Ultrasonication este o tehnică fiabilă pentru a fragmenta ADN-ul plasmid. Amplitudinea controlabilă cu precizie, modul de pulsație și controlul temperaturii sunt cele mai importante caracteristici ale unui ultrasonicator pentru fragmentarea plasmidă non-dăunătoare. În plus, utilizarea anumitor agenți ajută la protejarea împotriva degradării plasmidelor. Hielscher Ultrasonics oferă diverse soluții pentru fragmentarea plasmidă controlată din flacoane unice, sonicare simultană a numeroase probe, precum și plăci multi-bine. Aflați mai multe despre fragmentarea plasmidă cu ultrasunete de succes!

Plasmid forfecare folosind Ultrasonication

Când probele de ADN sunt supuse undelor ultrasonice, vibrațiile generate cu ultrasunete creează cavitație acustică în lichidul care forfecează sau rupe molecule de ADN cu greutate moleculară mare prin forțe mecanice. Sonicare este metoda cea mai utilizată pe scară largă pentru experimente de forfecare a ADN-ului în vrac, inclusiv aplicații, cum ar fi imunoprecipitarea cromatinei (ChIP), pentru care dimensiunile mici ale fragmentelor sunt absolut cruciale pentru a obține o rezoluție ridicată. (cf. Tseng et al., 2012)
ADN-ul plasmid (pDNA) este o formă specifică de ADN, caracterizată prin forma inelului și se găsește în bacterii și în unele eucariote.
PDNA supercoiled este forma dorită de ADN plasmid, deoarece prezintă cele mai bune rezultate în procesele de down-stream, cum ar fi secvențierea automată și transfectarea. Ultrasonication este potrivit pentru a fragmenta pDNA, inclusiv pDNA supercoiled, cu succes.
Thompson et al. (2008) a demonstrat că sonicare plasmidă, care este cunoscut pentru a fragmenta ADN-ul suprapuse, este o modalitate eficientă de a îmbunătăți secvența phred20 lungimi de citire până la punctul în care acestea nu sunt semnificativ diferite de șablonul de control Beckman Coulter sau plasmide liniarizate enzimatic.

Utilizarea vectorilor Plasmid

Plasmidele sunt adesea folosite ca instrumente pentru a clona, transfera și manipula genele. Când plasmidele sunt utilizate experimental în aceste scopuri, ele se numesc vectori. Fragmentele de ADN sau genele pot fi inserate într-un vector plasmid, creând o așa-numită plasmidă recombinantă. Vectorii plasmide sunt utilizați ca vehicule pentru a conduce ADN-ul recombinant într-o celulă gazdă și sunt o componentă cheie a clonării moleculare.
“Vectorii non-virali sunt studiați pe scară largă pentru utilizarea lor potențială în terapia genică pentru a trata diverse boli complicate. Vectorii non-virali protejează ADN-ul plasmid împotriva degradării fizice, chimice și enzimatice și livrează molecula de ADN la locul țintă. De exemplu, lipozomii cationici, chitosanul și alte nanoparticule încărcate pozitiv formează complexe cu ADN plasmid prin interacțiuni electrostatice. Cu toate acestea, lipozomii cationici/complexele ADN plasmide ușor formate sunt relativ mari (adică 300-400 nm) și eterogene în natură, ceea ce le face dificil de utilizat în aplicațiile farmaceutice. ADN-ul plasmid mare și eterogen / lipozomi, ADN plasmid / aerosoli, și complexe de ADN plasmid / peptide pot fi reduse la particule mai mici, și omogene folosind ultrasonication.” (Sarker et al., 2019)
Un exemplu elocvent pentru utilizarea vectorilor plasmide este CRISPR–Cas9. Sistemul CRISPR-Cas9 este de obicei livrat celulelor ca o singură plasmidă mare sau mai multe plasmide mai mici care codifică o secvență țintă, un ghid CRISPR și Cas9.

Pregătirea cu ultrasunete a nanoparticulelor PLGA încărcate cu ADN prin nanoprecipitare

Jo et al. (2020) a folosit poli (acid lactic-co-glicolic) (PLGA) pentru a forma un purtător de nanoparticule pentru livrarea unui model CRISPR-Cas9 plasmidă în macrofagele primare derivate din măduva osoasă. Pentru nanoprecipitarea nanoparticulelor PLGA, plga cu două grupuri finale diferite (grupuri de esteri și amine) au fost utilizate cu obiectivul ca capacele finale de amine încărcate pozitiv să crească eficiența încapsulării și încărcarea datorită interacțiunilor de încărcare dintre acesta și coloana vertebrală încărcată negativ a ADN-ului. Într-un tub de centrifugare conică din polipropilenă de 50 ml, 100 mg Pluronic F127 a fost dizolvat în 20 ml de apă DI autoclavată prin amestecarea vortexului urmată de 30 min de sonicare blândă folosind o baie cu ultrasunete (vezi CupHorn). A fost adăugată o bară magnetică de agitare autoclavată și soluția a fost amestecată la 600 RPM timp de 30 de minute, în timp ce celelalte soluții au fost făcute. Labware din plastic a fost folosit în loc de sticlărie pe tot parcursul pentru a minimiza adsorbția nespecifice de ADN- ul. Soluțiile de PLGA dizolvate în DMF (44,48 mg/ ml) și TIPS pentacene dizolvate în THF (0,667 mg/ml) au fost făcute separat. PLGA a fost lăsată quiescently să se ude în DMF timp de 30 de minute înainte de a fi sonicată timp de 30 min. (pentru protocolul complet a se vedea Jo et al., 2020)

Protecția ADN-ului plasmid în timpul Sonicare

ADN-ul, inclusiv plasmidele și plasmidele suprapuse, sunt o degradare extrem de sensibilă. Toate metodele de fragmentare disponibile sunt cunoscute pentru anumite dezavantaje. Fragmentarea ADN-ului cu ultrasunete este una dintre metodele preferate, deoarece sonicare controlată în combinație cu măsuri de protecție permite reducerea forfecare- și căldură induse de deteriorarea firelor de ADN.
Pe lângă setările de amplitudine scăzută, modul de pulsație și controlul temperaturii în timpul forfecării ADN-ului cu ultrasunete, utilizarea anumitor agenți a arătat un efect protector semnificativ împotriva degradării ADN-ului. De exemplu, diferiți polimeri, peptide și lipide protejează ADN-ul plasmid în timpul ultrasonication.

Stabilitatea ADN-ului plasmid și nanocomplexele ADN/IL plasmide împotriva stresului de forfecare cu ultrasunete au fost investigate folosind testul de electroforeză cu gel de agaroză. Atât ADN-ul plasmidă și plasmidă ADN/IL nanocomplexe au fost supuse stresului de forfecare cu ultrasunete pentru diferite puncte de timp. ADN-ul plasmid a fost expus la stres de forfecare cu ultrasunete pentru 0, 10, 20, 30, și 40 de minute. Cu toate acestea, nanocomplexele ADN/IL plasmide au fost expuse la stres de forfecare cu ultrasunete timp de 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 și 120 de minute.
(studiu și imagine: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) a demonstrat că atunci când nanostructurile ADN plasmid / lichid ionic (pDNA / IL) au fost supuse stresului de forfecare cu ultrasunete pentru 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 și 120 min și complexe cu agentul de livrare a genelor cationice disponibile în comerț lipofectamină, procentul de celule fluorescente pozitive a fost de 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65%, respectiv 50%(vezi graficul de mai jos). Procentul de celule fluorescente pozitive a crescut atunci când nanostructurile au fost supuse stresului de forfecare cu ultrasunete timp de 10 și 20 de minute și, ulterior, a scăzut lent.

Influența lichidului ionic [Bmim][PF6] asupra livrării ADN-ului plasmid către celulele COS7. Plasmid ADN /IL (lichid ionic) nanocomplexes au fost supuse stresului de forfecare cu ultrasunete timp de până la 120 minute și complexate cu LA înainte de a livra în celulele COS7. Datele arată numărul mediu (%) de celule HeLa pozitive GFP numărate în 10 câmpuri microscopice diferite, iar experimentul a fost efectuat de mai multe ori în trei zile diferite. (Studiu și diagramă: ©Sarker et al., 2019)

Prepararea lizat cu ultrasunete

Protocolul de liză celulară cu ultrasunete
Începeți cu o probă îmbogățită de celule care a fost preparată printr-o metodă de separare celulară (de exemplu, separarea celulelor imunomagnetice, sortarea celulelor activate cu fluorescență (FACS), centrifugarea gradientului de densitate, izolarea celulelor de imunodensitate).
Probele de celule trebuie să arate un volum de un tampon de liză, care este adecvat pentru scopul experimental și ultrasonicator de tip sondă.
Tampoane hipotonice sunt preferate, deoarece acestea sporesc liza celulelor cu ultrasunete. Este important ca aditivii și concentrația de sare să fie utilizate în mod corespunzător.
Selectați dispozitivul de liză cu ultrasunete: Pentru sonicare indirectă de flacoane, VialTweeter sau CupHorn sunt recomandate. Pentru plăci multiwell, UIP400MTP este ultrasonicator ideal. Și sonicare clasică de tip sondă, un omogenizator cu ultrasunete ca UP100H sau UP200Ht cu un micro-vârf sunt cele mai potrivite.
Protocolul pentru sonicare de tip sondă: Locul sonda ultrasonicator în volumul probei într-un tub de microcentrifugă și sonicate timp de aproximativ 10 secunde. În funcție de proba de ADN, sonicare ar putea fi repetată de una sau două ori mai mult. Aportul necesar de energie cu ultrasunete (Ws / ml) depinde de vâscozitatea probei și tipul de ADN. Răcirea prin baie de gheață și modul de pulsație al ultrasonicatorului ajută la prevenirea degradării termice a probei.
După liza cu ultrasunete, proba este centrifugată pentru a separa resturile de peleți (conținând celule nealizate, nuclee și organite nealizate)
Dacă eșantionul nu este prelucrat imediat în continuare, acesta poate fi depozitat la o temperatură adecvată pentru a-și păstra viabilitatea.

Ultrasonicators pentru fragmentarea ADN-ului

Hielscher Ultrasonics oferă diverse platforme bazate pe ultrasunete pentru ADN, ARN și fragmentarea cromatinei. Aceste platforme diferite includ sonde cu ultrasunete (sonotrodes), soluții indirecte sonicare pentru pregătirea simultană a probelor de mai multe tuburi sau plăci multi-bine (de exemplu, plăci de 96 de bine, plăci de microtitrare), sonoreactors, și cuphorns cu ultrasunete. Toate platformele pentru forfecare ADN-ul sunt alimentate de frecvență reglate, procesoare cu ultrasunete de înaltă performanță, care sunt controlabile cu precizie și oferă rezultate reproductibile.

Procesoare cu ultrasunete pentru orice număr de probă și dimensiune

Cu ultrasonicators multi-eșantion Hielscher VialTweeter (pentru până la 10 tuburi de testare) și UIP400MTP (pentru microplates / plăci multiwell) devine ușor posibil pentru a reduce timpul de procesare a probei datorită ultrasonication intens și precis controlabile în timp ce obțineți distribuția și randamentul dorit dimensiunea fragmentului de ADN. Fragmentarea ADN-ului cu ultrasunete face etapele de pregătire plasmidă eficiente, fiabile și scalabile. Protocoalele pot fi scalate liniar de la una la numeroase probe prin aplicarea unor parametri cu ultrasunete constanți.
Ultrasonicators sondă cu unul până la cinci degete sunt ideale pentru prepararea numerelor de probă mai mici. Ultrasonicators de laborator Hielscher sunt disponibile cu diferite niveluri de putere, astfel încât să puteți alege disruptor cu ultrasunete ideal pentru aplicarea legată de ADN-ul.