Ultrazvuková syntéza peptidov pomocou techniky TAGGING
Syntéza peptidov je základným kameňom farmaceutického výskumu a vývoja, avšak konvenčné metódy – syntéza peptidov v pevnej fáze (SPPS) a klasické spájanie v roztoku – naďalej vyžadujú veľkú pracovnú náročnosť, sú spojené s plytváním reagentmi a ťažko sa dajú škálovať. Účinnejšia alternatíva sa objavila v kombinácii dvoch ortogonálnych stratégií: techniky TAGGING (temporary anchoring group) na zostavovanie peptidov v roztoku a ultrazvukového (sonochemického) spracovania na urýchlenie krokov kopulácie, deprotekcie a spracovania. Spoločne umožňujú výrobu terapeutických peptidov v gramovom až veľkom meradle. – ako napríklad lipopeptid lipobaktín s antibiotickým a protinádorovým účinkom – s vysokou čistotou, zníženou náročnosťou na čistenie a výrazne menším počtom ručných úkonov.
Aké výhody prináša ultrazvuková syntéza peptidov?
- Ekonomika v roztoku: Reakcie prebiehajú v roztoku s výrazne nižšou spotrebou aminokyselín ako pri syntéze peptidov v pevnej fáze
- Čistenie založené na filtrácii: Peptid viazaný na TAG sa vysráža v polárnych rozpúšťadlách, takže medziprodukty sa izolujú jednoduchou filtráciou – nie je potrebná kolónová chromatografia ani charakterizácia v jednotlivých krokoch.
- Výrazné úspory pracovnej sily: Vylúčenie medzilehlých čistení a spektrálnych kontrol šetrí značné množstvo pracovných hodín v priebehu celej syntetickej kampane.
- Sonochemické urýchlenie: Ultrazvuková úprava skracuje každý kľúčový krok – Odstránenie Fmoc-ochranného skupiny, kopulácia bočných reťazcov, cyklizácia a celkové odstránenie ochranných skupín – bez toho, aby došlo k zníženiu selektivity.
- Vysoká výťažnosť, vysoká čistota: Každá konjugácia fragmentov aj konečná syntéza lipobaktínu prebiehajú s vysokou výťažnosťou; celková deprotekcia vedie k získaniu cieľovej látky s výťažnosťou približne 83 %.
- Pripravenosť na veľkovýrobu: Technika TAGGING je výslovne opísaná ako metóda umožňujúca hromadnú prípravu peptidov s najvyššou čistotou, čo z nej robí praktický spôsob na získanie gramových a kilogramových množstiev terapeuticky dôležitých lipopeptidov.
- Úplná kompatibilita metód: Tento prístup je plne kompatibilný s konvenčnou SPPS a chémiou v roztoku, takže existujúce stratégie ochranných skupín (Fmoc, Alloc, Pbf, tBu) a kopulačné činidlá (T3P, HATU, COMU, DIC/DMAP) sa dajú použiť bez zmien.
Povedzte nám o výzvach, s ktorými sa stretávate pri syntéze peptidov. Naši odborníci na ultrazvukovú technológiu vám odporučia ideálnu konfiguráciu ultrazvukového zariadenia pre vaše ciele v oblasti výroby peptidov!
Priemyselný sonikátor UIP2000hdT s reaktorom na výrobu farmaceutických šarží určeným na zefektívnenie syntézy peptidov
Čo je to technika TAGGING?
Pri TAG metóde je peptidový fragment kovalentne viazaný na odstrániteľnú, živicovú kotviacu skupinu (TAG), ktorá zostáva v roztoku. Vďaka tomu je možné s rastúcim reťazcom pracovať ako s peptidom v pevnej fáze, avšak v kvapalnej fáze:
- Po každom spojení alebo odstránení ochranných skupín sa peptid viazaný na TAG získava v pevnom stave jednoduchou filtráciou alebo zrážaním v polárnych/antisolventných médiách, pričom rozpustné nečistoty a vedľajšie produkty sa vyplavia.
- Keďže peptid zostáva naviazaný na spojovací reťazec, kolónová chromatografia a úplná charakterizácia každého medziproduktu sa v podstate eliminujú, čo prináša značnú úsporu času a ľudských zdrojov.
- Reakcie je možné uskutočňovať v roztokovom prostredí, pričom sa spotrebuje oveľa menej aminokyselín ako pri metóde SPPS, a konečný produkt sa uvoľní odštiepením TAG-skupiny tesne pred ukončením syntézy.
Pri lipobaktíne sa pri retro-syntéze použili tri fragmenty – Fmoc-Ala-Arg-TAG, Alloc-Thr(Ile-Fmoc)-OH a lipidový fragment C₁₁H₂₃CONH-Ile-Ser(OᵗBu)-OH – v kombinácii so stratégiou kondenzácie fragmentov s cieľom získať dlhý peptid s veľmi vysokou výťažnosťou. (porov. Ramya a kol., 2025)
Kompletná syntéza peptidu lipobaktínu s využitím technológie TAG je urýchlená ultrazvukovým ožiarením.
(Štúdia: Ramya a kol., 2025)
Ako ultrazvuk zlepšuje syntézu peptidov v roztoku
Ultrazvuk sa používa na zintenzívnenie a skrátenie kľúčových krokov v roztokovom fázovom procese. Pri syntéze lipobaktínu, ako ju opisujú Ramya a kol. (2025), sa ultrazvukové ožarovanie využíva na:
Keďže chemický proces TAG už produkuje medziprodukty vo forme filtrovateľných pevných látok, ultrazvuková úprava a TAGGING sa navzájom dopĺňajú: ultrazvuk urýchľuje prenos hmoty, miešanie a reakčnú kinetiku, zatiaľ čo kotva udržuje peptid vo forme izolovateľnej pevnej látky, čo umožňuje čistý pracovný postup s minimálnym využitím chromatografie.
Sonicator UP200St: Reaktor s ultrazvukovým miešaním na urýchlenú syntézu peptidov.
Jednoduché zväčšovanie objemu výroby peptidov s vysokou čistotou pomocou ultrazvuku
Častým problémom pri prechode procesov spracovania peptidov a peptidových liekov z laboratória do výroby je zachovanie sonochemického účinku pri väčších objemoch a v režime kontinuálneho toku. Spoločnosť Hielscher rieši tento problém prostredníctvom kompletnej rady ultrazvukových zariadení od laboratórneho až po plne priemyselný rozsah, ktoré poskytujú overený, reprodukovateľný výkon a zdokumentovanú kontrolu procesu.
Priemyselný ultrazvukový prístroj UIP4000hdT (4000 W, 20 kHz) pre syntézu peptidov s využitím ultrazvuku
Často kladené otázky týkajúce sa syntézy peptidov TAG s využitím ultrazvuku
Čo je syntéza peptidov v kvapalnej fáze (LPPS)?
Syntéza peptidov v kvapalnej fáze (LPPS) je metóda postupného vytvárania peptidov v roztoku s využitím klasických nástrojov organickej chémie. Je to jedna zo štyroch hlavných metód syntézy peptidov a je známa tým, že je nákladovo efektívna, škálovateľná a zároveň najekologickejšia spomedzi všetkých prístupov k syntéze peptidov. Je obzvlášť vhodná pre kratšie peptidy, hoci pri dlhších sekvenciách môže nastať problém s udržaním konzistentných reakcií, rozpustnosti a odstraňovaním nežiaducich vedľajších produktov.
Ako ultrazvuk zlepšuje syntézu peptidov v kvapalnej fáze?
Ultrazvuk (sonikácia) zvyšuje účinnosť LPPS tým, že urýchľuje ako fázu viazania, tak aj fázu odstraňovania ochranných skupín. Ultrazvukové vlny zlepšujú prenos hmoty a reakčnú kinetiku, čo vedie k:
- Skrátenie reakčných časov: cykly zapínania a vypínania ochrany sa dajú výrazne skrátiť
- Vyššie výnosy: úplnejšia konverzia v každom kroku
- Zlepšená čistota surového produktu: menej neúplných vedľajších produktov kopulácie
- Nižšia spotreba činidiel: vďaka rýchlejším a efektívnejším reakciám je potrebné menšie množstvo ekvivalentov kopulačných činidiel a aminokyselín
Čo je syntéza peptidov s využitím technológie TAG (TAPS)?
Syntéza peptidov s využitím značiek (TAPS) je špeciálny prípad syntézy peptidov v kvapalnej fáze, pri ktorej sa peptidy postupne vytvárajú v roztoku s využitím rozpustných organických značiek namiesto pevného nosiča. Tieto značky, podobne ako pevné nosiče v SPPS, zjednodušujú izoláciu po každom kroku syntézy tým, že umožňujú separáciu prostredníctvom zrážania, filtrácie alebo extrakcie. Značky sa musia rozpúšťať v organických rozpúšťadlách a zároveň sa musia odlišovať od ostatných materiálov.
Ako ultrazvuk zefektívňuje proces ZNAČKOVANIA?
Ak sa ultrazvuková liečba kombinuje so syntézou podporovanou technológiou TAG, medzi jej výhody patria:
- Rýchlejšie cykly pripájania a odpojenia ochrany – ultrazvuk urýchľuje reakcie v roztoku, čím skracuje čas potrebný na každý krok
- Zlepšená rozpustnosť a prenos hmoty – ultrazvuková kavitácia pomáha udržiavať homogénnosť značeného peptidu v roztoku, čo je kľúčové, keďže rozpustnosť je hlavnou výhodou metódy TAPS oproti metóde SPPS
- Znížené množstvo pridaného činidla – vyššia účinnosť reakcie znamená, že je potrebné menej ekvivalentov aminokyselín a kopulačných činidiel
- Úplnejšie reakcie – zníženie množstva vedľajších produktov neúplného kopulovania, čo vedie k vyššej čistote suroviny a zjednodušenému následnému čisteniu
Významným príkladom je totálna syntéza lipobaktínu s využitím techniky TAG a za pomoci ultrazvuku, ktorá preukázala, že technika TAGGING je plne kompatibilná s metódami v roztoku a že ultrazvuk zabezpečuje vysoké výťažky v každom kroku. (porov. Ramya et al., 2025)
Aké dĺžky peptidov je možné dosiahnuť pomocou metódy TAPS s využitím ultrazvuku?
Krátke až stredne dlhé peptidy (~5–20 aminokyselín) predstavujú ideálny rozsah, v ktorom metóda TAPS poskytuje vysokú čistotu a spoľahlivé výsledky.
K dlhším peptidom je možné dospieť prostredníctvom stratégie kondenzácie fragmentov: menšie fragmenty (6–10-mery) sa syntetizujú na nosiči a následne sa spájajú, čím vznikne cieľový peptid v plnej dĺžke.
V prípade veľmi dlhých alebo zložitých cieľov je možné použiť hybridný prístup SPPS/TAPS.
Zistite, ako ultrazvuk zlepšil syntézu peptidov v pevnej fáze (SPPS)!
Je možné syntézu peptidov v kvapalnej fáze s využitím ultrazvuku rozšíriť na priemyselnú výrobu?
Áno, priemyselné ultrazvukové zariadenia – ako napríklad modely Hielscher UIP2000hdT alebo UIP4000hdT – možno integrovať do šaržových reaktorov a prietokových komôr, čo umožňuje výrobu peptidov vo veľkom meradle. Dodatočná inštalácia do existujúcich reaktorov umožňuje zdokonaliť zavedené procesy syntézy peptidov.
Aké sú hlavné výhody ultrazvukového LPPS v porovnaní s konvenčným LPPS?
- Rýchlosť: Reakčné časy sa pri každom kroku kopulácie a odstránenia ochranných skupín výrazne skrátili.
- Účinnosť: Vyššie výťažky na jednotlivý krok vedú k vyššiemu celkovému výťažku v prípade peptidov s viacerými zvyškami.
- Udržateľnosť: menší počet ekvivalentov činidiel a potenciálne menšie množstvo rozpúšťadla vďaka rýchlejším reakciám.
- Prístupnosť: vyžaduje iba štandardnú ultrazvukovú vaňu, žiadne špecializované prístroje.
- Kompatibilita: je kompatibilný so štandardnými kopulačnými činidlami (DIC, HATU, TBTU, Oxyma atď.) a stratégiami ochranných skupín (Boc, Fmoc).
Literatúra / Referencie
- M. Ramya, Veeranjaneyulu Avula, S. Nandeesh, B. Kirankumar, G. Nagendra (2025): TAG assisted and ultrasonication mediated total synthesis of lipobactin. Results in Chemistry, Volume 18, 2025, 102842.
- Andrew M. Bray; Liana M. Lagniton; Robert M. Valerio; N.Joe Maeji (1994): Sonication-assisted cleavage of hydrophobic peptides. Application in multipin peptide synthesis. Tetrahedron Letters 35(48), 1994. 9079–9082.
- Raheem, Shvan J; Schmidt, Benjamin W; Solomon, Viswas Raja; Salih, Akam K; Price, Eric W (2020): Ultrasonic-Assisted Solid-Phase Peptide Synthesis of DOTA-TATE and DOTA-linker-TATE Derivatives as a Simple and Low-Cost Method for the Facile Synthesis of Chelator-Peptide Conjugates. ACS Bioconjugate Chemistry, 2020.
- M.V. Anuradha, B. Ravindranath (1995): Ultrasound in peptide synthesis. 4: Rapid cleavage of polymer-bound protected peptides by alkali and alkanolamines. Tetrahedron Volume 51, Issue 19, 1995. 5675-5680.
Ultrazvukový CupHorn na intenzívne sonikovanie uzavretých skúmaviek a injekčných liekoviek pri sterilnom sonikovaní peptidov.
Spoločnosť Hielscher Ultrasonics vyrába vysokovýkonné ultrazvukové homogenizátory od laboratórium do priemyselná veľkosť.