Forfecarea ADN-ului cu ultrasunete

În timpul forfecării ADN-ului și ARN-ului, moleculele lungi de ADN sunt fragmentate în bucăți mai mici, o etapă esențială în pregătirea probelor pentru construcția bibliotecilor de secvențiere de nouă generație (NGS). Forfecarea ADN-ului cu ultrasunete utilizează forțele cavitației acustice pentru a fragmenta ADN-ul sau ARN-ul în fragmente cu dimensiuni cuprinse între 100 bp și 5 kb. Această metodă permite controlul precis al dimensiunii fragmentelor, facilitând adaptarea la lungimea dorită a ADN-ului pentru rezultate optime ale secvențierii.

Forfecarea ADN-ului prin ultrasonicare

Hielscher Ultrasonics oferă diverse soluții bazate pe ultrasunete pentru forfecarea ADN-ului, ARN-ului și cromatinei. Alegeți între ultrasonicatoarele cu sondă (de ex. UP100H) pentru sonicare directă cu ajutorul unui microvârf sau utilizați VialTweeter ori CupHorn cu ultrasunete pentru prepararea indirectă a ADN-ului din diverse probe simultan. Hielscher vă oferă dispozitivul ideal în funcție de nevoile dumneavoastră: fie că aveți 1 sau până la 10 probe, volume de la microlitri până la litri – sonicatoarele Hielscher vor satisface cerințele dumneavoastră privind prepararea fragmentelor de ADN, ARN și cromatină la lungimea potrivită. Reproductibilitatea, operarea ușoară și controlul precis permit obținerea unei biblioteci fiabile pentru secvențierea de nouă generație.
Spre deosebire de fragmentarea enzimatică a ADN-ului, forfecarea cu ultrasunete aplică forțe de forfecare pur mecanice, fără adăugarea vreunei substanțe chimice. Prin setarea precisă a parametrilor de proces, forfecarea cu ultrasunete produce fragmente de ADN cu masă moleculară mare (ADN plasmidic și genomic).
Acizii nucleici purificați pot fi amplificați înainte sau după o etapă de fragmentare.
Parametrii de sonicare (putere, ciclu de puls / rafale, timp și temperatură) pot fi controlați în siguranță prin setările software.

Protocoale pentru forfecarea ADN-ului cu ultrasunete

Pentru testul de imunoprecipitare a cromatinei

Pe scurt, celulele au fost însămânțate în vase cu diametrul de 60mm (400.000 per vas) și transfectate cu siRNA RhoA (conform descrierii); după 72 h, au fost incubate cu formaldehidă (concentrație finală, 1%) timp de 10 min la 37°C pentru a lega încrucișat proteinele de ADN. Reacția de legare încrucișată a fost stopată prin adăugarea unei zecimi de volum de glicină 1,25 mol/L, rezultând o concentrație finală de 125 mmol/L. Celulele au fost spălate de două ori cu PBS rece ca gheața, resuspendate în tampon pentru testul de radioimunoprecipitare [150 mmol/L NaCl, 1% NP40, 0,5% deoxicolat, 0,1% SDS, 5 mmol/L EDTA, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8,0)] conținând 1 mmol/L fluorură de fenilmetilsulfonil, 1 Ag/mL aprotinină și 1 Ag/mL pepstatină A și menținute pe gheață timp de 30 min. Apoi, lizatele celulare au fost sonicate pe gheață cu un sonicator cu ultrasunete Hielscher UP200S (3 x 40 s, amplitudine 40%, ciclu 1; Hielscher Ultrasonics GmbH) până când cromatinele legate încrucișat au fost forfecate, obținându-se fragmente de ADN între 200 și 1.000 bp. O zecime din lizatul total a fost utilizată pentru cuantificarea cantității de ADN prezente în diferitele probe și considerată „ADN total de intrare”. Supernatanții au fost incubați cu suspensie de ADN din spermă de somon/proteină agaroză-50% pentru a reduce fondul nespecific. Imunoprecipitarea a fost apoi efectuată peste noapte la 4°C cu 5 Ag de anti-NF-nB p65 (Upstate) sau fără anticorp (control negativ). Acești supernatanți au fost suplimentați cu 5 mol/L NaCl și încălziți peste noapte la 65°C pentru a inversa legăturile încrucișate proteină-ADN. Imunocomplecșii au fost tratați în continuare cu proteinază K fără DNază și RNază, iar ADN-ul a fost purificat prin extracție cu fenol/cloroform și precipitare cu etanol. PCR a fost efectuată cu primeri specifici corespunzători unei secvențe din regiunea promotoare a genei iNOS umane (primer p1: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; primer p2: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

Studii privind expresia EGFP

Pentru studiile de expresie, tulpina recombinantă L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience, Germania), cu gena pentru EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein – proteina fluorescentă verde îmbunătățită) integrată cromozomial în ssu, a fost cultivată în diversele medii descrise anterior și suplimentată în plus cu 100 mg l^-1 nourseotricină (Jena Bioscience, Germania). În timpul cultivării, au fost prelevate probe de 1 ml, centrifugate (2000 × g, 20°C, 10 min) și spălate cu soluție de NaCl 0,9%. Peletul a fost resuspendat în tampon (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) și dezintegrat prin sonicare cu procesorul cu ultrasunete UP400S (energie aplicată ∼ 400 Ws). Resturile celulare au fost îndepărtate prin centrifugare (6000 × g, 4°C, 5 min) și analizate prin electroforeză în gel de dodecilsulfat de sodiu – poliacrilamidă (SDS-PAGE) în condiții reducătoare, conform metodei lui Laemmli (1970), cu geluri de poliacrilamidă 12,5%. Expresia EGFP a fost examinată în cultură agitată. (Fritsche et al. 2007)

Imunoprecipitarea cromatinei

Testul de imunoprecipitare a cromatinei a fost efectuat folosind ChIP-IT^TM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, SUA) conform instrucțiunilor producătorului, cu unele modificări. Pe scurt, podocitele umane diferențiate au fost legate încrucișat cu formaldehidă 1% timp de 10 min la temperatura camerei. Celulele au fost spălate cu PBS rece ca gheața, iar reacția de fixare a fost oprită prin adăugarea de glicină 0,125 M timp de 5 min la temperatura camerei. Celulele au fost spălate din nou cu PBS rece ca gheața și răzuite de pe vas. Celulele au fost peletate prin centrifugare și resuspendate în tamponul de liză. După centrifugare, nucleii peletați au fost resuspendați în tamponul de forfecare, incubați pe gheață timp de 30 min, iar cromatina a fost forfecată prin sonicare, de ex. cu UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Germania) la 25% putere, 5 pulsuri a câte 20 sec fiecare, pe gheață, în fragmente de aproximativ 200–600 bp. Cromatina forfecată a fost apoi centrifugată, iar supernatantul a fost colectat. Pentru imunoprecipitări, 60 μl de cromatină au fost incubați cu 1 μg de anticorpi Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, SUA), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, Marea Britanie) sau NF-κB p50 (Abcam) ori cu IgG de iepure (Zymed Laboratories), ca control negativ, peste noapte la 4°C, cu rotire ușoară. Imunocomplecșii legați de bilele magnetice au fost colectați cu ajutorul unui suport magnetic, spălați extensiv, iar legăturile încrucișate proteină/ADN au fost inversate și ADN-ul a fost eluat pentru analiza PCR în timp real. (Ristola et al. 2009)

Prepararea ADN-ului EHEC pentru analiza pe cipuri de tip array

Pregătirea lizatelor celulare și a ADN-urilor extrase
Peletele bacteriene suspendate în PBS până la concentrația finală dorită au fost tratate cu dezintegratorul cu ultrasunete UP100H (Hielscher GmbH, Germania) echipat cu un microvârf MS1 (1mm în diametru). Frecvența de lucru a fost de 30 kHz, iar puterea de ieșire efectivă a fost de 100 W. În timpul operării, probele au fost răcite într-o baie de apă cu gheață, amestecate și centrifugate. Probele au fost utilizate pentru studii de citometrie în flux, în timp ce, pentru manipularea ulterioară, probele au fost supuse unui tratament termic (95°C, 5 min). Lizatele celulare brute au fost procesate cu un amestec de fenol:cloroform:alcool izoamilic (25:24:1). Un volum egal din acest amestec a fost adăugat la proba de lizat, soluția a fost agitată energic pe vortex timp de 15 s și centrifugată la 15.000 x g timp de 2 min la temperatura camerei (RT), în jur de 22°C. Faza apoasă superioară, care conținea ADN-ul genomic, a fost separată cu atenție și colectată într-un tub Eppendorf steril nou.
Ulterior, probele au fost sonicate pentru a fragmenta ADN-ul. Etapa de sonicare a fost realizată în aceleași condiții descrise mai sus. Pentru a evalua efectele fragmentării asupra ADN-ului genomic, probele au fost analizate prin electroforeză în gel de agaroză.
(…) Probele sonicate anterior timp de 2,5 min au fost supuse unei etape de extracție după tratamentul termic și centrifugare. ADN-ul eliberat a fost extras de două ori cu un amestec de fenol:cloroform:alcool izoamilic, iar apoi supus unei a doua sonicări timp de 0 – 15 min. Electroforeza în gel de agaroză a fost utilizată pentru a determina distribuția dimensiunilor ADN-ului supus fragmentării cu ultrasunete după extracție (Fig. din partea dreaptă sus). ADN-ul puternic fragmentat a fost evident prin prezența unei dâre (smear) de ADN, mai degrabă decât a benzilor de masă moleculară mare, care au fost eliminate din probele sonicate timp de 2,5 min sau mai mult. Sonicarea mai îndelungată a redus treptat lungimile fragmentelor la aproximativ 150 – 600 bp, iar sonicarea timp de 15 min a degradat și mai mult aceste fragmente, după cum se poate observa mai ales în partea superioară a dârei. Astfel, dimensiunea medie a fragmentelor de ADN a scăzut treptat odată cu durata ultrasonicării, iar tratamentul de 5 min a permis obținerea dimensiunilor fragmentelor de ADN celor mai potrivite pentru testele pe cipuri de tip array. În final, a fost stabilită procedura de preparare a analitului ADN, cuprinzând mai întâi 2 min de tratament cu ultrasunete, extracția ADN-ului (2×) și sonicarea ulterioară timp de 5 min. (Basselet et al. 2008)

Imunoprecipitarea cromatinei (ChIP)

Celulele HEK293 au fost cultivate conform descrierii de mai sus și fixate cu disuccinimidil-glutarat 2 mM timp de 45 min la temperatura camerei. Ulterior, celulele au fost spălate de două ori cu PBS. Cromatina a fost legată încrucișat timp de 10 min la temperatura camerei folosind formaldehidă 1% (v/v) și spălată de două ori cu PBS rece ca gheața. Reacția de legare încrucișată a fost oprită prin incubare cu glicină la o concentrație finală de 0,125 M timp de 5 min la temperatura camerei. După incubarea cu tripsină, celulele au fost răzuite de pe vasul de cultură celulară și spălate de două ori cu PBS. Peletul celular a fost resuspendat în tampon de liză (5 mM Pipes, pH 8,0, 85 mM KCl și 0,5% (v/v) Nonidet P-40), incubat pe gheață timp de 10 min și omogenizat cu un omogenizator Dounce. Ulterior, nucleii au fost peletați prin centrifugare (3500 x g, 5 min, 4 °C) și resuspendați în tampon pentru nuclei (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA și 1% (w/v) SDS). Nucleii au fost dezintegrați prin sonicare cu trei pulsuri de 20 s într-un sonicator UP50H (Hielscher Ultraschall Technologie) la o setare de ciclu 0,5 și amplitudine 30%, obținându-se fragmente de ADN genomic cu o dimensiune predominantă de 200 – 1000 bp. Pentru ChIP, 50g de ADN au fost diluate de 4 ori în tampon de imunoprecipitare (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (v/v) Triton X-100 și 0,01% (w/v) SDS). (Weiske et al. 2006)

Analiza modificărilor histonelor prin imunoprecipitarea cromatinei (ChIP)

Pe scurt, 6 x 10⁶ celule au fost spălate de două ori cu PBS și legate încrucișat pe placa de cultură timp de 15 min la temperatura camerei, în prezența formaldehidei 0,5%. Reacția de legare încrucișată a fost oprită prin adăugarea de glicină 0,125 M. Toate etapele ulterioare au fost efectuate la 48°C. Toate tampoanele au fost prerăcite și au conținut inhibitori de proteaze (Complete Mini, Roche). Celulele au fost spălate de două ori cu PBS și apoi răzuite. Peletele colectate au fost dizolvate în 1 ml tampon de liză (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) și au fost sonicate într-o baie de etanol rece timp de 10 cicluri la amplitudine 100% folosind un sonicator UP50H (Hielscher, Teltow, Germania). Fragmentarea cromatinei a fost vizualizată în gel de agaroză 1%. Fragmentele obținute s-au încadrat în intervalul 200–500pb. Cromatina solubilă a fost obținută prin centrifugarea probelor sonicate la 14.000g timp de 10 min la 48°C. Fracția solubilă a fost diluată 1/10 în tampon de diluție (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl), apoi alicotată și depozitată la 80°C până la utilizare. (Rodriguez et al. 2008)