Extracția proteinelor asistată de sonicare din țesut tumoral – Protocol

Acest protocol descrie o metodă de extracție a proteinelor asistată de sonicare pentru țesutul tumoral, care perfecționează fluxul de lucru standard CPTAC de liză cu uree prin adăugarea unei etape controlate de sonicare cu sondă în timpul dezintegrării țesutului. Pornind de la strategia consacrată CPTAC de preparare pentru analiza aprofundată (deep-scale) a proteomului și fosfoproteomului, această modificare îmbunătățește dezintegrarea celulelor și a structurilor subcelulare, reduce vâscozitatea probei și intensifică eliberarea proteinelor care sunt de obicei mai greu de recuperat doar prin liză cu uree, în special a proteinelor legate de membrană și a celor care leagă ADN-ul sau sunt asociate cu nucleul. În studiul de bază, fluxul de lucru asistat de sonicare a crescut detecția atât a proteinelor, cât și a fosfopeptidelor, păstrând totodată compatibilitatea cu fluxul de analiză ulterior în stil CPTAC, cuprinzând digestia, marcarea TMT, fracționarea, îmbogățirea în fosfopeptide și analiza LC-MS/MS.

Extracția proteinelor asistată de sonicare din țesut tumoral pentru analiza proteomică și fosfoproteomică aprofundată

Protocolul următor este optimizat pentru extracția proteinelor din țesut tumoral crio-pulverizat în tampon de liză cu 8 M uree: o etapă suplimentară de sonicare cu sondă îmbunătățește recuperarea claselor de proteine dificile, în special a proteinelor asociate membranei și a celor asociate ADN-ului/nucleului, înainte de digestie și de analiza LC-MS/MS ulterioară. În studiul de bază realizat de Li et al. (2025), adăugarea sonicării a crescut detecția proteinelor asociate membranei și nucleului și a susținut o acoperire aprofundată de >12.000 de proteine și >25.000 de fosfopeptide în cadrul fluxului lor de lucru.

Domeniul de aplicare al protocolului

Utilizați această procedură pentru:

• țesut tumoral congelat proaspăt, crio-pulverizat
• pelete celulare sau alte specimene biologice pentru care extracția pe bază de uree este deja consacrată
• fluxuri de lucru de proteomică globală și fosfoproteomică care utilizează digestia triptică și, opțional, marcarea TMT

Studiul realizat de Li et al. (2025) afirmă că fluxul de lucru este aplicabil și altor tipuri de specimene, precum liniile celulare, sângele și urina; totuși, poate fi necesară o optimizare în funcție de tipul de probă.

Flux de lucru optimizat pentru prepararea probelor, cu etapă de sonicare implementată. Fluxul de lucru optimizat și designul experimental se bazează pe protocolul CPTAC de preparare a probelor pentru analiza proteomică și fosfoproteomică globală.
Studiu și schemă: ©Li et al., 2025

Principiul de funcționare

Studiul original a adăugat sonicarea la fluxul de lucru standard CPTAC de liză cu uree și a constatat o detecție îmbunătățită a proteinelor asociate membranelor și nucleilor. Autorii afirmă că parametrii de sonicare trebuie ajustați fin în funcție de dimensiunea/concentrația probei – prin alegerea dimensiunii sonotrodei, a aportului de energie și a temporizării pulsurilor.

Cu titlu de exemplu, pentru Hielscher UP200Ht și UP200St, aceasta înseamnă:

• utilizați amplitudinea și modul puls ca principale variabile de control
• mențineți probele reci pe tot parcursul (adică pe gheață)
• începeți cu setări conservatoare
• optimizați în funcție de claritatea probei, temperatură, randamentul proteic și calitatea peptidelor în etapele ulterioare

 
Ambele modele de sonicatoare Hielscher de 200 de wați, UP200Ht și UP200St, sunt concepute pentru volume mici și medii de probă, cu setări reglabile de amplitudine și puls; ambele omogenizatoare cu ultrasunete oferă control digital prin ecran tactil pentru ajustarea precisă a parametrilor, înregistrare automată a datelor, senzor de temperatură conectabil, control de la distanță și iluminarea probei.
 

Reactivi pentru extracția proteinelor asistată de sonicare

Tampon de liză cu uree

Preparați-l proaspăt, imediat înainte de utilizare:

• 8 M uree
• 75 mM NaCl
• 50 mM Tris, pH 8,0
• 1 mM EDTA
• 2 µg/mL aprotinină
• 10 µg/mL leupeptină
• 1 mM PMSF
• 10 mM NaF
• 20 µM PUGNAc
• Cocktail de inhibitori de fosfatază 2, 1:100 (v/v)
• Cocktail de inhibitori de fosfatază 3, 1:100 (v/v)

Ureea trebuie dizolvată complet înainte de adăugarea aditivilor; inhibitorii trebuie adăugați imediat înainte de utilizare; tamponul trebuie menținut pe gheață; iar după adăugarea aditivilor se recomandă amestecarea prin rotire ușoară în locul vortexării viguroase.
 

Reactivi suplimentari:

• Reactivi pentru testul proteic BCA
• 50 mM Tris-HCl, pH 8,0
• DTT
• Iodoacetamidă
• LysC
• Tripsină
• Acid formic
• Reactivi TMT, dacă utilizați proteomică cantitativă multiplexată
• Reactivi IMAC, dacă efectuați îmbogățirea în fosfopeptide

Echipament pentru extracția proteinelor asistată de sonicare

Necesar

Selecția recomandată a sonotrodei

Pentru probe de aproximativ 200–1000 µL, utilizați o sonotrodă cu diametru mic, adecvată pentru procesarea directă de intensitate ridicată a volumelor mici. Hielscher oferă sonotrode cu diverse diametre, iar vârfurile cu diametre mai mici asigură o intensitate mai mare la vârf.

Notă practică: utilizați cea mai mică sonotrodă care asigură o amestecare eficientă fără spumare excesivă sau contact cu peretele recipientului.

Dacă lucrați cu mai multe probe în același timp, ați putea lua în considerare sonicatorul multi-tub VialTweeter sau sonicatorul pentru microplăci UIP400MTP!

Instrucțiuni pas cu pas: procedura de extracție a proteinelor asistată de sonicare

A. Prerăcire și pregătire

1. Răciți centrifuga la 4°C.
2. Preparați tampon proaspăt de liză cu uree și mențineți-l pe gheață.
3. Instalați UP200Ht sau UP200St pe un stativ, în interiorul unei incinte fonoizolante.
4. Pregătiți o baie de gheață suficient de mare pentru a menține tuburile de probă în poziție verticală și stabile.

Prepararea tamponului proaspăt și manipularea la rece sunt esențiale.

B. Extracția inițială cu uree

1. Mențineți țesutul crio-pulverizat pe gheață.
2. Adăugați 200 µL de tampon de liză cu uree răcit la 50 mg de țesut umed.
3. Vortexați 5–10 s la viteză mare.
4. Incubați 15 min la 4°C.
5. Repetați încă o dată etapa de vortexare plus incubare.
6. Centrifugați la 20.000g timp de 10 min la 4°C.
7. Transferați lizatul/supernatantul într-un tub low-bind curat.

C. Sonicarea cu UP200Ht sau UP200St

Condiții inițiale pentru sonicare

• Amplitudine: începeți la 20–30%
• Durata pulsului: 5 s ON
• Răcire: 2 min pe gheață între pulsuri
• Număr de cicluri: 4 cicluri
• Timp total de sonicare activă: 20 s
• Durata totală a procesului, inclusiv răcirea: aproximativ 8–10 min

Etapele sonicării

1. Transferați lizatul într-un tub adecvat pentru sonicare. Utilizați un tub îngust, cu pereți subțiri, care permite un schimb bun de căldură și imersarea sigură a sonotrodei.
2. Plasați tubul într-o baie de gheață. Lucrarea identifică răcirea în timpul sonicării ca fiind esențială pentru prevenirea deteriorării termice.
3. Imersați vârful sonotrodei în probă. Mențineți vârful suficient de scufundat pentru o cavitație stabilă, dar nu îl lăsați să atingă peretele sau fundul tubului.
4. Aplicați un puls de 5 s la amplitudinea inițială.
5. Readuceți imediat proba complet pe gheață timp de 2 min.
6. Repetați până la finalizarea a 4 cicluri.
7. Inspectați lizatul după ciclu.
8. Continuați doar dacă este necesar, aplicând câte un singur puls suplimentar de 5 s, urmat întotdeauna de o răcire completă.
9. Opriți sonicarea când lizatul devine mai uniform și mai puțin filant/vâscos.
   Punctul final este un lizat mai translucid, care formează picături în loc de un flux vâscos continuu.
10. Centrifugați la aproximativ 16.000g timp de 15 min la 4°C.
11. Transferați supernatantul clarificat într-un tub nou și măsurați concentrația proteică.

Comparația proteomicii globale și a fosfoproteomicii între probele sonicate și cele nesonicate.
a. Numărul de proteine identificate (proteomică globală) în toate țesuturile tumorale PDX, cu sau fără sonicare. b. Numărul de fosfopeptide identificate (îmbogățire IMAC) în toate țesuturile tumorale PDX, cu sau fără sonicare. Au fost luate în calcul doar proteinele și fosfopeptidele cu un raport de abundență mai mare sau egal cu percentila 25. Raportul de abundență a fost calculat între probe de același tip.
Studiu și grafice: ©Li et al., 2025

Digestia și analiza ulterioare

După sonicare și clarificare, continuați conform fluxului de lucru original în stil CPTAC:

1. Diluați lizatul 1:3 (v/v) cu 50 mM Tris-HCl pH 8,0 pentru a reduce ureea la <2 M.
2. Adăugați LysC la 1 mAU per 50 µg de proteină și incubați 2 h la 25°C.
3. Adăugați tripsină la un raport enzimă:substrat de 1:49 (w/w) și digerați peste noapte la 25°C.
4. Opriți reacția cu acid formic până la o concentrație finală de 1%.
5. Continuați cu desalinizarea, marcarea TMT, fracționarea, îmbogățirea în fosfopeptide și LC-MS/MS, după caz.

Expresia diferențială a fosfopeptidelor din MS cu marcare TMT.
a. Subtipul bazal, evidențiind unele fosfopeptide umane (protein-sequence, început și sfârșit) reglate în sus în probele sonicate comparativ cu probele nesonicate. b. Subtipul luminal, evidențiind unele fosfopeptide umane (protein_sequence, început și sfârșit) reglate în sus în probele sonicate comparativ cu probele nesonicate. c. Căi KEGG îmbogățite pe baza proteinelor fosfopeptidelor reglate în sus în subtipul bazal sonicat al tumorilor. d. Căi KEGG îmbogățite pe baza proteinelor fosfopeptidelor reglate în sus în subtipul luminal sonicat al tumorilor.
Studiu și grafice: ©Li et al., 2025

Proiectare, fabricație și consultanță – Calitate Made in Germany

Ultrasonicatoarele Hielscher sunt bine cunoscute pentru cea mai înaltă calitate și cele mai înalte standarde de design. Robustețea și operarea ușoară permit integrarea fără probleme a ultrasonicatoarelor noastre în instalații industriale. Condițiile dificile și mediile solicitante sunt gestionate cu ușurință de ultrasonicatoarele Hielscher.

Hielscher Ultrasonics este o companie certificată ISO și pune un accent deosebit pe ultrasonicatoare de înaltă performanță, dotate cu tehnologie de ultimă generație și ușor de utilizat. Desigur, ultrasonicatoarele Hielscher sunt conforme CE și îndeplinesc cerințele UL, CSA și RoHs.

Literatură / Referințe

• Li Q.K.; Lih T.M.; Clark D.J.; Chen L.; Schnaubelt M.; Zhang H. (2025): Sonication-assisted protein extraction improves proteomic detection of membrane-bound and DNA-binding proteins from tumor tissues. Nature Protocols 2025 Aug;20(8):2083-2099.
• Stadlmann, J., Taubenschmid, J., Wenzel, D. et al. (2017): Comparative glycoproteomics of stem cells identifies new players in ricin toxicity. Nature 549, 2017. 538–542
• Jakob, S., Steinchen, W., Hanßmann, J. et al. (2024): The virulence regulator VirB from Shigella flexneri uses a CTP-dependent switch mechanism to activate gene expression. Nature Communications 15, 318 (2024).
• Jorge S., Capelo J.L., LaFramboise W., Dhir R., Lodeiro C., Santos H.M. (2019): Development of a Robust Ultrasonic-Based Sample Treatment To Unravel the Proteome of OCT-Embedded Solid Tumor Biopsies. Journal of Proteome Research 2019 Jul 5;18(7):2979-2986.
• Mertins P, Tang LC, Krug K, et al. (2018): Reproducible workflow for multiplexed deep-scale proteome and phosphoproteome analysis of tumor tissues by liquid chromatography-mass spectrometry. (Initial CPTAC protocol). Nature Protocols 7, 2018. 1632-1661.