Vírusové vakcíny založené na bunkových kultúrach – Efektívne rozrušovanie buniek pomocou ultrazvuku

Často kladené otázky týkajúce sa ultrazvukového rozrušovania buniek pri výrobe vírusových vakcín

Čo je to ultrazvukové rozrušovanie buniek?

Ultrazvukové rozrušovanie buniek využíva ultrazvuk vysokej intenzity, zvyčajne v rozsahu 20 až 30 kHz, na rozbitie bunkových membrán a uvoľnenie intracelulárneho materiálu. Vysokoenergetické ultrazvukové vlny vytvárajú v kvapaline kavitačné bubliny. Keď tieto bubliny kolabujú, vytvárajú intenzívne lokálne šmykové sily a mikroprúdy, ktoré mechanicky rozrušujú bunky a podporujú prenos hmoty medzi vnútrom bunky a okolitým prostredím. Pri výrobe vakcín sa táto metóda používa na lýzu kultúr buniek infikovaných vírusom a na uvoľnenie intracelulárnych a membránovo viazaných vírusových častíc do zberu.

Prečo pri zbere vírusov používať sonikáciu namiesto chemickej alebo enzýmovej lýzy?

Ultrazvuková úprava využíva výlučne mechanické sily. Nie sú potrebné žiadne detergenty, lyzozým, proteináza K ani iné lýzové činidlá, ktoré by mohli zmeniť zloženie lýzátu, ovplyvniť následné čistenie alebo ktoré by bolo potrebné pred ďalším spracovaním odstrániť. Chemické činidlá zvyčajne vyžadujú časovo náročnú viacstupňovú prípravu, aby sa zabránilo inhibícii následných testov a ďalších krokov po spracovaní. Enzymatická lýza vyžaduje dlhé inkubačné časy a často poskytuje neopakovateľné výsledky. Ultrazvuková lýza tiež spája kroky resuspendovania, rozrušenia a extrakcie do jednej nepretržitej operácie. Ak váš proces vyžaduje krok s použitím detergentu alebo enzýmu, sonikácia ho skôr zintenzívňuje, ako nahrádza: kavitácia oslabuje membrány a zlepšuje rovnomerné vystavenie všetkých buniek činidlu.

Ako sa sonikácia porovnáva s mechanickými metódami homogenizácie?

Ultrazvukové zariadenia so sondou prenášajú ultrazvukovú energiu priamo a efektívne, pretože sonotroda je v priamom kontakte so vzorkou. Techniky homogenizácie s mechanickým pohonom často vedú k nižšej účinnosti prenosu energie. Ultrazvukové spracovanie nevyžaduje žiadne spotrebné mlecie guličky ani rotačné tesnenia v prúde produktu, žiadne trysky ani komory, ktoré by sa mohli upchať viskóznou bunkovou hmotou, a nedochádza k krížovej kontaminácii medzi jednotlivými šaržami.

Môže ultrazvuk poškodiť vírus alebo antigén?

Toto je kľúčová úloha optimalizácie a je riaditeľná. Úpravou parametrov ultrazvukového spracovania je možné presne regulovať účinky sonikácie: nízka amplitúda a krátka doba sonikácie majú veľmi mierne účinky, zatiaľ čo vysoké amplitúdy, zvýšený tlak a dlhšia doba sonikácie vedú k intenzívnemu spracovaniu. Keďže intenzitu je možné presne prispôsobiť biologickej vzorke, zabráni sa nadmernému spracovaniu, degradácii a strate výťažku. V praxi sa amplitúda, doba zdržania a počet prechodov nastavujú na minimum potrebné na dosiahnutie cieľovej rýchlosti rozrušenia, pričom sa nepretržite monitoruje teplota a zabezpečuje chladenie.

Znižuje ultrazvuková úprava viskozitu úrody?

Áno. Husté zbery s vysokou hustotou buniek sú viskózne a ťažko čerpateľné kvôli uvoľnenej, nefragmentovanej DNA hostiteľských buniek. Ultrazvuková úprava strihá a fragmentuje DNA a RNA, rozpúšťa bunkovú hmotu a rozbíja zhluky bunkových zvyškov. Výsledkom je homogénna, čerpatelná suspenzia, ktorá umožňuje efektívnejšie vykonávanie procesov čistenia, centrifugácie a chromatografie. Fragmentácia DNA a RNA pomocou kontrolovanej sonikácie je osvedčenou laboratórnou aplikáciou tej istej technológie.

Môžem tento proces spustiť v nepretržitom inline režime?

Áno. Ultrazvukové zariadenia spoločnosti Hielscher sú navrhnuté pre nepretržitú prevádzku 24 hodín denne, 7 dní v týždni v priemyselnom prostredí a dajú sa konfigurovať s prietokovými komorami a reaktormi na nepretržité inline ožarovanie ultrazvukom, recirkulačné okruhy alebo integráciu do výrobných modulov a spracovateľských liniek. Je možná prevádzka s jedným aj viacerými priechodmi.

Ako môžem prejsť z laboratórneho prostredia do sériovej výroby?

Lineárne, na základe merateľného energetického vstupu. Všetky výsledky sonikácie získané pomocou ultrazvukového homogenizátora Hielscher je možné lineárne škálovať na vyššie výkony v priemyselnej výrobe; parametre sonikácie vyvinuté na stolnom sonikátore je možné priamo preniesť do väčších systémov Hielscher. Kritériom pre zväčšenie rozsahu je špecifický energetický príkon na jednotku objemu spolu s amplitúdou, dobou zdržania a teplotou. Poradenstvo spoločnosti Hielscher v oblasti procesov zahŕňa odporúčania na optimalizáciu parametrov (amplitúda, špecifická energia E/V, doba zdržania, teplota a regulácia tlaku) viazané na merateľný energetický príkon.

Je ultrazvukové rozrušovanie buniek vhodné pre výrobu v čistých priestoroch a v súlade s GMP?

Ultrazvukové zariadenia spoločnosti Hielscher sa dajú ľahko inštalovať v laboratóriách a výrobných zariadeniach s čistým prostredím. Skriňe sú vyrobené z antibakteriálneho plastu alebo z nehrdzavejúcej ocele. Všetky časti prichádzajúce do styku s médiom, ako sú sonotrody a prietokové komory, sú vyrobené z titánu alebo z nehrdzavejúcej ocele a dajú sa sterilizovať v autokláve. K dispozícii sú špeciálne prietokové komorové reaktory spĺňajúce pokročilé požiadavky CIP (čistenie na mieste) a SIP (sterilizácia na mieste). Prevodník priemyselnej série UIP má stupeň krytia IP64 a môže byť inštalovaný v náročných prostrediach, zatiaľ čo generátor je umiestnený na diaľku. Vzhľadom na to, že sonikátory spoločnosti Hielscher premieňajú elektrickú energiu na mechanické kmitanie s veľmi vysokou účinnosťou približne 80–90 % od napájacej zástrčky až po kvapalinu, je možné snímač zabudovať do uzavretých krytov bez mriežok a nie je potrebné žiadne nútené chladenie, ako je stlačený vzduch alebo voda. To zároveň znamená, že žiadne chladiace médium neprichádza do kontaktu s procesom. Automatická dokumentácia procesu podporuje vysledovateľnosť a reprodukovateľnosť v regulovanej výrobe.

Môže ultrazvuková liečba tiež inaktivovať vírus na účely výroby inaktivovanej vakcíny?

Áno. Výkonný ultrazvuk nachádza uplatnenie pri inaktivácii patogénov, ako sú baktérie a vírusy. Pri vhodnej dávke a intenzite sonikácie je možné bunky a mikroorganizmy spracovať v súlade s cieľom procesu, takže tá istá platforma slúži na lýzu na účely zberu aj na inaktiváciu. Kombinácia ultrazvukového ožiarenia a tepla, známa ako termo-sonikácia, ponúka rýchlejšiu sterilizáciu pri výrazne zníženej tepelnej intenzite a trvaní, čo je výhodné pre zachovanie tepelne citlivých zlúčenín, ako sú proteíny a antigény. Ultrazvuková inaktivácia sa zvyčajne používa v kombinácii so zavedenými chemickými metódami inaktivácie a pre každý konkrétny vírus je potrebné overiť kompletnú kinetiku inaktivácie.

Je možné ten istý systém použiť aj na kroky prípravy po zbere?

Áno. Tá istá platforma slúži na disperziu antigénov do suspenzií, polymérov alebo lipozomálnych kapsúl, deaglomeráciu a rovnomerné rozloženie antigénov a adjuvancií na báze hliníka, ako je Alhydrogel™, prípravu vakcín do lipozómov a pevných lipidových nanočastíc s presnou kontrolou veľkosti nosiča, ako aj odplyňovanie pred plnením do injekčných liekoviek alebo striekačiek.