Fluxuri de lucru proteomice cu digestie a proteinelor cu capacitate mare de procesare a probelor

Proteomica este un domeniu esențial pentru înțelegerea proceselor și sistemelor biologice, iar digestia proteinelor constituie o etapă critică în fluxurile sale de lucru. În mod tradițional, digestia proteinelor se realizează în soluție cu ajutorul enzimelor proteolitice precum tripsina, care hidrolizează specific legăturile peptidice la nivelul resturilor de lizină și arginină. Acest proces generează peptide foarte potrivite pentru ionizare și fragmentare în aplicațiile de spectrometrie de masă (MS). Totuși, metodele convenționale de digestie necesită 12–24 de ore pentru a fi finalizate, creând blocaje semnificative în fluxurile de lucru proteomice.
Ultrasonicarea oferă o alternativă puternică, scurtând dramatic timpii de digestie de la ore la doar câteva minute. Atunci când este combinată cu sonicatoare avansate pentru mai multe probe, precum Hielscher CupHorn, VialTweeter și sonicatorul pentru plăci cu 96 de godeuri UIP400MTP, ultrasonicarea permite o proteomică accelerată, cu capacitate mare de procesare a probelor. Aceste tehnologii eficientizează fluxurile de lucru, reducând timpul de pregătire a probelor și crescând eficiența fără a compromite reproductibilitatea sau calitatea datelor.

Rolul energiei ultrasonice în digestia proteinelor

Ultrasonicarea folosește unde ultrasonice focalizate pentru a crea cavitație – microbule localizate care colapsează, generând forțe de forfecare intense. Acest fenomen îmbunătățește transferul de masă, favorizează amestecarea enzimelor cu substraturile și desfășoară structurile proteice, expunând situsurile de clivaj enzimelor proteolitice precum tripsina.
Rezultatul? O reducere semnificativă a timpului de digestie fără a compromite eficiența sau reproductibilitatea.

Digestia proteolitică îmbunătățită cu ultrasunete: metodologie și rezultate

Protocol de digestie accelerată

Digestia asistată de ultrasunete combină enzimele proteolitice și energia ultrasonică pentru a accelera fluxurile de lucru. De exemplu, folosind Hielscher UP200St-CupHorn (200 W, 26 kHz), fluxul de lucru al digestiei se desfășoară după cum urmează:

1. Reducere: Probele de proteine (0,5 mg/mL, 20 µL) sunt tratate cu DTT (2 µL, 110 mM) în tampon de bicarbonat de amoniu (12,5 mM). Sonicarea se aplică la 50% amplitudine timp de 5 minute.
2. Alchilare: După adăugarea IAA (2 µL, 400 mM), sonicarea se repetă în aceleași condiții.
3. Digestie: Probele sunt diluate și incubate cu nanoparticule cu tripsină imobilizată. O ultimă rundă de sonicare (5 minute) finalizează digestia. Peptidele sunt separate, uscate și depozitate pentru analiza MS.

Această metodă cu ultrasunete reduce timpul total de pregătire de la 12 ore la sub 30 de minute. În ciuda procesului accelerat, randamentul și calitatea peptidelor rămân în concordanță cu cele obținute prin metodele tradiționale peste noapte.

Eficiența digestiei proteinelor cu ultrasunete

În studii comparative pe proteoame de E. coli:

• Identificarea proteinelor: Probele digerate cu ultrasunete au identificat 777 de proteine în 5 minute, comparativ cu 817 în 12 ore. Identificările de proteine comune au depășit 70%.
• Reproductibilitate: Analizele replicate au prezentat valori de corelație de peste 98% în cadrul fiecărei metode, demonstrând fiabilitatea.
• Selectivitate: Anumite proteine au fost digerate preferențial de fiecare metodă, digestia cu ultrasunete favorizând 65 de proteine, iar digestia peste noapte 54 de proteine. Astfel de diferențe nuanțate subliniază potențialul unic al ultrasonicării pentru aplicații specifice.

Rezultatele cuantificării fără marcare a proteinelor pentru șapte proteine adăugate (spiked) într-o
probă de E. coli. Următoarele proteine au fost adăugate la două niveluri diferite, după cum se indică în coloana
intitulată „Theo Ratio”. Theo Ratio este raportul teoretic dintre cele două niveluri utilizate în acest
experiment. Albumină serică bovină (ALBU), β-lactoglobulină (LACB), cazeină α-S1 (CASA1),
cazeină α-S2 (CASA2), citocrom c (CYC), ovalbumină (OVAL) și anhidrază carbonică 2
(CAH2). Rapoartele au fost calculate folosind intensitățile proteice LFQ obținute din analiza
MaxQuant. Testul t Student a fost aplicat pentru a compara valorile obținute cu fiecare metodă (p>0,01, n=3, t-teoretic=4,6).
Studiu și grafic: © Martins et al., 2019)

Tripsină imobilizată pe nanoparticule

Integrarea nanoparticulelor cu tripsină imobilizată (de ex., T-FMNPs) cu ultrasonicarea îmbunătățește și mai mult fluxurile de lucru proteomice. Aceste nanoparticule oferă o suprafață mare pentru interacțiunile enzimă-substrat, crescând eficiența. Aplicată proteoamelor complexe, precum cel de E. coli, metoda combinată realizează:

• Viteză: Digestie completă în 5 minute.
• Acuratețe: Cuantificare a proteinelor comparabilă cu cea obținută prin metodele tradiționale (p > 0,01, n=3).
• Scalabilitate: Adaptarea la platforme cu mai multe godeuri precum UIP400MTP permite procesarea cu capacitate mare de procesare a probelor.

Faceți clic aici pentru protocolul detaliat cu instrucțiuni pas cu pas!
(cf. Martins et al., 2019)

Digestie proteolitică de mare viteză și cu capacitate mare de procesare a probelor cu sonicatoarele Hielscher

Cele mai bune modele de sonicatoare pentru proteomică

Hielscher Ultrasonics oferă diverse modele de sonicatoare pentru pregătirea simultană a mai multor probe, facilitând fluxurile de lucru cu capacitate mare de procesare a probelor. Indiferent dacă lucrați cu flacoane, eprubete, plăci cu mai multe godeuri (de ex. plăci cu 6, 24, 96 de godeuri) sau cutii Petri – vă oferim sonicatoarele ideale pentru experimentele dumneavoastră.

Sonicatorul pentru plăci cu mai multe godeuri UIP400MTP

Pentru o capacitate maximă de procesare a probelor, UIP400MTP oferă posibilitatea de a procesa cu ultrasunete plăci cu 96 de godeuri. Compatibil cu orice microplacă standard, UIP400MTP nu necesită consumabile proprietare costisitoare și vă oferă libertatea de a alege cea mai bună placă cu mai multe godeuri pentru cercetarea dumneavoastră. Prin furnizarea unei energii uniforme pe întreaga placă, permite reducerea, alchilarea și digestia rapidă a până la 200 de proteoame complexe în doar 1 oră. Acest nivel de automatizare și eficiență este esențial pentru proteomica cu capacitate mare de procesare a probelor și pentru aplicațiile clinice. Aflați mai multe despre sonicatorul pentru plăci cu mai multe godeuri!

VialTweeter

VialTweeter este conceput pentru laboratoarele care necesită sonicarea simultană a până la 10 flacoane sau eprubete. Abordarea sa neinvazivă elimină riscurile de contaminare încrucișată, asigurând totodată o digestie reproductibilă a proteinelor. Acest dispozitiv este ideal pentru cercetătorii care lucrează cu volume limitate de probă sau cu tipuri diverse de probe.
Aflați mai multe despre sonicatorul pentru mai multe eprubete VialTweeter!

Hielscher UP200St-CupHorn

Sonicatorul CupHorn este un dispozitiv puternic, conceput pentru procesarea simultană a mai multor probe în recipiente sigilate. Acesta asigură o distribuție uniformă a energiei ultrasonice și un control precis al temperaturii. Capacitatea de a procesa până la cinci probe simultan, împreună cu compatibilitatea sa cu fluxurile de lucru de reducere, alchilare și digestie, face din CupHorn un instrument fiabil pentru proteomica bazată pe MS.
Aflați mai multe despre CupHorn SonoReactor!

Protocol pas cu pas pentru digestia proteolitică asistată de ultrasonicare folosind tripsină imobilizată pe nanoparticule

Acest protocol al lui Martins et al. (2019) este optimizat pentru digestia rapidă a proteinelor folosind energie ultrasonică și tripsină imobilizată pe nanoparticule (T-FMNPs). Etapele descrise asigură reducerea, alchilarea și proteoliza eficiente, adecvate pentru aplicațiile de spectrometrie de masă (MS).
Etapele protocolului

1. Reducerea legăturilor disulfidice
   • Adăugați 2 µL de soluție de DTT (110 mM) la proba de proteine de 20 µL (0,5 mg/mL) în tampon AmBic.
   • Plasați eprubeta cu proba în sonoreactorul UP200St-CupHorn.
   • Sonicați proba timp de 2,5 minute la 50% amplitudine (200 W, 26 kHz).
   • Faceți o scurtă pauză pentru a permite răcirea, apoi sonicați încă 2,5 minute în aceleași condiții.
2. Alchilarea resturilor de cisteină reduse
   • Adăugați 2 µL de soluție de IAA (400 mM) la proba de proteine redusă.
   • Sonicați timp de 2,5 minute la 50% amplitudine pentru a facilita alchilarea.
   • Faceți o pauză pentru răcire, apoi sonicați încă 2,5 minute.

   Notă: Reduceți la minimum expunerea probei alchilate la lumină pentru a preveni degradarea IAA.

3. Diluarea probei
   • Diluați proba de proteine alchilată până la un volum final de 100 µL folosind tampon AmBic 25 mM care conține 4% acetonitril (v/v).
   • Amestecați bine prin pipetare ușoară.
4. Digestie proteolitică cu tripsină imobilizată pe nanoparticule
   • Adăugați 20 µL de soluție de T-FMNP (3 mg/mL) la proba de proteine diluată.
   • Sonicați amestecul în sonoreactor timp de 2,5 minute la 50% amplitudine.
   • Faceți o pauză pentru răcire, apoi sonicați încă 2,5 minute în aceleași condiții.
5. Separarea nanoparticulelor cu tripsină
   • Folosiți un magnet pentru a separa T-FMNPs de supernatantul care conține peptidele digerate.
   • Transferați supernatantul într-o eprubetă nouă pentru microcentrifugă.
6. Pregătirea peptidelor pentru analiza MS
   • Uscați supernatantul care conține peptidele într-o centrifugă cu vid.
   • Depozitați peptidele uscate la -20°C până la analiza ulterioară prin spectrometrie de masă.