Extracția proteinelor din țesutul tumoral asistată de sonicare – protocol
Acest protocol descrie o metodă de extracție a proteinelor asistată de sonicare pentru țesutul tumoral care avansează fluxul de lucru standard CPTAC de liză cu uree prin adăugarea unei etape de sonicare controlată a sondei în timpul întreruperii țesutului. Bazându-se pe strategia CPTAC de pregătire a proteomului și fosfoproteomului la scară profundă, această modificare îmbunătățește perturbarea structurii celulare și subcelulare, reduce vâscozitatea probei și îmbunătățește eliberarea proteinelor care sunt de obicei mai greu de recuperat doar prin liză cu uree, în special proteinele legate de membrană și de ADN sau asociate nucleului. În studiul de bază, fluxul de lucru asistat de sonicare a crescut detecția atât a proteinelor, cât și a fosfopeptidelor, păstrând în același timp compatibilitatea cu digestia în aval de tip CPTAC, etichetarea TMT, fracționarea, îmbogățirea fosfopeptidelor și analiza LC-MS/MS.
Extracția proteinelor asistată de sonicare din țesutul tumoral pentru analiza proteomică profundă și fosfoproteomică
The following protocol is optimized for extraction of proteins from cryopulverized tumor tissue in 8 M urea lysis buffer: An added probe-type sonication step improves the recovery of difficult protein classes, especially membrane-associated and DNA-/nucleus-associated proteins, before digestion and downstream LC-MS/MS analysis. In the underlying study by Li et al. (2025), adding sonication increased detection of membrane and nucleus-associated proteins and supported deep-scale coverage of >12,000 proteins and >25,000 phosphopeptides under their workflow.
sondă cu ultrasunete UP200St pentru extracția proteinelor în proteomică
Domeniu de aplicare pentru protocol
Utilizați această procedură pentru:
- țesut tumoral proaspăt congelat, criopulverizat
- pelete celulare sau alte specimene biologice pentru care extracția pe bază de uree este deja stabilită
- fluxuri globale de proteomică și fosfoproteomică utilizând digestia triptică și etichetarea TMT opțională
Studiul realizat de Li et al. (2025) afirmă că fluxul de lucru este aplicabil și altor tipuri de probe, cum ar fi liniile celulare, sângele și urina, însă poate fi necesară optimizarea în funcție de tipul de probă.
Flux de lucru optimizat pentru pregătirea probelor cu etapa de sonicare implementată. Fluxul de lucru optimizat și proiectul experimental se bazează pe protocolul CPTAC de pregătire a probelor pentru analiza proteomică și fosfoproteomică globală.
Studiu și schemă: ©Li et al., 2025
Principiul de funcționare
Studiul original a adăugat sonicarea la fluxul standard de liză cu uree CPTAC și a constatat o detectare îmbunătățită a proteinelor asociate cu membranele și nucleele. Autorii afirmă că parametrii de sonicare trebuie să fie reglați cu precizie în ceea ce privește dimensiunea/concentrația probei – prin alegerea dimensiunii sonotrodului, a aportului de energie și a sincronizării impulsurilor.
Exemplu, pentru Hielscher UP200Ht și UP200St, aceasta înseamnă:
- utilizarea amplitudinii și a modului de impuls ca principale variabile de control
- păstrați probele la rece pe tot parcursul prelevării (de exemplu, pe gheață)
- începeți cu setări conservatoare
- optimizarea în funcție de claritatea probei, temperatură, producția de proteine și calitatea peptidelor din aval
Ambele modele de sonicatoare Hielscher de 200 de wați UP200Ht și UP200St sunt concepute pentru volume mici și medii de probe, cu amplitudine reglabilă și setări de impuls; ambele omogenizatoare cu ultrasunete oferă control digital cu ecran tactil pentru reglarea precisă a parametrilor, înregistrarea automată a datelor, senzor de temperatură conectabil, telecomandă, iluminare a probei.
Reactivi pentru extracția proteinelor asistată de sonicare
Tampon de liză cu uree
Se prepară proaspăt imediat înainte de utilizare:
- 8 M uree
- 75 mM NaCl
- 50 mM Tris, pH 8,0
- 1 mM EDTA
- 2 µg/mL aprotinină
- 10 µg/mL leupeptină
- 1 mM PMSF
- 10 mM NaF
- 20 µM PUGNAc
- Cocktail inhibitor de fosfatază 2, 1:100 (v/v)
- Cocktail inhibitor de fosfatază 3, 1:100 (v/v)
Ureea trebuie să fie complet dizolvată înainte de adăugarea aditivilor; inhibitorii trebuie adăugați imediat înainte de utilizare; tamponul trebuie păstrat la gheață; după adăugarea aditivilor, se recomandă mai degrabă rotirea decât vortexarea viguroasă.
Reactivi suplimentari:
- Reactivi pentru analiza proteinelor BCA
- 50 mM Tris-HCl, pH 8,0
- DTT
- Iodoacetamidă
- LysC
- Tripsina
- Acid formic
- Reactivi TMT, dacă se utilizează proteomică cantitativă multiplexată
- Reactivi IMAC, dacă se efectuează îmbogățirea fosfopeptidelor
Ultrasonicator UP200Ht cu microtip S26d2 pentru prepararea probelor
Echipament pentru extracția proteinelor asistată de sonicare
Necesar
Selectarea sondei recomandate
Pentru probe de aproximativ 200-1000 µL, utilizați o sonotrodă cu diametru mic, adecvată pentru prelucrarea directă de intensitate ridicată a volumelor mici. Hielscher oferă mai multe diametre de sonotrodă, iar diametrele mai mici ale vârfului asigură o intensitate mai mare la vârf.
Notă practică: Utilizați cea mai mică sondă care asigură o amestecare eficientă fără spumare excesivă sau contact cu pereții vasului.
Dacă lucrați cu mai multe probe în același timp, ați putea lua în considerare Multi-Tube Sonicator VialTweeter sau Microplate Sonicator UIP400MTP!
Instrucțiuni pas cu pas: Procedura de extracție a proteinelor asistată de sonicare
A. Pre-răcire și pregătire
- Se răcește centrifuga la 4°C.
- Se prepară tampon de liză uree proaspăt și se păstrează la gheață.
- Așezați UP200Ht sau UP200St pe un suport în interiorul unei incinte de sunet.
- Pregătiți o baie de gheață suficient de mare pentru a menține tuburile de probă în poziție verticală și stabilă.
Pregătirea tamponului proaspăt și manipularea la rece sunt esențiale.
B. Extracția inițială a ureei
- Păstrați țesutul criopulverizat pe gheață.
- Se adaugă 200 µL tampon de liză uree răcit pentru 50 mg țesut umed.
- Vortex 5-10 s la viteză mare.
- Incubați 15 minute la 4°C.
- Se repetă încă o dată etapa vortex-plus-incubare.
- Centrifugați la 20 000 g timp de 10 minute la 4°C.
- Se transferă lizatul/supernatantul într-un tub curat cu grad scăzut de legare.
C. Sonicare cu utilizarea UP200Ht sau UP200St
Condiții de pornire pentru sonicare
- Amplitudine: începe la 20-30%
- Lungimea impulsului: 5 s ON
- Răcire: 2 minute pe gheață între impulsuri
- Număr de cicluri: 4 cicluri
- Timp total activ de sonicare: 20 s
- Durata totală a procesului, inclusiv răcirea: aproximativ 8-10 min
Etape de sonicare
- Se transferă lizatul într-un tub adecvat pentru sonicare. Utilizați un tub îngust, cu pereți subțiri, care să permită un bun schimb de căldură și o imersie sigură a sondei.
- Puneți tubul într-o baie de gheață. Documentul identifică răcirea în timpul sonicării ca fiind esențială pentru a preveni deteriorarea termică.
- Imersați vârful sondei în probă. Țineți vârful suficient de scufundat pentru o cavitare stabilă, dar nu îl lăsați să atingă peretele sau fundul tubului.
- Executați un impuls de 5 s la amplitudinea inițială.
- Întoarceți imediat proba complet la gheață timp de 2 min.
- Se repetă până la finalizarea a 4 cicluri.
- Inspectați lizatul după ciclu.
- Continuați numai dacă este necesar, folosind câte un impuls suplimentar de 5 s, urmat întotdeauna de o răcire completă.
- Opriți când lizatul devine mai uniform și mai puțin fibros/viscos.
Punctul final este un lizat mai translucid care formează picături mai degrabă decât un flux vâscos continuu. - Centrifugați la aproximativ 16 000 g timp de 15 minute la 4°C.
- Se transferă supernatantul clarificat într-un tub nou și se măsoară concentrația de proteine.
Compararea proteomicii globale și a fosfoproteomicii între probele sonicate și cele nesonicate.
a. Numărul de proteine identificate (proteomică globală) în toate țesuturile tumorale PDX cu sau fără sonicare. b. Numărul de fosfopeptide identificate (îmbogățire IMAC) în toate țesuturile tumorale PDX cu sau fără sonicare. Au fost numărate numai proteinele și fosfopeptidele cu un raport de abundență mai mare sau egal cu percentila 25. Raportul de abundență a fost calculat între aceleași tipuri de probe.
Studiu și grafice: ©Li et al., 2025
Digestie și analiză în aval
După sonicare și clarificare, procedați după cum se descrie în fluxul de lucru original de tip CPTAC:
- Se diluează lizatul 1:3 (v/v) cu 50 mM Tris-HCl pH 8,0 pentru a reduce ureea la <2 M.
- Se adaugă LysC la 1 mAU per 50 µg proteină și se incubează 2 h la 25°C.
- Se adaugă tripsină la 1:49 enzimă:substrat (p/p) și se digeră peste noapte la 25°C.
- Se stinge cu acid formic până la 1% final.
- Continuați desalinizarea, etichetarea TMT, fracționarea, îmbogățirea fosfopeptidelor și LC-MS/MS, după cum este necesar.
Expresia diferențiată a fosfopeptidelor din SM marcate cu TMT.
a. Subtipul bazal, evidențiind unele fosfopeptide umane (începutul și sfârșitul secvenței de proteine) suprareglementate în probele sonicate comparativ cu probele nesonicate. b. Subtipul luminal, evidențiind unele fosfopeptide umane (începutul și sfârșitul secvenței de proteine) suprareglementate în probele sonicate comparativ cu probele nesonicate. c. Căi KEGG îmbogățite pe baza proteinelor fosfopeptidelor upregulate în subtipul bazal sonicat al tumorilor. d. Căi KEGG îmbogățite pe baza proteinelor fosfopeptidelor upregulate în subtipul luminal sonicat al tumorilor.
Studiu și grafice: ©Li et al., 2025
Proiectare, fabricație și consultanță – Calitate Made in Germany
Hielscher ultrasonicators sunt bine-cunoscute pentru cele mai înalte standarde de calitate și design. Robustețea și funcționarea ușoară permit integrarea fără probleme a ultrasonicators noastre în instalații industriale. Condiții dure și medii solicitante sunt ușor de manipulat de ultrasonicators Hielscher.
Hielscher Ultrasonics este o companie certificată ISO și pune un accent deosebit pe ultrasonicators de înaltă performanță cu tehnologie de ultimă oră și ușurință în utilizare. Desigur, ultrasonicators Hielscher sunt conforme CE și îndeplinesc cerințele UL, CSA și RoHs.
Sonicator cu plăci cu mai multe godeuri UIP400MTP pentru extracția proteinelor din probe cu randament ridicat
Literatură / Referințe
- Li Q.K.; Lih T.M.; Clark D.J.; Chen L.; Schnaubelt M.; Zhang H. (2025): Sonication-assisted protein extraction improves proteomic detection of membrane-bound and DNA-binding proteins from tumor tissues. Nature Protocols 2025 Aug;20(8):2083-2099.
- Stadlmann, J., Taubenschmid, J., Wenzel, D. et al. (2017): Comparative glycoproteomics of stem cells identifies new players in ricin toxicity. Nature 549, 2017. 538–542
- Jakob, S., Steinchen, W., Hanßmann, J. et al. (2024): The virulence regulator VirB from Shigella flexneri uses a CTP-dependent switch mechanism to activate gene expression. Nature Communications 15, 318 (2024).
- Jorge S., Capelo J.L., LaFramboise W., Dhir R., Lodeiro C., Santos H.M. (2019): Development of a Robust Ultrasonic-Based Sample Treatment To Unravel the Proteome of OCT-Embedded Solid Tumor Biopsies. Journal of Proteome Research 2019 Jul 5;18(7):2979-2986.
- Mertins P, Tang LC, Krug K, et al. (2018): Reproducible workflow for multiplexed deep-scale proteome and phosphoproteome analysis of tumor tissues by liquid chromatography-mass spectrometry. (Initial CPTAC protocol). Nature Protocols 7, 2018. 1632-1661.
Întrebări frecvente
Care este diferența dintre extracția proteinelor din țesuturi vegetale și din țesuturi de mamifere?
Extracția proteinelor din țesuturi vegetale este de obicei mai dificilă decât din țesuturi de mamifere, deoarece celulele vegetale au un perete celular rigid bogat în celuloză, polizaharide abundente, compuși fenolici, pigmenți și enzime endogene active care pot interfera cu solubilizarea proteinelor, pot contamina extractele sau pot favoriza degradarea proteinelor. În schimb, țesutul de mamifere nu are un perete celular și este, în general, mai ușor de distrus chimic, deși conține adesea mai multe lipide, matrice extracelulară și proteaze care pot complica extracția. Ca urmare, protocoalele pentru plante necesită, de obicei, o întrerupere mecanică mai puternică, măcinare la temperatură scăzută și aditivi precum PVPP, agenți reducători sau curățare pe bază de fenol, în timp ce țesutul de mamifere este mai des manipulat cu succes cu tampoane pe bază de detergenți precum RIPA sau sisteme de liză pe bază de uree. Atât țesuturile vegetale, cât și cele de mamifere pot fi lizate eficient prin sonicare!
Cum se îmbunătățește extracția proteinelor din țesuturi utilizând tamponul RIPA?
Extracția proteinelor din țesuturi cu tampon RIPA poate fi îmbunătățită prin optimizarea atât a dezintegrării, cât și a protecției probei. Cele mai importante măsuri sunt păstrarea la rece a țesutului și a tamponului, utilizarea inhibitorilor de protează și fosfatază proaspăt preparați, tocarea sau pulverizarea completă a țesutului înainte de liză, menținerea unui raport tampon-țesut adecvat și adăugarea unei etape de întrerupere mecanică, cum ar fi omogenizarea sau sonicarea scurtă a sondei, pentru a rupe țesutul dens și a reduce vâscozitatea. Eficiența extracției se îmbunătățește, de asemenea, atunci când lizatele sunt incubate la gheață cu amestecare intermitentă, urmată de centrifugare la refrigerare la viteză mare pentru a îndepărta resturile insolubile. Pentru țesuturile fibroase, bogate în lipide sau foarte structurate, repetarea extracției o dată sau creșterea timpului de expunere la detergent poate îmbunătăți recuperarea, dar trebuie evitate sonicarea excesivă sau manipularea prelungită la temperatura camerei, deoarece acestea pot denatura proteinele sau pot crește proteoliza.
Ce cerințe de siguranță ar trebui să fie menținute în timpul extracției cu ultrasunete a proteinelor?
Efectuați sonicarea sondei într-o cutie de protecție fonică sau cu protecție auditivă adecvată. Protocolul sursei avertizează în mod specific cu privire la zgomotul sonor dăunător generat în timpul sonicării.
Purtați ochelari de protecție, halat de laborator și mănuși.
Țineți sonda departe de piele și nu sonicați niciodată un vas deschis fără protecție împotriva stropilor.
Manipulați PMSF și alți inhibitori în conformitate cu normele locale de siguranță chimică.
Păstrați probele pe gheață pentru a reduce deteriorarea proteinelor indusă de căldură; lucrarea identifică în mod repetat controlul temperaturii ca fiind esențial.
VialTweeter Sonicator accelerează și îmbunătățește extracția proteinelor în proteomică
Hielscher Ultrasonics produce omogenizatoare cu ultrasunete de înaltă performanță de la Laborator spre dimensiunea industrială.