Cu ultrasunete DNA Forfecare

• În timpul forfecare ADN-ului și ARN-ului, moleculele de ADN sunt rupte în bucăți mai mici. Fragmentarea ADN /ARN este unul dintre pașii importanți de pregătire a probelor necesari pentru a crea biblioteci pentru secvențierea de generație următoare (NGS).
• Ultrasunete forfecare ADN utilizează forțele cavitatie acustice pentru a rupe ADN-ul sau ARN-ul în bucăți de 100 – 5KB bp.
• forfecare cu ultrasunete permite fragmentarea ADN-ului precis și adaptarea la lungimea ADN dorit.

ADN-ul forfecare folosind Ultrasonication

Hielscher Ultrasonics ofera diverse solutii bazate pe ultrasunete pentru ADN, ARN și forfecare cromatinei. Alegeți între un tip sondă ultrasonicators (de exemplu UP100H) pentru sonicare directă folosind microvârf sau utilizați VialTweeeter sau cuphorn cu ultrasunete pentru prepararea ADN indirect diferitelor probe simultan. Hielscher ofera dispozitivul ideal pentru vedere nevoile dumneavoastra: batal aveți 1 sau până la 10 de probe, volume de la microlitru la volume litri – procesoare cu ultrasunete Hielscher sunt disponibile pentru a satisface cerințele dumneavoastră pentru a prepara ADN-ului, ARN-ului și fragmente cromatinei la lungimea corectă. Reproductibilitatea, operare ușoară și un control precis permite o bibliotecă de incredere pentru urmatoarea generatie secventiere.
In contrast cu fragmentarea ADN enzimatic, forfecare cu ultrasunete se aplică forțe mecanice de forfecare pură, fără a adăuga substanțe chimice. Prin stabilirea exactă a parametrilor de proces, forfecare ultrasonic produce fragmente mari de ADN cu greutate moleculară (plasmid și ADN genomic).
Acizii nucleici purificați pot fi amplificate înainte sau după o etapă de fragmentare.
Parametrii sonicare (putere, ciclu puls / rafale, timp și temperatură) pot fi controlate în condiții de siguranță prin intermediul setărilor software.

Protocoale pentru ultrasunete DNA Forfecare

Pentru Imunoprecipitarea Testul cromatinei

Pe scurt, celulele au fost placate în vase cu diametru de 60 mm (400.000 per vas) și transfectate cu siRNA RhoA (așa cum s-a descris); după 72 de ore, au fost incubate cu formaldehidă (concentrație finală, 1%) timp de 10 min la 37 ° C pentru a lega proteinele la ADN. Reacția de reticulare a fost stinsă prin adăugarea unui volum de o zecime de glicină 1,25 moli / l, dând o concentrație finală de 125 mmol / L. Celulele au fost spălate de două ori cu PBS răcit cu gheață, resuspendate în tampon de analiză de radioimunoprecipitare (150 mmol / l NaCI, 1% NP40, 0,5% deoxicolat, 0,1% SDS, 5 mmol / L EDTA, 50 mmoli / )] conținând 1 mmol / l fluorură de fenilmetilsulfonil, 1 Ag / ml aprotinină și 1 Ag / ml pepstatin A și ținută pe gheață timp de 30 min. Apoi, celulele lizate s-au sonicat pe gheață cu o Hielscher UP200S ultrasunete sonicator (3 x 40 s, amplitudine 40%, ciclul 1; Hielscher Ultrasonics GmbH) până când chromatins reticulate au fost forfecat pentru a produce fragmente ADN între 200 și 1000 pb. O zecime din întreg lizat a fost folosit pentru a cuantifica cantitatea de ADN prezent în probe diferite și considerate ca fiind “ADN-ul total de intrare”. Supernatantele au fost incubate cu spermă de somon ADN / proteină agaroză suspensie 50% pentru a reduce fondul nespecifică. Imunoprecipitarea a fost făcută apoi peste noapte la 4 ° C cu 5 Ag de p65 anti-NF-Nb (Upstate) sau fără anticorp (control negativ). Aceste Supernatanți au fost suplimentate cu 5 mol / l NaCl și încălzit peste noapte la 65 ° C pentru a reveni ADN-proteină legături încrucișate. Imunocomplexele au fost tratate suplimentar cu DNase- și RNază proteinaza K, iar ADN-ul a fost purificat prin extracție cu fenol / cloroform și precipitare cu etanol. PCR a fost efectuată cu primeri specifici care corespund unei secvențe în regiunea promotor a genei iNOS uman (primer p1: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; primer p2: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier și colab., 2008)

Studii EGFP-expresie

Pentru studii de expresie, recombinant tulpina L. tarentolae P10 :: F9Begfp1.4dBsat # 12 (Jena Bioscience, Germania) cu gena pentru EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), cromozomială SSU integrate, a fost cultivat în diferitele tipuri de media așa cum a fost descris anterior și în plus, suplimentat cu 100 mg l^{-1 de} Nourseothricin (Jena Bioscience, Germania). În timpul cultivării, au fost luate probe de 1 ml, centrifugate (2000 x g, 20 ° C, 10 min) și se spală cu soluție de NaCI 0,9%. Sedimentul a fost resuspendat în tampon (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) și se dezintegrează prin sonification cu procesor cu ultrasunete UP400S (Aplicarea energiei ~ 400 Ws). Reziduurile celulare au fost îndepărtate prin centrifugare (6000 x g, 4 ° C, 5 min) și analizat prin dodecil sulfat de sodiu - electroforeză pe gel de poliacrilamidă (SDS-PAGE) în condiții reducătoare conform metodei lui Laemmli (1970), cu 12,5% geluri polyacralamide . EGFP-exprimare a fost examinată în cultură agitată. (Fritsche și colab., 2007)

cromatinei imunoprecipitare

Testul cromatină imunoprecipitare a fost efectuat cu ajutorul cipului-IT^Tm Express (Motif activă, Carlsbad, CA, SUA) în conformitate cu instrucțiunile producătorului, cu unele modificări. Pe scurt, podocitelor umane diferențiate au fost reticulat cu 1% formaldehidă timp de 10 min la temperatura camerei. Celulele au fost spălate cu PBS rece ca gheața și reacția de fixare a fost stopată prin adăugarea de 0,125 M glicină timp de 5 min, la temperatura camerei. Celulele au fost spălate din nou cu PBS rece ca gheața și răzuite de pe vas. Celulele au fost peletizate prin centrifugare și resuspendate în tamponul de liză. După centrifugare, nucleele peletate au fost resuspendate în tamponul de forfecare, incubate pe gheață timp de 30 min, iar cromatina a fost forfecat prin sonicare, de ex UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Germania) la o putere de 25% 5 impulsuri de 20 sec fiecare pe gheață în fragmente de aproximativ 200-600 bp. Cromatina striată a fost apoi centrifugată și supernatantul a fost colectat. Pentru imunoprecipitări, s-au incubat 60 pl de cromatină cu 1 pg de Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, SUA), cu anticorpi NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, UK) sau NF-κB p50 (Abcam) IgG (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA, SUA), ca un control negativ, peste noapte la 4 ° C cu rotație ușoară. Imunocomplexurile legate de perlele magnetice au fost colectate utilizând un suport magnetic, spălate extensiv și reticulările proteină / ADN au fost inversate și ADN-ul a fost eluat pentru analiza PCR în timp real. (Ristola și colab., 2009)

prepararea ADN EHEC pentru analiza cip matrice

Dispunerea lizatele celulare și ADN-uri extrase
Peletele bacteriene suspendate în PBS la concentrația finală dorită au fost tratate cu ultrasunete disruptor UP100H (Hielscher GmbH, Germania) echipat cu un microtip MS1 (1 mm în diametru). Frecvența de operare a fost de 30 kHz, iar puterea de ieșire efectivă a fost de 100 W. În timpul operației probele au fost răcite într-o baie de apă cu gheață, amestecate și centrifugate. Probele au fost utilizate pentru studii de citometrie în flux, în timp ce pentru manipularea ulterioară, probele au fost supuse unui tratament termic (95 ° C, 5 minute). Lizatele celulare brute s-au prelucrat cu un amestec de fenol: cloroform: izoamil alcool (25: 24: 1). Un volum egal din acest amestec a fost adăugat la proba de lizat, soluția a fost turbionată viguros timp de 15 s și centrifugată la 15000 xg timp de 2 minute la temperatura camerei (RT) în jurul valorii de 22 ° C. Faza apoasă de sus conținând ADN-ul genomic a fost separată cu atenție și colectată într-un nou eprubetă steril Eppendorf.
Ulterior, probele s-au sonicat pentru a fragmenta ADN-ul. Etapa de sonicare a fost realizată în aceleași condiții ca cele descrise mai sus. Pentru a evalua efectele de fragmentare asupra ADN-ului genomic, probele au fost analizate utilizând electroforeza pe gel de agaroză.
(…) Probele sonicate anterior timp de 2,5 minute au fost supuse unei etape de extracție după tratament termic și centrifugare. ADN-ul eliberat a fost extras de două ori cu un amestec de fenol: cloroform: izoamil alcool și apoi supus la ultima sonicare timp de 0-15 minute. Electroforeza pe gel de agaroză a fost utilizată pentru a determina distribuția mărimii ADN supusă fragmentării ultrasonice post-extracție (fig., În partea din dreapta sus). ADN puternic fragmentat a fost evident din prezența unui frotiu ADN mai degrabă decât benzile cu greutate moleculară mare care au fost eliminate din probele sonicate timp de 2,5 minute sau mai mult. Sonicarea ulterioară a redus treptat lungimea fragmentelor la aproximativ 150-600 bp și sonicarea timp de 15 minute a degradat în continuare aceste fragmente, așa cum se poate vedea mai ales în partea superioară a frotiului. Astfel, dimensiunea medie a fragmentului ADN a scăzut treptat cu timpul de ultrasunete și tratamentul de 5 min a permis obținerea dimensiunilor fragmentelor de ADN cele mai potrivite pentru testele cu matrice de cipuri. În cele din urmă, a fost stabilită procedura de preparare a analitului ADN cuprinzând primele 2 minute de tratare cu ultrasunete, extracția ADN (2 x) și sonicarea ulterioară de 5 min. (Basselet și colab., 2008)

Cromatinei Imunoprecipitarea (ChIP)

Celulele HEK293 au fost cultivate așa cum s-a descris mai sus și s-au fixat cu 2 mM disuccinimidil-glutarat timp de 45 de minute la temperatura camerei. Ulterior, celulele au fost spălate de două ori cu PBS. Cromatina a fost reticulată timp de 10 minute la temperatura camerei utilizând formaldehidă 1% (v / v) și spălată de două ori cu PBS rece pe gheață. Reacția de reticulare a fost oprită prin incubare cu glicină la o concentrație finală de 0,125 M timp de 5 minute la temperatura camerei. După incubarea cu tripsină, celulele au fost răzuite din vasul de cultură celulară și spălate de două ori cu PBS. Peletul celular a fost resuspendat în tampon de liză (5 mM Tuburi, pH 8,0, 85 mM KCI și 0,5% (v / v) Nonidet P-40), incubat pe gheață timp de 10 minute și omogenizat cu un omogenizator Dounce. Ulterior, nucleele au fost peletizate prin centrifugare (3500 xg, 5 min, 4 ° C) și resuspendate în tampon nucleic (50 mM Tris-HCI, pH 8,1, 10 mM EDTA și 1% (g / v) SDS). Nucleii au fost întrerupți prin sonicare cu trei impulsuri de 20 de ori într-un UP50H sonicator (Hielscher Ultraschall Technologie) la o setare a ciclului 0,5 și amplitudine de 30%, obținându-se fragmente de ADN genomic, cu o dimensiune în vrac de 200-1000 bp. Pentru ChIP, 50g de ADN a fost diluat de 4 ori în tampon immunoprecipitation (16,7 mM Tris-HCI, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (v / v) Triton X-100 și 0,01% (g / v) SDS). (Weiske et al. 2006)

Analiza modificării Histone prin imunoprecipitare cromatinei (Chip)

Pe scurt, 6 x 10⁶ Celulele au fost spălate de două ori cu PBS și reticulate pe placa de cultură timp de 15 min la temperatura camerei, în prezența a 0,5% formaldehidă. reacția de reticulare a fost oprită prin adăugarea de 0,125 M glicină. Toate etapele ulterioare au fost efectuate la 48 ° C. Toate soluțiile tampon au fost pre-răcite și conține inhibitori de protează (Complete Mini, Roche). Celulele au fost spălate de două ori cu PBS și apoi fragmentat. pelete colectate au fost dizolvate în 1 ml de tampon de liză (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) și au fost sonicate într-o baie de etanol rece, timp de 10 cicluri la 100% amplitudine folosind un UP50H sonicator (Hielscher, Teltow, Germania). fragmentarea cromatinei a fost vizualizată în 1% gel de agaroză. Fragmentele obținute au fost în intervalul 200-500pb. cromatină solubila a fost obținută prin centrifugarea probelor sonicate la 14.000 g timp de 10 min la 48 ° C. Fracțiunea solubilă a fost diluat 1/10 în tampon de diluare (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCI) apoi alicotat și depozitat la 80 ° C până la utilizare. (Rodriguez și colab. 2008)