Fluxuri de lucru proteomice cu digestie a proteinelor cu randament ridicat

Proteomica este un domeniu esențial pentru înțelegerea proceselor și sistemelor biologice, digestia proteinelor formând un pas critic în fluxurile sale de lucru. În mod tradițional, digestia proteinelor se efectuează în soluție folosind enzime proteolitice precum tripsina, care hidrolizează în mod specific legăturile peptidice la reziduurile de lizină și arginină. Acest proces generează peptide potrivite pentru ionizare și fragmentare în aplicații de spectrometrie de masă (MS). Cu toate acestea, metodele convenționale de digestie necesită 12-24 de ore pentru a fi finalizate, creând blocaje semnificative în fluxurile de lucru proteomice.
Ultrasunetele oferă o alternativă puternică, scurtând dramatic timpii de digestie de la ore la doar câteva minute. Atunci când este combinată cu sonicatoare avansate cu mai multe eșantioane, cum ar fi Hielscher CupHorn, VialTweeter și UIP400MTP sonicator cu plăci cu 96 de godeuri, ultrasunetele permit o proteomică accelerată, de mare randament. Aceste tehnologii eficientizează fluxurile de lucru, reducând timpul de pregătire a probelor și crescând eficiența fără a compromite reproductibilitatea sau calitatea datelor.

Rolul energiei cu ultrasunete în digestia proteinelor

Ultrasunetele folosesc unde ultrasonice focalizate pentru a crea cavitație - microbule localizate care se prăbușesc pentru a genera forțe intense de forfecare. Acest fenomen îmbunătățește transferul de masă, promovează amestecul enzimelor cu substraturile și desfășoară structurile proteice, expunând locurile de scindare la enzime proteolitice precum tripsina.
Rezultatul? O reducere semnificativă a timpului de digestie fără a compromite eficiența sau reproductibilitatea.

Digestia proteolitică îmbunătățită cu ultrasunete: metodologie și rezultate

Protocol de digestie accelerată

Digestia asistată de ultrasunete combină enzimele proteolitice și energia ultrasonică pentru a accelera fluxurile de lucru. De exemplu, folosind Hielscher UP200St-CupHorn (200 W, 26 kHz), fluxul de lucru de digestie se desfășoară după cum urmează:

1. Reducere: Probele de proteine (0,5 mg/ml, 20 μl) sunt tratate cu DTT (2 μl, 110 mM) în tampon de bicarbonat de amoniu (12,5 mM). Sonicarea se aplică la 50% amplitudine timp de 5 minute.
2. Alchilare: După adăugarea IAA (2 μL, 400 mM), sonicarea se repetă în aceleași condiții.
3. Digestie: Probele sunt diluate și incubate cu nanoparticule de tripsină imobilizate. O ultimă rundă de sonicare (5 minute) finalizează digestia. Peptidele sunt separate, uscate și stocate pentru analiza SM.

Această metodă cu ultrasunete reduce timpul total de pregătire de la 12 ore la mai puțin de 30 de minute. În ciuda procesului accelerat, randamentul și calitatea peptidelor rămân în concordanță cu metodele tradiționale peste noapte.

Eficiența digestiei proteinelor cu ultrasunete

În studiile comparative folosind proteomi de E. coli:

• Identificarea proteinelor: Probele digerate cu ultrasunete au identificat 777 de proteine în 5 minute, comparativ cu 817 în 12 ore. Identificările de proteine comune au depășit 70%.
• Reproductibilitate: Analizele replicate au arătat valori de corelație peste 98% în cadrul fiecărei metode, demonstrând fiabilitate.
• Selectivitate: Anumite proteine au fost digerate preferențial prin fiecare metodă, digestia cu ultrasunete favorizând 65 de proteine și digestia peste noapte 54 de proteine. Astfel de diferențe nuanțate subliniază potențialul unic al ultrasunetelor pentru aplicații specifice.

Rezultatele cuantificării proteinelor fără marcaj a șapte proteine înțepate într-un E. coli
mostră. Următoarele proteine au fost adăugate la două niveluri diferite, așa cum se menționează în coloană
numit "Theo Ratio". Theo Ratio este raportul teoretic dintre cele două niveluri utilizate în acest
experiment. albumină serică bovină (ALBU), β-lactoglobulină (LACB), cazeină α-S1 (CASA1),
α-S2 cazeină (CASA2), citocrom c (CYC), ovalbumină (OVAL) și anhidrază carbonică 2
(CAH2). Rapoartele au fost calculate folosind intensitățile proteice LFQ obținute din MaxQuant
analysis. The student’s t test was applied to compare the values obtained with each method (p>0.01, n=3, t-theoretical=4.6).
Studiu și grafic: © Martins et al., 2019)

Tripsina imobilizată cu nanoparticule

Integrarea nanoparticulelor de tripsină imobilizate (de exemplu, T-FMNP) cu ultrasunete îmbunătățește și mai mult fluxurile de lucru proteomice. Aceste nanoparticule oferă o suprafață mare pentru interacțiunile enzimă-substrat, crescând eficiența. Când este aplicată pe proteomi complecși, cum ar fi E. coli, metoda combinată realizează:

• Viteză: Digestie completă în 5 minute.
• Precizie: Comparable protein quantification to traditional methods (p > 0.01, n=3).
• Scalabilitate: Adaptarea la platformele cu mai multe godeuri, cum ar fi UIP400MTP permite procesarea cu randament ridicat.

Faceți clic aici pentru protocolul detaliat cu instrucțiuni pas cu pas!
(cf. Martins et al., 2019)

Digestie proteolitică la viteză mare și randament ridicat cu sonicatoarele Hielscher

Cele mai bune modele de sonicatoare pentru proteomică

Hielscher Ultrasonics oferă diferite modele de sonicatoare pentru pregătirea simultană a mai multor probe, facilitând fluxurile de lucru cu randament ridicat. Indiferent dacă lucrați cu flacoane, eprubete, plăci cu mai multe godeuri (de exemplu, plăci cu 6, 24, 96 de godeuri) sau vase Petri – Vă oferim sonicatoarele ideale pentru experimentele dumneavoastră.

UIP400MTP sonicator cu plăci cu mai multe godeuri

Pentru un randament maxim, UIP400MTP oferă capacitatea de a procesa plăci cu 96 de godeuri cu ultrasunete. Compatibil cu orice microplacă standard, UIP400MTP nu necesită produse de unică folosință scumpe și vă oferă libertatea de a alege cea mai bună placă cu mai multe godeuri pentru cercetarea dvs. Prin furnizarea de energie uniformă pe placă, permite reducerea rapidă, alchilarea și digestia a până la 200 de proteomi complecși în doar 1 oră. Acest nivel de automatizare și eficiență este crucial pentru proteomica de mare randament și aplicațiile clinice. Aflați mai multe despre sonicatorul cu plăci cu mai multe godeuri!

VialTweeter

VialTweeter este adaptat pentru laboratoarele care necesită sonicarea simultană a până la 10 flacoane sau eprubete. Abordarea sa non-invazivă elimină riscurile de contaminare încrucișată, asigurând în același timp o digestie reproductibilă a proteinelor. Acest dispozitiv este ideal pentru cercetătorii care lucrează cu volume limitate de eșantioane sau diverse tipuri de probe.
Aflați mai multe despre sonicatorul multi-tub VialTweeter!

Hielscher UP200St-CupCorn

Sonicatorul CupHorn este un dispozitiv puternic conceput pentru procesarea simultană a mai multor probe în recipiente sigilate. Asigură o distribuție uniformă a energiei cu ultrasunete și un control precis al temperaturii. Capacitatea de a procesa până la cinci probe simultan, împreună cu compatibilitatea sa cu fluxurile de lucru reduse, alchilate și digerate, fac din CupHorn un instrument fiabil pentru proteomica bazată pe SM.
Aflați mai multe despre CupHorn SonoReactor!

Protocol pas cu pas pentru digestia proteolitică asistată de ultrasunete folosind tripsină imobilizată cu nanoparticule

Acest protocol realizat de Martins et al. (2019) este optimizat pentru digestia rapidă a proteinelor folosind energie ultrasonică și tripsină imobilizată cu nanoparticule (T-FMNP). Pașii descriși asigură o reducere eficientă, alchilare și proteoliză potrivite pentru aplicațiile de spectrometrie de masă (MS).
Pașii protocolului

1. Reducerea legăturilor disulfurice
   • Se adaugă 2 μL de soluție de DTT (110 mM) la proba de proteină de 20 μL (0,5 mg/ml) în tamponul AmBic.
   • Așezați sample tub în sonoreactor UP200St-CupHorn.
   • Sonicați proba timp de 2,5 minute la 50% amplitudine (200 W, 26 kHz).
   • Faceți o pauză scurtă pentru a permite răcirea, apoi sonicați încă 2,5 minute în aceleași condiții.
2. Alchilarea reziduurilor reduse de cisteină
   • Se adaugă 2 μL de soluție de IAA (400 mM) la proba de proteine reduse.
   • Sonicați timp de 2,5 minute la 50% amplitudine pentru a facilita alchilarea.
   • Faceți o pauză pentru răcire, apoi sonicați încă 2,5 minute.

   Notă: Minimizați expunerea probei alchilate la lumină pentru a preveni degradarea IAA.

3. Diluarea probei
   • Se diluează proba de proteină alchilată la un volum final de 100 μL folosind 25 mM de tampon AmBic care conține 4% acetonitril (v/v).
   • Se amestecă bine prin pipetare ușoară.
4. Digestia proteolitică cu tripsină imobilizată cu nanoparticule
   • Se adaugă 20 μl de soluție T-FMNP (3 mg/ml) în proba proteică diluată.
   • Sonicați amestecul în sonoreactor timp de 2,5 minute la 50% amplitudine.
   • Faceți o pauză pentru răcire, apoi sonicați încă 2,5 minute în aceleași condiții.
5. Separarea nanoparticulelor de tripsină
   • Utilizați un magnet pentru a separa T-FMNPs de supernatantul care conține peptide digerate.
   • Transferați supernatantul într-un nou tub de microcentrifugă.
6. Pregătirea peptidelor pentru analiza SM
   • Uscați peptidele care conțin supernatant într-o centrifugă cu vid.
   • Păstrați peptidele uscate la -20°C până la analize ulterioare prin spectrometrie de masă.