Zlepšite analýzu HPLC spoľahlivou prípravou vzoriek
Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (HPLC) zostáva jednou z najdôležitejších analytických techník na identifikáciu a kvantifikáciu zlúčenín v komplexných matriciach. Metódy HPLC sa cenia pre svoju citlivosť, selektivitu a reprodukovateľnosť v oblastiach od kontroly kvality farmaceutických výrobkov cez monitorovanie životného prostredia až po analýzu potravín. Spoľahlivosť chromatografických údajov však vo veľkej miere závisí od jedného kľúčového kroku: prípravy vzoriek na HPLC.
Výskum a rutinné postupy prípravy vzoriek preukazujú, že extrakcia a príprava vzoriek podporované sonikáciou výrazne zlepšujú účinnosť, správnosť a rýchlosť analýzy HPLC. Využitím ultrazvukovej energie na narušenie matríc a zlepšenie prenosu analytov do rozpúšťadiel môžu laboratóriá dosiahnuť vyššie výťažnosti, kratšie časy extrakcie a reprodukovateľnejšie analytické výsledky.
Prečo je príprava vzoriek pri HPLC dôležitá
V mnohých analytických pracovných postupoch obsahuje matrica vzorky – napríklad rastlinný materiál, biologické tkanivo, pôda alebo voda – komplexné zmesi zlúčenín, ktoré môžu narúšať chromatografickú separáciu. Účinná príprava vzoriek je preto nevyhnutná na izoláciu analytov, odstránenie rušivých látok a zakoncentrovanie cieľových zlúčenín pred nástrekom do systému HPLC.
Tradičné extrakčné techniky často zahŕňajú zdĺhavé postupy, veľké objemy organických rozpúšťadiel a viacero krokov čistenia. Tieto metódy môžu vnášať variabilitu, zvyšovať prevádzkové náklady a predlžovať celkový čas analýzy.
Ultrazvuková príprava vzoriek ponúka účinnú alternatívu. Sonikácia vnáša do kvapalného média vysokofrekvenčnú akustickú energiu, čím vznikajú mikroskopické kavitačné bubliny. Pri kolapse týchto bublín vznikajú lokalizované šmykové sily a účinky mikromiešania, ktoré narúšajú pevné matrice a urýchľujú prenos hmoty. Tento proces výrazne zvyšuje účinnosť extrakcie.
Sonikátor UIP400MTP s vysokou kapacitou spracovania vzoriek so stojanom na skúmavky pre vialky automatického dávkovača vzoriek
Vedecké dôkazy: sonikácia zlepšuje analytické parametre
Viaceré recenzované štúdie preukázali výhody ultrazvukovej extrakcie v pracovných postupoch HPLC.
Napríklad metóda vyvinutá na monitorovanie rezíduí pesticídov vo vzorkách vody využívala sonikáciu v kombinácii s analýzou LC–MS/MS na stanovenie koncentrácií pesticídu karbaryl. Pri tomto postupe sa vzorky vody pred chromatografickou analýzou extrahovali acetonitrilom za pôsobenia ultrazvuku. Metóda dosiahla veľmi dobré analytické parametre vrátane výťažností medzi 89,53% a 101,72%, čo potvrdzuje správnosť a spoľahlivosť postupu ultrazvukovej prípravy vzoriek.
Krok ultrazvukovej extrakcie umožnil účinný prenos analytov z vodnej matrice do organického rozpúšťadla, čím sa znížila spotreba rozpúšťadiel a odstránila potreba rozsiahlych postupov čistenia. Validovaná analytická metóda vykazovala vynikajúcu linearitu, presnosť a medze kvantifikácie, čo poukazuje na účinnosť sonikácie v moderných chromatografických pracovných postupoch. (porov. Roudani et al., 2018)
Ďalšia štúdia predstavila ultrazvukom podporovanú disperziu matrice v tuhej fáze (UA-MSPD) na stanovenie oleuropeínu v olivových listoch pomocou analýzy HPLC. Pri tejto technike sa rastlinný prášok zmiešal so sorbentom a následne sa počas elučného kroku vystavil ultrazvukovým vlnám. Ultrazvuk zlepšil desorpciu analytu z povrchu sorbentu a zároveň zlepšil extrakciu z matrice vzorky. (porov. Rashidipour a Heydari, 2018)
Optimalizovaný ultrazvukový postup priniesol významné zlepšenia analytických parametrov vrátane:
- Lineárnych kalibračných kriviek s R² = 0,9979
- Medzí detekcie už od 0,03 µg mL⁻¹
- Výťažností medzi 90,2% a 96,7%
Tieto výsledky potvrdzujú, že ultrazvukom podporovaná extrakcia nielen urýchľuje prípravu vzoriek, ale aj zvyšuje výťažok extrakcie v porovnaní s klasickými technikami disperzie matrice v tuhej fáze.
Sondový sonikátor UP200St na prípravu vzoriek pre HPLC
Hlavné výhody ultrazvukovej prípravy vzoriek pre HPLC
Rastúce využívanie ultrazvukovej extrakcie v analytických laboratóriách je podmienené viacerými merateľnými výhodami.
- Vyššia účinnosť extrakcie
Akustická kavitácia rozrušuje pevné matrice a zlepšuje prenikanie rozpúšťadla. Tým zlepšuje uvoľňovanie analytov a zvyšuje výťažnosť, najmä pri zlúčeninách prítomných v stopových množstvách v komplexných vzorkách. - Kratší čas prípravy vzoriek
Ultrazvuková extrakcia často umožňuje dokončiť prípravu vzoriek v priebehu sekúnd alebo minút. Napríklad optimalizované parametre ultrazvukovej extrakcie pri UA-MSPD umožnili dosiahnuť účinné získanie analytov za približne 30 sekúnd sonikácie, čo ukazuje, ako výrazne možno urýchliť analytické pracovné postupy. - Nižšia spotreba rozpúšťadiel
Keďže ultrazvuk zlepšuje prenos hmoty, zvyčajne sú potrebné menšie objemy rozpúšťadiel. Znížená spotreba rozpúšťadiel zlepšuje udržateľnosť laboratória a znižuje prevádzkové náklady. - Lepšia reprodukovateľnosť
Rovnomerné rozloženie ultrazvukovej energie zabezpečuje konzistentné rozrušenie a extrakciu vzoriek pri opakovaniach, čo vedie k lepšej precíznosti analytických meraní. - Kompatibilita s modernými chromatografickými metódami
Ultrazvukovú extrakciu možno ľahko integrovať do systémov HPLC, UHPLC a LC-MS, vďaka čomu je vhodná pre analytické pracoviská s vysokou kapacitou spracovania vzoriek.
HPLC chromatogram fenolových zlúčenín z extraktu listov Annona muricata izolovaného ultrazvukom pomocou ultrazvukového prístroja UP400S.
(Štúdia a grafika: ©Nolasco-González et al., 2022)
Praktické sonikačné riešenia na prípravu vzoriek pre HPLC
Laboratóriám, ktoré zavádzajú ultrazvukovú extrakciu, poskytujú sonikátory Hielscher presnú kontrolu nad parametrami, ako sú amplitúda, čas a pulzný režim. Laboratórne sonikátory Hielscher sú preto obzvlášť vhodné pre analytické laboratóriá.
Vyberte si najvhodnejší laboratórny sonikátor pre svoje vzorky na HPLC
| Model sonikátora | Výhody pre HPLC | Najvhodnejšie využitie pri príprave vzoriek pre HPLC |
| Sonikátor VialTweeter na viacero skúmaviek |
• Súčasná sonikácia až 10 uzavretých liekoviek s rovnakou ultrazvukovou energiou • Sterilita: Bez krížovej kontaminácie, pretože vzorky zostávajú uzavreté • Vysoko reprodukovateľné podmienky extrakcie medzi šaržami • Účinná kavitácia pre analytické vzorky s malým objemom |
• Príprava environmentálnych, potravinových alebo farmaceutických vzoriek s vysokou kapacitou spracovania • Extrakcia stopových analytov pred analýzou HPLC, UHPLC alebo LC-MS • Štandardizované pracovné postupy vyžadujúce rovnaké spracovanie viacerých vzoriek |
| Sonikátor UIP400MTP na mikrotitračné platničky |
• Bezkontaktná sonikácia celých mikrotitračných platničiek (96-jamkové a 384-jamkové formáty) • Rovnomerné rozloženie ultrazvukovej energie vo všetkých jamkách • Umožňuje automatizáciu a integráciu robotických systémov do analytických pracovných postupov • Vysoká kapacita spracovania vzoriek s presným riadením amplitúdy a času sonikácie |
• Skríningové pracovné postupy UHPLC s vysokou kapacitou spracovania vzoriek • Knižnice farmaceutických zlúčenín a príprava vzoriek pre metabolomiku • Extrakcia v platničkách pre analytické postupy LC-MS alebo UHPLC |
| Laboratórne sonikátory s mikrohrotom (priama sonikácia) |
• Maximálna intenzita ultrazvuku na účinné rozrušenie matrice • Veľmi rýchla extrakcia analytov z pevných, viskóznych alebo heterogénnych vzoriek • Nastaviteľná amplitúda a parametre pulzov na optimalizáciu podmienok extrakcie • Vysoká kavitačná energia zlepšuje výťažnosť analytov a výťažok extrakcie |
• Extrakcia z náročných matríc, ako sú rastlinné tkanivá, potravinové vzorky alebo polyméry • Homogenizácia pred SPE, filtráciou alebo extrakciou kvapalina–kvapalina • Vývoj metód ultrazvukovej prípravy vzoriek pre HPLC |
| CupHorn („kúpeľ s vysokou intenzitou“ pre kadičky a skúmavky) |
• Nepriama sonikácia zabraňuje kontaminácii sondou • Rovnomerné ultrazvukové pole pre viacero skúmaviek súčasne • Ideálne pre sterilné, nebezpečné alebo prchavé vzorky, ktoré musia zostať uzavreté • Zjednodušuje manipuláciu pri zachovaní vysokej kavitačnej energie |
• Paralelná extrakcia viacerých vzoriek pre HPLC v uzavretých centrifugačných skúmavkách • Príprava biologických, farmaceutických alebo environmentálnych vzoriek • Pracovné postupy vyžadujúce nepriamu sonikáciu bez kontaminácie |
Vedecký význam pre analytickú chémiu
S prechodom analytickej chémie na rýchlejšie a udržateľnejšie laboratórne postupy sa ultrazvuková príprava vzoriek stala účinnou technológiou umožňujúcou tento pokrok. Sonikácia podporuje vývoj rýchlych analytických metód s nižšou spotrebou rozpúšťadiel, lepšou účinnosťou extrakcie a robustnými validačnými parametrami.
Rastúci počet odborných publikácií o ultrazvukovej extrakcii dokazuje, že príprava vzoriek na HPLC s podporou sonikácie nie je len praktickým uľahčením práce – je to vedecky overený prístup, ktorý zlepšuje analytickú výkonnosť. Kombináciou ultrazvukovej extrakcie s modernými chromatografickými technikami môžu laboratóriá dosiahnuť spoľahlivú detekciu stopových analytov v čoraz zložitejších matriciach vzoriek.
Pracovné postupy HPLC zdokonalené sonikáciou
Vďaka neustálemu pokroku v analytickej prístrojovej technike a technológiách prípravy vzoriek bude ultrazvuková extrakcia pravdepodobne zohrávať v chromatografických laboratóriách ešte významnejšiu úlohu. Jej schopnosť zefektívňovať pracovné postupy, zlepšovať kvalitu údajov a znižovať vplyv na životné prostredie dobre zodpovedá vyvíjajúcim sa požiadavkám modernej analytickej vedy.
Pre analytických chemikov a priemyselné laboratóriá, ktoré sa usilujú optimalizovať prípravu vzoriek na HPLC, predstavuje ultrazvuková extrakcia osvedčené, škálovateľné a vedecky robustné riešenie. Začlenením sonikácie do rutinných protokolov prípravy vzoriek môžu laboratóriá výrazne zlepšiť účinnosť aj spoľahlivosť chromatografickej analýzy.
Návrh, výroba a poradenstvo – kvalita vyrobená v Nemecku
Ultrazvukové prístroje Hielscher sú známe najvyššími štandardmi kvality a konštrukcie. Robustnosť a jednoduchá obsluha umožňujú bezproblémové začlenenie našich ultrazvukových prístrojov do priemyselných prevádzok. Ultrazvukové prístroje Hielscher ľahko zvládajú drsné podmienky a náročné prostredia.
Hielscher Ultrasonics je spoločnosť s certifikáciou ISO a kladie osobitný dôraz na vysokovýkonné ultrazvukové prístroje s najmodernejšou technológiou a jednoduchou obsluhou. Ultrazvukové prístroje Hielscher samozrejme spĺňajú požiadavky CE aj požiadavky UL, CSA a RoHs.
Literatúra / Referencie
- M. Rashidipour and R. Heydari (2018): Ultrasonic-Assisted Matrix Solid-Phase Dispersion and High-Performance Liquid Chromatography as an Improved Methodology for Determination of Oleuropein from Olive Leaves. Analytical and Bioanalytical Chemistry Research 52, 2018. 307-316.
- Roudani, A.; Rachid, Mamouni; Nabil, Saffaj; Laknifli, A.; Gharby, Said; Noureddine, El Baraka; Bakka, Abdelhamid; Abdellah, Faouzi (2018): Method validation in the determination of Carbaryl pesticide in water samples using sonication and liquid chromatography-tandem mass spectrometry. JMES 8 (7), 2017. 2409-2420.
- Bimakr M., Ganjloo A., Zarringhalami S., Ansarian E. (2017): Ultrasound-assisted extraction of bioactive compounds from Malva sylvestris leaves and its comparison with agitated bed extraction technique. Food Science and Biotechnology 2017 Nov 30;26(6):1481-1490.
Často kladené otázky
Čo je HPLC?
Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (HPLC) je analytická separačná technika používaná na identifikáciu, kvantifikáciu a čistenie zložiek zmesi. Pri HPLC kvapalná mobilná fáza prenáša rozpustené analyty pod vysokým tlakom cez kolónu naplnenú stacionárnou fázou. Rozdiely v interakciách medzi analytmi, stacionárnou fázou a mobilnou fázou spôsobujú, že sa zlúčeniny pri prechode kolónou oddeľujú. Detektory využívajúce napríklad UV-Vis, fluorescenciu alebo hmotnostnú spektrometriu merajú oddelené zlúčeniny, čo umožňuje presnú kvalitatívnu a kvantitatívnu analýzu.
Aké sú typy kvapalinovej chromatografie?
Kvapalinovú chromatografiu možno klasifikovať podľa separačného mechanizmu uplatňujúceho sa medzi analytom, stacionárnou fázou a mobilnou fázou. Najbežnejšími typmi sú chromatografia s obrátenými fázami, pri ktorej nepolárna stacionárna fáza oddeľuje zlúčeniny na základe hydrofóbnych interakcií; chromatografia s normálnymi fázami, ktorá využíva polárnu stacionárnu fázu a oddeľuje zlúčeniny podľa polarity; iónomeničová chromatografia, pri ktorej elektricky nabité stacionárne fázy oddeľujú analyty na základe iónových interakcií; a vylučovacia chromatografia, ktorá oddeľuje molekuly podľa ich hydrodynamickej veľkosti a molekulovej hmotnosti. Medzi ďalšie špecializované metódy patria afinitná chromatografia a chromatografia s hydrofilnými interakciami (HILIC), ktoré sa zameriavajú na špecifické molekulové interakcie alebo polárne zlúčeniny.
Aké liekovky sa používajú pri HPLC?
Pri analýzach HPLC sa zvyčajne používajú malé sklenené alebo polymérové vialky určené na uchovávanie pripravených vzoriek pred ich vstreknutím do chromatografického systému. Najbežnejším formátom je 2-mL vialka pre automatický dávkovač vzoriek, ktorá je kompatibilná s väčšinou automatických dávkovačov vzoriek pre HPLC. Tieto vialky sa zvyčajne vyrábajú z borosilikátového skla, aby sa zabezpečila chemická odolnosť a minimálna interakcia s rozpúšťadlami a analytmi. V závislosti od typu vzorky môžu vialky obsahovať vložky pre vzorky s malým objemom, skrutkovacie alebo krimpovacie uzávery a septá z materiálov, ako je PTFE/silikón, na zachovanie integrity vzorky.
Čo sú vialky pre automatické dávkovače vzoriek?
Vialky pre automatické dávkovače vzoriek sú špecializované nádobky na vzorky určené pre systémy automatického vstrekovania v prístrojoch HPLC a UHPLC. Obsahujú pripravený roztok vzorky a umiestňujú sa do zásobníka automatického dávkovača vzoriek v prístroji, kde systém automaticky odoberá definovaný objem na vstreknutie do chromatografickej kolóny. Vialky pre automatické dávkovače vzoriek sa vyrábajú s presnými rozmermi, aby sa zabezpečila kompatibilita s robotickými odberovými ihlami a minimalizovalo sa odparovanie, kontaminácia alebo adsorpcia vzorky. Ich konštrukcia umožňuje reprodukovateľnú analýzu s vysokou kapacitou spracovania vzoriek v moderných chromatografických laboratóriách.
Aké sú kroky pri HPLC?
Typický pracovný postup vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie (HPLC) pozostáva z niekoľkých po sebe nasledujúcich krokov, ktoré zabezpečujú spoľahlivú separáciu a detekciu analytov.
- Najprv sa vykoná príprava vzorky s cieľom rozpustiť analyt, odstrániť pevné častice a často aj extrahovať alebo koncentrovať cieľové zlúčeniny z matrice vzorky. Tento krok môže zahŕňať filtráciu, riedenie alebo extrakčné techniky, ako je ultrazvuková extrakcia, extrakcia na tuhej fáze alebo extrakcia kvapalina–kvapalina.
- Potom sa pripravená vzorka umiestni do vialky pre HPLC a vloží sa do automatického dávkovača vzoriek. Automatický dávkovač vzoriek vstrekne presný objem vzorky do prúdiacej mobilnej fázy.
- Vo fáze prívodu mobilnej fázy sa potom vstreknutá vzorka prepravuje systémom pomocou vysokotlakového čerpadla. Mobilná fáza prenáša analyty cez chromatografickú kolónu pri riadenom objemovom prietoku.
- Vo vnútri chromatografickej kolóny dochádza k separácii. Kolóna obsahuje stacionárnu fázu, zvyčajne vo forme náplne tvorenej časticami s definovanými chemickými vlastnosťami. Pri prechode kolónou analyty rôzne interagujú so stacionárnou a mobilnou fázou, čo spôsobuje ich elúciu v rôznych časoch.
- Po separácii zlúčeniny prechádzajú detektorom, napríklad UV-Vis, fluorescenčným alebo hmotnostnospektrometrickým detektorom. Detektor meria prítomnosť a koncentráciu eluujúcich zlúčenín a prevádza signál na elektronické údaje.
- Nakoniec sa pomocou chromatografického softvéru vykoná zber a analýza údajov. Systém vytvorí chromatogram, v ktorom píky zodpovedajú jednotlivým zlúčeninám. Retenčné časy píkov pomáhajú identifikovať analyty, zatiaľ čo plochy alebo výšky píkov umožňujú kvantitatívne stanovenie ich koncentrácie.
Hielscher Ultrasonics vyrába vysokovýkonné ultrazvukové homogenizátory vo veľkostiach od laboratórnych až po priemyselné.