Ultrazvuková syntéza peptidov pomocou techniky TAGGING

Syntéza peptidov je základným pilierom farmaceutického výskumu a vývoja, no konvenčné metódy – syntéza peptidov na pevnej fáze (SPPS) a klasické spájanie v roztoku – sú naďalej prácne, nehospodárne z hľadiska spotreby činidiel a ťažko škálovateľné. Účinnejšia alternatíva vznikla kombináciou dvoch ortogonálnych stratégií: techniky TAGGING (dočasná kotviaca skupina) na zostavovanie peptidov v roztoku a ultrazvukového (sonochemického) spracovania na urýchlenie krokov spájania, odstraňovania ochranných skupín a spracovania reakčných zmesí. Spoločne umožňujú výrobu terapeutických peptidov – ako je lipopeptid lipobaktín s antibiotickým a protinádorovým účinkom – od gramových množstiev až po veľkoobjemovú výrobu, s vysokou čistotou, zníženými nárokmi na čistenie a výrazne menším počtom manuálnych úkonov.

Aké výhody prináša ultrazvuková syntéza peptidov?

• Hospodárnosť syntézy v roztoku: Reakcie prebiehajú v roztoku s výrazne nižšou spotrebou aminokyselín než pri syntéze peptidov na pevnej fáze
• Čistenie založené na filtrácii: Peptid naviazaný na TAG sa vyzráža v polárnych rozpúšťadlách, takže medziprodukty sa izolujú jednoduchou filtráciou – bez potreby kolónovej chromatografie alebo charakterizácie po každom kroku.
• Obrovská úspora práce: Vynechanie čistenia medziproduktov a spektrálnych kontrol šetrí značný počet pracovných hodín počas celého syntetického procesu.
• Sonochemické urýchlenie: Sonikácia skracuje každý kľúčový krok – odstránenie ochrannej skupiny Fmoc, spájanie na bočnom reťazci, cyklizáciu a celkové odstránenie ochranných skupín – bez narušenia selektivity.
• Vysoké výťažky, vysoká čistota: Každé spájanie fragmentov aj konečné zostavenie lipobaktínu prebiehajú s vysokým výťažkom; celkové odstránenie ochranných skupín poskytuje cieľový produkt s výťažkom ~83 %.
• Pripravenosť na veľkoobjemovú výrobu: Technika TAGGING sa výslovne opisuje ako technika umožňujúca veľkoobjemovú prípravu peptidov s najvyššou čistotou, vďaka čomu predstavuje praktickú cestu ku gramovým a kilogramovým množstvám terapeuticky významných lipopeptidov.
• Úplná kompatibilita metódy: Tento prístup je plne kompatibilný s konvenčnou SPPS a chémiou v roztoku, takže existujúce stratégie používania ochranných skupín (Fmoc, Alloc, Pbf, tBu) a spájacie činidlá (T3P, HATU, COMU, DIC/DMAP) sa preberajú bez zmeny.

Čo je technika TAGGING?

Pri prístupe TAG je peptidový fragment kovalentne ukotvený k odstrániteľnej kotviacej skupine (TAG) podobnej živici, ktorá zostáva v roztoku. To umožňuje manipulovať s rastúcim reťazcom ako s peptidom na pevnej fáze, ale v kvapalnej fáze:

• Po každom spájaní alebo odstránení ochranných skupín sa peptid naviazaný na TAG získava v pevnej forme jednoduchou filtráciou alebo zrážaním v polárnych médiách alebo médiách s antisolventom, zatiaľ čo rozpustné nečistoty a vedľajšie produkty sa odmyjú.
• Keďže peptid zostáva pripojený k spojovacej skupine, kolónová chromatografia a úplná charakterizácia každého medziproduktu sa do značnej miery vynechávajú, čo šetrí značné množstvo času a ľudskej práce.
• Reakcie môžu prebiehať v roztoku s oveľa nižšou spotrebou aminokyselín než pri SPPS a konečný produkt sa uvoľní odštiepením skupiny TAG ku koncu syntézy.

 
Pri retrosyntéze lipobaktínu sa použili tri fragmenty – Fmoc-Ala-Arg-TAG, Alloc-Thr(Ile-Fmoc)-OH a lipidový fragment C₁₁H₂₃CONH-Ile-Ser(OᵗBu)-OH – ktoré sa spojili stratégiou kondenzácie fragmentov, čím sa získal dlhý peptid s veľmi vysokými výťažkami. (porov. Ramya et al., 2025)

Úplná syntéza peptidu lipobaktínu s využitím TAG sa urýchľuje sonikáciou.
(Štúdia: Ramya et al., 2025)

Ako sonikácia zlepšuje syntézu peptidov v roztoku

Ultrazvukové spracovanie sa používa na zintenzívnenie a skrátenie kľúčových krokov v roztoku. Pri syntéze lipobaktínu, ktorú opísali Ramya et al. (2025), sa sonikácia používa na:

Keďže chémia TAG už poskytuje medziprodukty vo forme filtrovateľných tuhých látok, ultrazvukové spracovanie a technika TAGGING sa navzájom dopĺňajú: ultrazvuk urýchľuje prenos hmoty, miešanie a reakčnú kinetiku, zatiaľ čo kotviaca skupina udržiava peptid vo forme izolovateľnej tuhej látky, čo umožňuje čistý pracovný postup s minimálnym využitím chromatografie.

Jednoduché zväčšovanie rozsahu výroby peptidov s vysokou čistotou pomocou sonikácie

Častou výzvou pri prechode procesov syntézy peptidov a peptidových liečiv z laboratória do výroby je zachovanie sonochemického účinku pri väčších objemoch a kontinuálnom prietoku. Hielscher to rieši uceleným radom ultrazvukových procesorov od laboratórnej až po plnú priemyselnú mierku, ktoré poskytujú validovaný, reprodukovateľný výkon a zdokumentované riadenie procesu.
 

Priemyselný sonikátor UIP4000hdT (4000W, 20kHz) na ultrazvukom zintenzívnenú syntézu peptidov

Literatúra / Referencie

• M. Ramya, Veeranjaneyulu Avula, S. Nandeesh, B. Kirankumar, G. Nagendra (2025): TAG assisted and ultrasonication mediated total synthesis of lipobactin. Results in Chemistry, Volume 18, 2025, 102842.
• Andrew M. Bray; Liana M. Lagniton; Robert M. Valerio; N.Joe Maeji (1994): Sonication-assisted cleavage of hydrophobic peptides. Application in multipin peptide synthesis. Tetrahedron Letters 35(48), 1994. 9079–9082.
• Raheem, Shvan J; Schmidt, Benjamin W; Solomon, Viswas Raja; Salih, Akam K; Price, Eric W (2020): Ultrasonic-Assisted Solid-Phase Peptide Synthesis of DOTA-TATE and DOTA-linker-TATE Derivatives as a Simple and Low-Cost Method for the Facile Synthesis of Chelator-Peptide Conjugates. ACS Bioconjugate Chemistry, 2020.
• M.V. Anuradha, B. Ravindranath (1995): Ultrasound in peptide synthesis. 4: Rapid cleavage of polymer-bound protected peptides by alkali and alkanolamines. Tetrahedron Volume 51, Issue 19, 1995. 5675-5680.