Zlepšenie HPLC analýzy spoľahlivou prípravou vzoriek
Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (HPLC) zostáva jednou z najdôležitejších analytických techník na identifikáciu a kvantifikáciu zlúčenín v komplexných matriciach. Metódy HPLC sú cenené pre svoju citlivosť, selektivitu a reprodukovateľnosť, od kontroly kvality liekov až po monitorovanie životného prostredia a analýzu potravín. Spoľahlivosť chromatografických údajov však vo veľkej miere závisí od jedného kľúčového kroku: prípravy vzorky HPLC.
Research and sample prep routines demonstrate that sonication-assisted extraction and sample preparation significantly improve the efficiency, accuracy, and speed of HPLC analysis. By using ultrasonic energy to disrupt matrices and enhance analyte transfer into solvents, laboratories can obtain higher recoveries, shorter extraction times, and more reproducible analytical results.
Prečo je príprava vzoriek v HPLC dôležitá
V mnohých analytických pracovných postupoch sa matrica vzorky – ako je rastlinný materiál, biologické tkanivo, pôda alebo voda. – obsahuje komplexné zmesi zlúčenín, ktoré môžu interferovať s chromatografickou separáciou. Preto je potrebná účinná príprava vzorky, aby sa izolovali analyty, odstránili rušivé látky a koncentrovali cieľové zlúčeniny pred vstreknutím do systému HPLC.
Tradičné extrakčné techniky často zahŕňajú zdĺhavé postupy, veľké objemy organických rozpúšťadiel a viaceré kroky čistenia. Tieto metódy môžu vniesť variabilitu, zvýšiť prevádzkové náklady a predĺžiť celkový čas analýzy.
Ultrazvuková príprava vzoriek ponúka účinnú alternatívu. Sonikáciou sa do kvapalného prostredia vnáša vysokofrekvenčná akustická energia, ktorá vytvára mikroskopické kavitačné bubliny. Keď tieto bubliny kolabujú, vytvárajú lokalizované strihové sily a mikromiešacie efekty, ktoré narúšajú pevné matrice a urýchľujú prenos hmoty. Tento proces výrazne zvyšuje účinnosť extrakcie.
UIP400MTP vysokovýkonný sonikátor so stojanom na skúmavky pre autosamplerové fľaštičky
Vedecké dôkazy: Sonikácia zlepšuje analytický výkon
Viaceré recenzované štúdie preukázali výhody ultrazvukovej extrakcie v pracovných postupoch HPLC.
Napríklad metóda vyvinutá na monitorovanie rezíduí pesticídov vo vzorkách vody využívala na stanovenie koncentrácií pesticídov karbarylu sonikáciu v kombinácii s analýzou LC-MS/MS. Pri tomto prístupe sa vzorky vody pred chromatografickou analýzou extrahovali acetonitrilom pri ultrazvukovej úprave. Metóda dosiahla vysokú analytickú výkonnosť vrátane výťažnosti medzi 89,53 % a 101,72 %, čo potvrdzuje presnosť a spoľahlivosť postupu ultrazvukovej prípravy vzoriek.
Krok ultrazvukovej extrakcie umožnil účinný prenos analytov z vodnej matrice do organického rozpúšťadla, čím sa znížila spotreba rozpúšťadla a eliminovala potreba rozsiahlych čistiacich postupov. Validovaná analytická metóda preukázala vynikajúcu linearitu, presnosť a limity kvantifikácie, čo poukazuje na účinnosť sonikácie v moderných chromatografických pracovných postupoch. (porovnaj Roudani et al., 2018)
V ďalšej štúdii sa zaviedla ultrazvukom asistovaná matricová disperzia v tuhej fáze (UA-MSPD) na stanovenie oleuropeínu v listoch olív pomocou analýzy HPLC. Pri tejto technike sa rastlinný prášok a sorpčný materiál zmiešali a potom sa počas elučného kroku vystavili ultrazvukovým vlnám. Ultrazvuk zvýšil desorpciu analytu z povrchu sorbentu a zároveň zlepšil extrakciu z matrice vzorky. (porovnaj Rashidipour a Heydari, 2018)
Optimalizovaný ultrazvukový postup priniesol významné analytické zlepšenia vrátane:
- Lineárne kalibračné krivky s R² = 0,9979
- Limity detekcie až do 0,03 µg ml-¹
- Miera obnovy od 90,2 % do 96,7 %
Tieto výsledky potvrdzujú, že ultrazvukom asistovaná extrakcia nielen urýchľuje prípravu vzorky, ale aj zvyšuje výťažnosť extrakcie v porovnaní s klasickými technikami disperzie v pevnej fáze s matricou.
Sondový sonikátor UP200St na prípravu vzoriek HPLC
Hlavné výhody ultrazvukovej prípravy vzoriek pre HPLC
Rastúce zavádzanie ultrazvukovej extrakcie v analytických laboratóriách je spôsobené niekoľkými merateľnými výhodami.
- Vyššia účinnosť extrakcie
Akustická kavitácia rozkladá pevné matrice a zlepšuje prienik rozpúšťadla. To zlepšuje uvoľňovanie analytu a zvyšuje mieru výťažnosti, najmä v prípade stopových zlúčenín v komplexných vzorkách. - Skrátenie času prípravy vzorky
Ultrazvuková extrakcia môže často dokončiť prípravu vzorky v priebehu niekoľkých sekúnd alebo minút. Napríklad optimalizované parametre ultrazvukovej extrakcie v UA-MSPD dosiahli účinnú regeneráciu analytov približne za 30 sekúnd sonikácie, čo dokazuje, ako výrazne možno urýchliť pracovné postupy analýzy. - Nižšia spotreba rozpúšťadiel
Keďže ultrazvuk zlepšuje prenos hmoty, zvyčajne sú potrebné menšie objemy rozpúšťadla. Znížené používanie rozpúšťadiel zlepšuje udržateľnosť laboratória a znižuje prevádzkové náklady. - Zlepšená reprodukovateľnosť
Rovnomerné rozloženie ultrazvukovej energie zabezpečuje konzistentné narušenie a extrakciu vzorky v rôznych opakovaniach, čo vedie k vyššej presnosti analytických meraní. - Kompatibilita s modernými chromatografickými metódami
Ultrazvuková extrakcia sa ľahko integruje so systémami HPLC, UHPLC a LC-MS, takže je vhodná pre vysoko výkonné analytické prostredia.
HPLC chromatogram fenolových zlúčenín z ultrazvukom izolovaného extraktu listov Annona muricata pomocou ultrazvuku UP400S.
(Štúdia a grafika: ©Nolasco-González et al., 2022)
Praktické sonizačné riešenia na prípravu vzoriek HPLC
For laboratories implementing ultrasonic extraction, Hielscher sonicators provide precise control over parameters such as amplitude, time, and pulse mode. Therefore, Hielscher lab sonicators are particularly suitable for analytical laboratories.
Vyberte si najvhodnejší sonikátor pre svoje vzorky HPLC
| Model Sonicator | Výhody pre HPLC | Najlepšie využitie pri príprave vzoriek HPLC |
| VialTweeter Multi-Tube Sonicator |
- Súčasná sonikácia až 10 uzavretých fľaštičiek s rovnakou ultrazvukovou energiou - Sterilné: Žiadna krížová kontaminácia, pretože vzorky zostávajú uzavreté - Vysoko reprodukovateľné extrakčné podmienky v rôznych šaržiach - Účinná kavitácia pre analytické vzorky s malým objemom |
- Vysoko výkonná príprava environmentálnych, potravinových alebo farmaceutických vzoriek - Extrakcia stopových analytov pred analýzou HPLC, UHPLC alebo LC-MS - Štandardizované pracovné postupy vyžadujúce identické spracovanie viacerých vzoriek |
| Ultrazvukové UIP400MTP mikrodoštičiek |
- Bezkontaktná sonikácia celých mikroplatničiek (96-jamkové, 384-jamkové formáty) - Rovnomerné rozloženie ultrazvukovej energie vo všetkých vrtoch - Umožňuje automatizáciu a robotickú integráciu analytických pracovných postupov - Vysoký výkon s presnou kontrolou amplitúdy a času sonikácie |
- Vysokovýkonné pracovné postupy skríningu UHPLC - Knižnice farmaceutických zlúčenín a príprava vzoriek na metabolomiku - Extrakcia na báze platní pre analytické potrubia LC-MS alebo UHPLC |
| Laboratórne sonikátory s mikrohrotom (priama sonikácia) |
- Maximálna intenzita ultrazvuku na účinné narušenie matrice - Veľmi rýchla extrakcia analytov z pevných, viskóznych alebo heterogénnych vzoriek - Nastaviteľná amplitúda a parametre impulzov na optimalizáciu podmienok extrakcie - Vysoká energia kavitácie zlepšuje výťažnosť analytov a extrakciu |
- Extrakcia z náročných matríc, ako sú rastlinné tkanivá, vzorky potravín alebo polyméry - Homogenizácia pred SPE, filtráciou alebo extrakciou kvapalina-kvapalina - Vývoj metódy pre ultrazvukovú prípravu vzoriek HPLC |
| Cuphorn (“vysoko intenzívny kúpeľ” pre kadičky a skúmavky) |
- Nepriama sonikácia zabraňuje kontaminácii sondy - Rovnomerné ultrazvukové pole pre viacero trubíc súčasne - Ideálne pre sterilné, nebezpečné alebo prchavé vzorky, ktoré musia zostať uzavreté - Zjednodušuje manipuláciu pri zachovaní silnej kavitačnej energie |
- Paralelná extrakcia viacerých vzoriek HPLC v uzavretých odstredivkách - Príprava biologických, farmaceutických alebo environmentálnych vzoriek - Pracovné postupy, pri ktorých sa vyžaduje nepriama sonikácia bez kontaminácie |
Vedecký význam pre analytickú chémiu
Keďže analytická chémia smeruje k rýchlejším a udržateľnejším laboratórnym postupom, ultrazvuková príprava vzoriek sa stala výkonnou technológiou. Sonikácia podporuje vývoj rýchlych analytických metód s nižšou spotrebou rozpúšťadiel, vyššou účinnosťou extrakcie a robustnými validačnými parametrami.
Narastajúci počet literatúry o ultrazvukovej extrakcii dokazuje, že príprava vzoriek HPLC pomocou sonikácie nie je len pohodlná – je to vedecky overený prístup, ktorý zvyšuje analytický výkon. Kombináciou ultrazvukovej extrakcie s modernými chromatografickými technikami môžu laboratóriá dosiahnuť spoľahlivú detekciu stopových analytov v čoraz zložitejších matriciach vzoriek.
Pracovné postupy HPLC so sonikáciou
S neustálym pokrokom v analytickom prístrojovom vybavení a technológiách prípravy vzoriek bude ultrazvuková extrakcia pravdepodobne zohrávať ešte väčšiu úlohu v chromatografických laboratóriách. Jej schopnosť zefektívniť pracovné postupy, zlepšiť kvalitu údajov a znížiť vplyv na životné prostredie je v súlade s vyvíjajúcimi sa požiadavkami modernej analytickej vedy.
Pre analytických chemikov a priemyselné laboratóriá, ktoré sa snažia optimalizovať prípravu vzoriek HPLC, ponúka ultrazvuková extrakcia osvedčené, škálovateľné a vedecky robustné riešenie. Integráciou sonikácie do rutinných protokolov prípravy vzoriek môžu laboratóriá výrazne zvýšiť účinnosť aj spoľahlivosť chromatografickej analýzy.
Dizajn, výroba a poradenstvo – Kvalita vyrobená v Nemecku
Ultrazvukové prístroje Hielscher sú známe svojou najvyššou kvalitou a dizajnovými štandardmi. Robustnosť a jednoduchá obsluha umožňujú bezproblémovú integráciu našich ultrazvukových prístrojov do priemyselných zariadení. Drsné podmienky a náročné prostredie ľahko zvládnu ultrazvukové prístroje Hielscher.
Hielscher Ultrasonics je spoločnosť s certifikáciou ISO a kladie osobitný dôraz na vysokovýkonné ultrazvukové prístroje s najmodernejšou technológiou a užívateľskou prívetivosťou. Ultrazvukové prístroje Hielscher sú samozrejme v súlade s CE a spĺňajú požiadavky UL, CSA a RoHs.
Literatúra / Referencie
- M. Rashidipour and R. Heydari (2018): Ultrasonic-Assisted Matrix Solid-Phase Dispersion and High-Performance Liquid Chromatography as an Improved Methodology for Determination of Oleuropein from Olive Leaves. Analytical and Bioanalytical Chemistry Research 52, 2018. 307-316.
- Roudani, A.; Rachid, Mamouni; Nabil, Saffaj; Laknifli, A.; Gharby, Said; Noureddine, El Baraka; Bakka, Abdelhamid; Abdellah, Faouzi (2018): Method validation in the determination of Carbaryl pesticide in water samples using sonication and liquid chromatography-tandem mass spectrometry. JMES 8 (7), 2017. 2409-2420.
- Bimakr M., Ganjloo A., Zarringhalami S., Ansarian E. (2017): Ultrasound-assisted extraction of bioactive compounds from Malva sylvestris leaves and its comparison with agitated bed extraction technique. Food Science and Biotechnology 2017 Nov 30;26(6):1481-1490.
často kladené otázky
Čo je HPLC?
Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (HPLC) je analytická separačná technika používaná na identifikáciu, kvantifikáciu a čistenie zložiek v zmesi. Pri HPLC kvapalná mobilná fáza prenáša rozpustené analyty cez kolónu naplnenú stacionárnou fázou pod vysokým tlakom. Rozdiely v interakciách medzi analytmi, stacionárnou fázou a mobilnou fázou spôsobujú, že zlúčeniny sa pri prechode kolónou oddeľujú. Detektory ako UV-Vis, fluorescencia alebo hmotnostná spektrometria merajú oddelené zlúčeniny, čo umožňuje presnú kvalitatívnu a kvantitatívnu analýzu.
Aké sú typy kvapalinovej chromatografie?
Kvapalinovú chromatografiu možno klasifikovať podľa použitého separačného mechanizmu medzi analytom, stacionárnou fázou a mobilnou fázou. Najbežnejšími typmi sú chromatografia na obrátenej fáze, kde nepolárna stacionárna fáza oddeľuje zlúčeniny na základe hydrofóbnych interakcií; chromatografia na normálnej fáze, ktorá používa polárnu stacionárnu fázu a oddeľuje zlúčeniny podľa polarity; iónovo-výmenná chromatografia, kde nabité stacionárne fázy oddeľujú analyty na základe iónových interakcií; a chromatografia s vylučovaním veľkosti, ktorá oddeľuje molekuly podľa ich hydrodynamickej veľkosti a molekulovej hmotnosti. Medzi ďalšie špecializované metódy patrí afinitná chromatografia a chromatografia s hydrofilnými interakciami (HILIC), ktoré sú zamerané na špecifické molekulové interakcie alebo polárne zlúčeniny.
Aké fľaštičky sa používajú na HPLC?
Pri analýzach HPLC sa zvyčajne používajú malé sklenené alebo polymérové fľaštičky určené na uchovávanie pripravených vzoriek pred vstreknutím do chromatografického systému. Najbežnejším formátom je 2-mililitrová autosamplerová fľaštička, ktorá je kompatibilná s väčšinou HPLC autosamplerov. Tieto fľaštičky sú zvyčajne vyrobené z borosilikátového skla, aby sa zabezpečila chemická odolnosť a minimálna interakcia s rozpúšťadlami a analytmi. V závislosti od typu vzorky môžu liekovky obsahovať vložky pre vzorky s malým objemom, skrutkovacie uzávery alebo uzávery s krimpovaným vrchnákom a septa z materiálov, ako je PTFE/silikón, na zachovanie integrity vzorky.
Čo sú autosamplerové fľaštičky?
Autosamplerové fľaštičky sú špecializované nádobky na vzorky určené pre automatické vstrekovacie systémy v prístrojoch HPLC a UHPLC. Uchovávajú pripravený roztok vzorky a umiestňujú sa do zásobníka autosamplera prístroja, odkiaľ systém automaticky odoberie definovaný objem na vstreknutie do chromatografickej kolóny. Vialky autosamplera sa vyrábajú s presnými rozmermi, aby sa zabezpečila kompatibilita s robotickými odberovými ihlami a minimalizovalo sa odparovanie, kontaminácia alebo adsorpcia vzorky. Ich konštrukcia umožňuje reprodukovateľnú, vysoko výkonnú analýzu v moderných chromatografických laboratóriách.
Aké sú kroky v HPLC?
Typický pracovný postup vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie (HPLC) pozostáva z niekoľkých postupných krokov, ktoré zabezpečujú spoľahlivú separáciu a detekciu analytov.
- Najprv sa vykoná príprava vzorky s cieľom rozpustiť analyt, odstrániť pevné častice a často extrahovať alebo koncentrovať cieľové zlúčeniny z matrice vzorky. Tento krok môže zahŕňať filtráciu, riedenie alebo extrakčné techniky, ako je ultrazvuková extrakcia, extrakcia na tuhej fáze alebo extrakcia kvapalina-kvapalina.
- Potom sa pripravená vzorka vloží do nádobky HPLC a vloží sa do autosamplera. Autosampler vstrekne presný objem vzorky do prúdiacej mobilnej fázy.
- Fáza dodávania mobilnej fázy potom prenáša vstreknutú vzorku systémom pomocou vysokotlakového čerpadla. Mobilná fáza prenáša analyty cez chromatografickú kolónu pri riadenom prietoku.
- Vo vnútri chromatografickej kolóny dochádza k separácii. Kolóna obsahuje stacionárnu fázu, zvyčajne balené častice s definovanými chemickými vlastnosťami. Ako analyty prechádzajú kolónou, rôzne interagujú so stacionárnou fázou a mobilnou fázou, čo spôsobuje ich elúciu v rôznom čase.
- Po separácii zlúčeniny prechádzajú cez detektor, napríklad UV-Vis, fluorescenčný alebo hmotnostný spektrometrický detektor. Detektor meria prítomnosť a koncentráciu eluovaných zlúčenín a prevádza signál na elektronické údaje.
- Nakoniec sa získavanie a analýza údajov vykonáva pomocou chromatografického softvéru. Systém vygeneruje chromatogram, v ktorom píky zodpovedajú jednotlivým zlúčeninám. Retenčné časy vrcholov pomáhajú identifikovať analyty, zatiaľ čo plochy alebo výšky vrcholov umožňujú kvantitatívne určiť ich koncentráciu.
Spoločnosť Hielscher Ultrasonics vyrába vysokovýkonné ultrazvukové homogenizátory od laboratórium do priemyselná veľkosť.