Forfecare ADN cu ultrasunete

În timpul forfecării ADN-ului și ARN-ului, moleculele lungi de ADN sunt fragmentate în bucăți mai mici, un pas crucial în pregătirea probelor pentru construirea bibliotecii de secvențiere de ultimă generație (NGS). Forfecarea ADN-ului cu ultrasunete folosește forțele de cavitație acustică pentru a sparge ADN-ul sau ARN-ul în fragmente cuprinse între 100 bp și 5 kb. Această metodă permite un control precis asupra dimensiunii fragmentului, facilitând personalizarea la lungimea dorită a ADN-ului pentru rezultate optime de secvențiere.

Sforfecare ADN folosind Ultrasonication

Hielscher Ultrasonics oferă diverse soluții bazate pe ultrasunete pentru ADN, ARN și cromatină forfecare. Alegeți între un ultrasonicators de tip sondă (de exemplu, UP100H) pentru sonicare directă folosind un microtip, sau utilizați VialTweeeter sau cuphorn cu ultrasunete pentru prepararea indirectă a ADN-ului diferitelor probe simultan. Hielscher oferă dispozitivul ideal având în vedere nevoile dumneavoastră: indiferent dacă aveți 1 sau până la 10 probe, volume de la microlitri la litri – Sonicatoarele Hielscher vă vor satisface cerințele de a pregăti fragmente de ADN, ARN și cromatină la lungimea potrivită. Reproductibilitatea, operarea ușoară și controlul precis permit o bibliotecă fiabilă pentru secvențierea de ultimă generație.
Spre deosebire de fragmentarea ADN-ului enzimatic, forfecarea cu ultrasunete aplică forțe de forfecare mecanice pure fără a adăuga substanțe chimice. Prin setarea precisă a parametrilor procesului, forfecarea cu ultrasunete produce fragmente de ADN cu greutate moleculară mare (ADN plasmidic și genomic).
Acizii nucleici purificați pot fi amplificați înainte sau după o etapă de fragmentare.
Parametrii sonicare (putere, ciclu puls / explozii, timp și temperatură) pot fi controlate în condiții de siguranță prin intermediul setărilor software.

Protocoale pentru forfecare ADN cu ultrasunete

Pentru testul de imunoprecipitare a cromatinei

Pe scurt, celulele au fost placate în vase cu diametrul de 60 mm (400.000 pe vas) și transfectate cu RhoA siARN (așa cum este descris); după 72 de ore, au fost incubați cu formaldehidă (concentrație finală, 1%) timp de 10 minute la 37 ° C pentru a lega proteinele încrucișate cu ADN-ul. Reacția de reticulare a fost stinsă prin adăugarea unui volum de o zecime de 1,25 mol/l glicină, rezultând o concentrație finală de 125 mmol/l. Celulele au fost spălate de două ori cu PBS rece ca gheața, resuspendate în tamponul de testare a radioimunoprecipitațiilor [150 mmol / L NaCl, 1% NP40, 0,5% deoxicolat, 0,1% SDS, 5 mmol / L EDTA, 50 mmol / L Tris-HCl (pH 8,0)] conținând 1 mmol / L fluorură de fenilmetilsulfonil, 1 Ag / ml aprotinină și 1 Ag / ml pepstatină A și păstrate pe gheață timp de 30 de minute. Apoi, lizații celulari au fost sonicate pe gheață cu un Hielscher UP200S sonicator cu ultrasunete (3 x 40 s, amplitudine 40%, ciclu 1; Hielscher Ultrasonics GmbH) până când cromatinele reticulate au fost forfecate pentru a produce fragmente de ADN între 200 și 1.000 bp. O zecime din lizatul întreg a fost utilizată pentru a cuantifica cantitatea de ADN prezentă în diferite probe și a fost considerată ca “ADN total de intrare”. Supernatanții au fost incubați cu ADN de spermă de somon / proteine agaroză-50% suspensie pentru a reduce fondul nespecific. Imunoprecipitarea a fost apoi efectuată peste noapte la 4 ° C cu 5 Ag de anti-NF-nB p65 (Upstate) sau fără anticorpi (control negativ). Acești supernatanți au fost suplimentați cu 5 mol/L NaCl și încălziți peste noapte la 65°C pentru a inversa legăturile încrucișate proteină-ADN. Imunocomplecșii au fost tratați în continuare cu proteinază K fără DNază și RNază, iar ADN-ul a fost purificat prin extracție cu fenol/cloroform și precipitarea etanolului. PCR a fost efectuată cu primeri specifici corespunzători unei secvențe din regiunea promotoare a genei iNOS umane (primer p1: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; primer p2: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier și colab., 2008)

Studii de expresie EGFP

Pentru studiile de expresie, tulpina recombinantă L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience, Germania) cu gena pentru EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), cromozomială ssu integrată, a fost cultivată în diferite medii descrise anterior și suplimentată suplimentar cu 100 mg l^-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, Germania). În timpul cultivării s-au prelevat probe de 1 ml, centrifugate (2000 × g, 20°C, 10 min) și spălate cu soluție de NaCl 0,9%. Peleta a fost resuspendată în tampon (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM TDT) și dezintegrată prin sonificare cu procesorul cu ultrasunete UP400S (aplicarea energiei ∼ 400 Ws). Resturile celulare au fost îndepărtate prin centrifugare (6000 × g, 4°C, 5 min) și analizate prin electroforeză dodecil sulfat de sodiu – gel de poliacrilamidă (SDS-PAGE) în condiții reducătoare conform metodei Laemmli (1970) cu geluri poliacralamide 12,5%. Expresia EGFP a fost examinată în cultura agitată. (Fritsche și colab., 2007)

Imunoprecipitarea cromatinei

Testul de imunoprecipitare a cromatinei a fost efectuat utilizând ChIP-IT^TM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, SUA) conform instrucțiunilor producătorului, cu unele modificări. Pe scurt, podocitele umane diferențiate au fost reticulate cu formaldehidă 1% timp de 10 minute la temperatura camerei. Celulele au fost spălate cu PBS rece ca gheața, iar reacția de fixare a fost oprită prin adăugarea a 0,125 M glicină timp de 5 minute la temperatura camerei. Celulele au fost spălate din nou cu PBS rece ca gheața și răzuite din vas. Celulele au fost granulate prin centrifugare și resuspendate în tamponul de liză. După centrifugare, nucleele peletizate au fost resuspendate în tamponul de forfecare, incubate pe gheață timp de 30 de minute și cromatina a fost forfecată prin sonicare, de exemplu. UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Germania) la 25% putere 5 impulsuri de 20 sec fiecare pe gheață în fragmente de aproximativ 200-600 bp. Cromatina forfecată a fost apoi centrifugată și supernatantul a fost colectat. Pentru imunoprecipitări, 60 μl de cromatină au fost incubați cu 1 μg de anticorpi Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, SUA), nf-κB p65 (Abcam, Cambridge, Marea Britanie) sau NF-κB p50 (Abcam) sau cu IgG de iepure (Zymed Laboratories), ca martor negativ, peste noapte la 4°C cu rotație ușoară. Imunocomplexele legate de mărgele magnetice au fost colectate folosind un suport magnetic, spălate extensiv, iar legăturile încrucișate proteină/ADN au fost inversate și ADN-ul eluat pentru analiza PCR în timp real. (Ristola et al. 2009)

Pregătirea ADN-ului EHEC pentru analiza matricei de cipuri

Dispunerea lizatelor celulare și a ADN-urilor extrase
Granulele bacteriene suspendate în PBS până la concentrația finală dorită au fost tratate cu disruptor cu ultrasunete UP100H (Hielscher GmbH, Germania) echipat cu un microtip MS1 (1mm în diametru). Frecvența de funcționare a fost de 30 kHz, iar puterea efectivă de ieșire a fost de 100 W. În timpul operației, probele au fost răcite într-o baie de apă cu gheață, amestecate și centrifugate. Probele au fost utilizate pentru studii de citometrie în flux, în timp ce pentru manipularea ulterioară, probele au fost supuse unui tratament termic (95°C, 5 min). Lizații celulari brute au fost procesați cu un amestec de alcool fenol:cloroform:izoamilic (25:24:1). Un volum egal din acest amestec a fost adăugat la proba de lizat, soluția a fost vortexată viguros timp de 15 s și centrifugată la 15.000 x g timp de 2 minute la temperatura camerei (RT) în jur de 22°C. Faza apoasă superioară care conținea ADN-ul genomic a fost separată cu grijă și colectată într-un nou tub steril Eppendorf.
Ulterior, probele au fost sonicate pentru a fragmenta ADN-ul. Pasul sonicare a fost realizat în aceleași condiții ca cele descrise mai sus. Pentru a evalua efectele fragmentării asupra ADN-ului genomic, probele au fost analizate prin utilizarea electroforezei gelului de agaroză.
(…) Probele sonicate anterior pentru 2.5 min au fost supuse unei etape de extracție după tratament termic și centrifugare. ADN-ul eliberat a fost extras de două ori cu un amestec de alcool fenol:cloroform:izoamilic, și apoi supus la a doua sonicare timp de 0 – 15 min. Electroforeza gelului de agaroză a fost utilizată pentru a determina distribuția dimensiunii ADN-ului supus fragmentării cu ultrasunete post-extracție (Fig. în partea dreaptă sus). ADN-ul foarte fragmentat a fost evident din prezența unui frotiu ADN, mai degrabă decât benzi de greutate moleculară mare, care au fost eliminate din probe sonicate timp de 2,5 min sau mai mult. Sonicare mai lungă redus treptat lungimile fragmentelor la aproximativ 150 – 600 bp, și sonicare pentru 15 min degradat în continuare aceste fragmente, după cum se poate vedea mai ales prin partea superioară a frotiului. Astfel, dimensiunea medie a fragmentelor de ADN a scăzut treptat cu timpul de ultrasonication, iar tratamentul de 5 minute a permis obținerea dimensiunilor fragmentelor de ADN cele mai potrivite pentru testele de matrice de cipuri. În cele din urmă, procedura de preparare a analitului ADN cuprinzând primul 2 min de tratament cu ultrasunete, extracția ADN-ului (2×), și ulterior 5 min sonicare, a fost stabilit. (Basselet și colab., 2008)

Imunoprecipitarea cromatinei (ChIP)

Celulele HEK293 au fost cultivate conform descrierii de mai sus și fixate cu 2 mM disuccinimidil-glutarat timp de 45 min la temperatura camerei. Ulterior, celulele au fost spălate de două ori cu PBS. Cromatina a fost reticulată timp de 10 minute la temperatura camerei folosind formaldehidă 1% (v/v) și spălată de două ori cu PBS rece ca gheața. Reacția de reticulare a fost oprită prin incubarea cu glicină la o concentrație finală de 0,125 M timp de 5 minute la temperatura camerei. După incubarea cu tripsină, celulele au fost răzuite din vasul de cultură celulară și spălate de două ori cu PBS. Peleta celulară a fost resuspendată în tampon de liză (țevi de 5 mM, pH 8,0, 85 mM KCl și 0,5% (v / v) Nonidet P-40), incubată pe gheață timp de 10 minute și omogenizată cu un omogenizator Dounce. Ulterior, nucleele au fost granulate prin centrifugare (3500 x g, 5 min, 4 °C) și resuspendate în nuclee tampon (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA și 1% (m/v) SDS). Nucleele au fost perturbate prin sonicare cu trei impulsuri 20-s într-un UP50H sonicator (Hielscher Ultraschall Technologie) la o setare de ciclu 0,5 și amplitudine 30%, rezultând fragmente de ADN genomic cu o dimensiune în vrac de 200 – 1000 bp. Pentru ChIP, 50g de ADN au fost diluate de 4 ori în tampon de imunoprecipitare (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (v/v) Triton X-100 și 0,01% (g/v) SDS). (Weiske și colab., 2006)

Analiza modificării histonului prin imunoprecipitarea cromatinei (ChIP)

Pe scurt, 6 x 10⁶ celulele au fost spălate de două ori cu PBS și reticulate pe placa de cultură timp de 15 minute la temperatura camerei, în prezența formaldehidei 0,5%. Reacția de reticulare a fost oprită prin adăugarea a 0,125 M glicină. Toate etapele ulterioare au fost efectuate la 48°C. Toate soluțiile tampon au fost pre-răcite și au conținut inhibitori de protează (Complete Mini, Roche). Celulele au fost spălate de două ori cu PBS și apoi răzuite. Peletele colectate au fost dizolvate în 1 ml tampon de liză (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) și au fost sonicated într-o baie rece de etanol pentru 10 cicluri la 100% amplitudine folosind un UP50H sonicator (Hielscher, Teltow, Germania). Fragmentarea cromatinei a fost vizualizată în gel de agaroză 1%. Fragmentele obținute au fost în intervalul 200-500pb. Cromatina solubilă a fost obținută prin centrifugarea probelor sonicate la 14.000g timp de 10 min la 48 ° C. Fracțiunea solubilă a fost diluată 1/10 în tampon de diluție (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl) apoi alicitată și depozitată la 80 °C până la utilizare. (Rodriguez și colab., 2008)