúcim objemom nádoby sa stáva náročnejšie dosiahnuť optimálnu a homogénnu sonikáciu.
- Pri recirkulačnom spracovaní sa obsah reaktora opakovane prečerpáva cez ultrazvukovú prietokovú komoru, čím sa dosahuje rovnomernejšie spracovanie pri zachovaní flexibility dávkového režimu.
- Pri kontinuálnom prietoku prechádza reakčný prúd jednou alebo viacerými riadenými zónami ultrazvukovej ožiarovania. Doba zdržania, prietok a dodávaná energia sa dajú presne nastaviť, čo z tejto architektúry robí preferované riešenie pre vysokokapacitnú a reprodukovateľnú výrobu.
Pri procesoch založených na živici musia prietoková dráha, čerpadlo a ventily zohľadňovať veľkosť granulátu tak, aby nedochádzalo k opotrebeniu ani upchatiu. Alternatívou je zadržiavanie živice v reaktore s miešaním a cirkulácia iba kvapalnej fázy cez ultrazvukovú komoru.
2 ks priemyselných ultrazvukových zariadení modelu UIP4000hdT pripojený k reaktoru s prietokovou komorou z nehrdzavejúcej ocele na výrobu peptidov.
Často kladené otázky týkajúce sa rozšírenia ultrazvukovej syntézy peptidov
Čo je ultrazvuková syntéza peptidov?
Pri ultrazvukovej syntéze peptidov sa využívajú vysokointenzívne zvukové vlny na zlepšenie premiešavania, prenosu hmoty a reakčnej kinetiky počas tvorby peptidov. Akustická kavitácia pomáha reagentom preniknúť do napučanej živice, rozptyľuje agregáty a urýchľuje kroky spojovania, odstraňovania ochranných skupín, preplachovania a štiepenia.
Ako ultrazvuk zlepšuje syntézu peptidov v pevnej fáze?
Pri syntéze peptidov v pevnej fáze za pomoci ultrazvuku (US-SPPS) sonikácia zlepšuje kontakt medzi peptidom viazaným na živicu a rozpustenými činidlami. To môže skrátiť reakčné cykly, podporiť úplnejšie viazanie a znížiť počet vynechaných sekvencií, najmä pri syntéze hydrofóbnych peptidov, peptidov náchylných k agregácii alebo inak náročných peptidov.
Môže ultrazvuk zvýšiť výťažok a čistotu peptidov?
Ultrazvuková úprava môže zlepšiť konverziu, výťažok surového produktu a čistotu tým, že podporuje rovnomerné rozloženie reagentov a obmedzuje neúplné kopulovanie. Výsledok závisí od peptidovej sekvencie, živice, rozpúšťadla, chemického postupu kopulácie a parametrov ultrazvuku, preto by mal byť každý proces optimalizovaný a analyticky validovaný.
Ktoré kroky syntézy peptidov je možné ošetriť ultrazvukom?
Ultrazvuk môže pomôcť pri napučaní živice, odstránení ochranných skupín Fmoc alebo Boc, kopulácii aminokyselín, preplachovaní, kondenzácii fragmentov, cyklizácii a odštiepení z pevného nosiča. Môže tiež zlepšiť rozpúšťanie a prenos hmoty pri syntéze peptidov v kvapalnej fáze a pri syntéze peptidov s využitím značiek.
Objavte ultrazvukovú syntézu peptidov – pre syntézu peptidov v pevnej fáze a – syntéza s označovaním v kvapalnej fáze!
Je ultrazvuková syntéza peptidov vhodná pre zložité sekvencie?
Áno. Ultrazvuk je obzvlášť užitočný v prípade hydrofóbnych sekvencií a sekvencií náchylných k agregácii, pretože kavitácia a mikroprúdenie pomáhajú narušiť agregáciu na živici a zlepšujú prístup reagentov k reaktívnym miestam. Pri náročných konjugáciách môže byť aj naďalej potrebné použiť optimalizované reagenty, opakovať konjugáciu alebo upraviť reakčné podmienky.
Je možné zväčšiť rozsah ultrazvukovej syntézy peptidov?
Ultrazvukovú syntézu peptidov je možné preniesť z laboratórnych pokusov do sériovej výroby, výroby s recirkuláciou alebo výroby s nepretržitým tokom. Zväčšenie výrobného rozsahu sa dosahuje zachovaním kľúčových parametrov, ako sú amplitúda, špecifická energia, teplota a doba zdržania, pri súčasnom zvyšovaní ultrazvukového výkonu, plochy sonotródy alebo počtu spracovateľských modulov.
Čo znamená lineárna škálovateľnosť v oblasti ultrazvuku?
Lineárna škálovateľnosť znamená, že priepustnosť sa môže zvyšovať približne úmerne k inštalovanému ultrazvukovému výkonu, ak požadovaná energia na jednotku objemu a ostatné procesné podmienky zostávajú konštantné. Napríklad zdvojnásobenie efektívneho ultrazvukového výkonu môže približne zdvojnásobiť prietok, za predpokladu, že sa zachová geometria reaktora, teplota a cieľové hodnoty kvality produktu.
Prečo sú ultrazvukové zariadenia Hielscher vhodné na rozšírenie výroby peptidov?
Ultrazvukové zariadenia spoločnosti Hielscher pokrývajú výkonové rozsahy pre laboratórne, pilotné aj priemyselné použitie, pričom využívajú konzistentné a regulovateľné prevádzkové parametre. Ich nastaviteľná amplitúda, automatické zaznamenávanie údajov, monitorovanie teploty a tlaku, kompatibilita s prietokovými celami a modulárne konfigurácie podporujú reprodukovateľný prenos procesov a spoľahlivú výrobu.
Môžu ultrazvukové zariadenia spoločnosti Hielscher fungovať v rámci nepretržitej výroby peptidov?
Áno. Priemyselné ultrazvukové zariadenia spoločnosti Hielscher je možné integrovať do recirkulačných okruhov a reaktorov s priebežným prietokom. Tieto konfigurácie zabezpečujú kontrolovanú dobu zdržania a prísun energie a zároveň znižujú kolísanie medzi jednotlivými šaržami. Priemyselné systémy sú navrhnuté na nepretržitú prevádzku 24/7 v náročných výrobných podmienkach.
Čo je lepšie na syntézu peptidov – ultrazvukové kúpele alebo sondové sonikátory?
Ultrazvukové kúpele môžu byť vhodné na počiatočné skríningové testovanie a súčasnú úpravu malých uzavretých nádob. Ultrazvukové zariadenia so sondou dodávajú ultrazvuk priamo do média, čím poskytujú vyššiu intenzitu, lepšiu kontrolu parametrov a väčšiu škálovateľnosť. Z tohto dôvodu sa sondy a prietokové komory vo všeobecnosti uprednostňujú pri pilotnej a priemyselnej výrobe.
Ako sa reguluje teplota počas ultrazvukovej syntézy peptidov?
Keďže ultrazvukové ožarovanie dodáva energiu do reakčnej zmesi, je nevyhnutné zabezpečiť účinné chladenie. Ultrazvukové zariadenia spoločnosti Hielscher sú k dispozícii s nádobami s plášťom, externými výmenníkmi tepla, recirkuláciou s reguláciou teploty a pulzným ultrazvukovým ožarovaním, čím sa účinne zabraňuje prehriatiu. Zapojiteľné teplotné senzory a programovateľné teplotné limity umožňujú spoľahlivé monitorovanie a zaznamenávanie teploty počas celého vývoja a výroby.
Ako si vybrať ultrazvukový prístroj značky Hielscher na syntézu peptidov?
Voľba závisí od objemu šarže, požadovaného prietoku, rozpúšťadla, viskozity, koncentrácie tuhých látok alebo živice, požadovanej špecifickej energie a výrobného harmonogramu. Laboratórne testovanie stanovuje efektívne procesné rozmedzie, na základe ktorého je možné dimenzovať ultrazvukový prístroj Hielscher, sonotrodu a konfiguráciu prietokovej komory tak, aby zodpovedali zamýšľanej priepustnosti.
Literatúra / Referencie
- Merlino, F., Tomassi, S., Yousif, A. M., Messere, A., Marinelli, L., Grieco, P., Novellino, E., Cosconati, S., Di Maro, S. (2019): Boosting Fmoc Solid-Phase Peptide Synthesis by Ultrasonication. Organic Letters, 21(16), 2019. 6378–6382.
- M. Ramya, Veeranjaneyulu Avula, S. Nandeesh, B. Kirankumar, G. Nagendra (2025): TAG assisted and ultrasonication mediated total synthesis of lipobactin. Results in Chemistry, Volume 18, 2025, 102842.
- Silva, R., Franco Machado, J., Gonçalves, K., Lucas, F. M., Batista, S., Melo, R., Morais, T. S., & Correia, J. (2021): Ultrasonication Improves Solid Phase Synthesis of Peptides Specific for Fibroblast Growth Factor Receptor and for the Protein-Protein Interface RANK-TRAF6. Molecules (Basel, Switzerland), 26(23), 7349.
- Raheem, Shvan J; Schmidt, Benjamin W; Solomon, Viswas Raja; Salih, Akam K; Price, Eric W (2020): Ultrasonic-Assisted Solid-Phase Peptide Synthesis of DOTA-TATE and DOTA-linker-TATE Derivatives as a Simple and Low-Cost Method for the Facile Synthesis of Chelator-Peptide Conjugates. ACS Bioconjugate Chemistry, 2020.
- Salvatore Mottola, Alessandra Del Bene, Vincenzo Mazzarella, Roberto Cutolo, Ida Boccino, Francesco Merlino, Sandro Cosconati, Salvatore Di Maro, Anna Messere (2015): Sustainable Ultrasound-Assisted Solid-Phase peptide synthesis (SUS-SPPS): Less Waste, more efficiency. Ultrasonics Sonochemistry, Volume 114, 2025.
Spoločnosť Hielscher Ultrasonics vyrába vysokovýkonné ultrazvukové homogenizátory od laboratórium do priemyselná veľkosť.