Pregătirea plasmidelor folosind ultrasonication

Ultrasonication este o tehnică fiabilă pentru fragmentarea ADN-ului plasmid. Amplitudinea controlabilă cu precizie, modul de pulsație și controlul temperaturii sunt cele mai importante caracteristici ale unui ultrasonicator pentru fragmentarea plasmidelor care nu dăunează acestora. În plus, utilizarea anumitor agenți ajută la protejarea împotriva degradării plasmidelor. Hielscher Ultrasonics oferă diverse soluții pentru fragmentarea controlată a plasmidelor din flacoane unice, sonicare simultană a numeroase probe, precum și plăci multi-godeu. Aflați mai multe despre fragmentarea plasmidelor cu ultrasunete de succes!

Forfecare plasmidă folosind Ultrasonication

Atunci când probele de ADN sunt supuse undelor ultrasonice, vibrațiile generate ultrasonically creează cavitație acustică în lichidul care foarfecă sau rupe moleculele de ADN cu greutate moleculară mare prin forțe mecanice. Sonicare este metoda cea mai utilizată pe scară largă pentru experimente de forfecare ADN în vrac, inclusiv aplicații, cum ar fi imunoprecipitarea cromatinei (ChIP), pentru care dimensiunile fragmentelor mici sunt absolut cruciale pentru a obține o rezoluție înaltă. (cf. Tseng et al., 2012)
ADN-ul plasmidic (ADNp) este o formă specifică de ADN, caracterizată prin forma inelului și se găsește în bacterii și unele eucariote.
ADNp-ul superspiralat este forma dorită de ADN plasmid, deoarece prezintă cele mai bune rezultate în procesele din aval, cum ar fi secvențierea automată și transfecția. Ultrasonication este potrivit pentru a fragmenta pDNA, inclusiv ADNp supercoiled, cu succes.
Thompson et al. (2008) au demonstrat că sonicarea plasmidelor, despre care se știe că fragmentează ADN-ul superspiralat, este o modalitate eficientă de a îmbunătăți lungimile de citire a secvenței phred20 până la punctul în care acestea nu sunt semnificativ diferite de șablonul de control al lui Beckman Coulter sau de plasmidele liniarizate enzimatic.

Utilizarea vectorilor plasmidici

Plasmidele sunt adesea folosite ca instrumente pentru clonarea, transferul și manipularea genelor. Când plasmidele sunt utilizate experimental în aceste scopuri, ele se numesc vectori. Fragmentele de ADN sau genele pot fi inserate într-un vector plasmid, creând o așa-numită plasmidă recombinantă. Vectorii plasmidici sunt utilizați ca vehicule pentru a conduce ADN-ul recombinant într-o celulă gazdă și sunt o componentă cheie a clonării moleculare.
“Vectorii non-virali sunt studiați pe larg pentru utilizarea lor potențială în terapia genică pentru tratarea diferitelor boli complicate. Vectorii non-virali protejează ADN-ul plasmidic împotriva degradării fizice, chimice și enzimatice și livrează molecula de ADN la locul țintă. De exemplu, lipozomii cationici, chitosanul și alte nanoparticule încărcate pozitiv formează complexe cu ADN-ul plasmidic prin interacțiuni electrostatice. Cu toate acestea, lipozomii cationici / complexele ADN plasmidice ușor formate sunt relativ mari (adică 300-400 nm) și eterogene în natură, ceea ce le face dificil de utilizat în aplicații farmaceutice. ADN-ul plasmidic mare și eterogen / lipozomi, ADN-ul plasmidic / aerosoli, și ADN-ul plasmidic / complexe peptide pot fi reduse la particule mai mici, și omogene folosind ultrasonication.” (Sarker și colab., 2019)
Un exemplu proeminent pentru utilizarea vectorilor plasmidici este CRISPR-Cas9. Sistemul CRISPR-Cas9 este de obicei livrat celulelor ca o singură plasmidă mare sau mai multe plasmide mai mici care codifică o secvență țintă, un ghid CRISPR și Cas9.

Pregătirea cu ultrasunete a nanoparticulelor PLGA încărcate cu ADN prin nanoprecipitare

Jo et al. (2020) au folosit acid poli(lactic-co-glicolic) (PLGA) pentru a forma un purtător de nanoparticule pentru livrarea unui model de plasmidă CRISPR-Cas9 în macrofagele primare derivate din măduva osoasă. Pentru nanoprecipitarea nanoparticulelor PLGA, PLGA cu două grupuri finale diferite (grupări ester și amină) au fost utilizate cu obiectivul ca capacele de capăt de amină încărcate pozitiv să crească eficiența și încărcarea încapsulării datorită interacțiunilor de încărcare dintre aceasta și coloana vertebrală încărcată negativ a ADN-ului. Într-un tub conic conic de centrifugă din polipropilenă 50 ml, 100 mg Pluronic F127 a fost dizolvat în 20 ml apă DI autoclavizată prin amestecare vortex urmată de 30 min de sonicare blândă folosind o baie cu ultrasunete (vezi CupHorn). A fost adăugată o bară de agitare magnetică autoclavizată și soluția a fost amestecată la 600 RPM timp de 30 de minute în timp ce celelalte soluții au fost făcute. Obiectele de laborator din plastic au fost folosite în locul articolelor din sticlă pentru a minimiza adsorbția nespecifică a ADN-ului. Soluțiile de PLGA dizolvate în DMF (44,48 mg/ml) și pentacenul TIPS dizolvat în THF (0,667 mg/ml) au fost realizate separat. PLGA a fost lăsat liniștit să se ude în DMF timp de 30 de minute înainte de a fi sonicat timp de 30 de minute. (pentru protocolul complet, a se vedea Jo et al., 2020)

Protecția ADN-ului plasmidic în timpul sonicării

ADN-ul, inclusiv plasmidele și plasmidele superspiralate, se degradează foarte sensibil. Toate metodele de fragmentare disponibile sunt cunoscute pentru anumite dezavantaje. Fragmentarea ADN-ului cu ultrasunete este una dintre metodele preferate, deoarece sonicare controlată în combinație cu măsuri de protecție permite reducerea deteriorării induse de forfecare și căldură a catenelor ADN.
Pe lângă setările de amplitudine scăzută, modul de pulsare și controlul temperaturii în timpul forfecării ADN-ului cu ultrasunete, utilizarea anumitor agenți a arătat un efect protector semnificativ împotriva degradării ADN-ului. De exemplu, diferiți polimeri, peptide și lipide protejează ADN-ul plasmidic în timpul ultrasonication.

Stabilitatea ADN-ului plasmidic și a nanocomplexelor ADN plasmidic / IL împotriva stresului de forfecare cu ultrasunete a fost investigată utilizând testul de electroforeză în gel de agaroză. Atât ADN-ul plasmid, cât și nanocomplexele ADN plasmidic / IL au fost supuse stresului de forfecare cu ultrasunete pentru diferite momente de timp. ADN-ul plasmidic a fost expus la stres de forfecare cu ultrasunete timp de 0, 10, 20, 30 și 40 de minute. Cu toate acestea, nanocomplexele ADN plasmidic / IL au fost expuse la stres de forfecare cu ultrasunete timp de 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 și 120 de minute.
(studiu și imagine: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) au demonstrat că atunci când nanostructurile ADN-ului plasmidic / lichidului ionic (ADNp/IL) au fost supuse stresului de forfecare cu ultrasunete timp de 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 și 120 min și complexate cu agentul de livrare a genei cationice disponibile comercial lipofectamină, procentul celulelor fluorescente pozitive a fost de 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65% și, respectiv, 50% (vezi graficul de mai jos). Procentul de celule fluorescente pozitive a crescut atunci când nanostructurile au fost supuse stresului de forfecare cu ultrasunete timp de 10 și 20 de minute și, ulterior, a scăzut lent.

Influența lichidului ionic [Bmim][PF6] asupra livrării ADN-ului plasmidic celulelor COS7. Nanocomplexele ADN plasmidic / IL (lichid ionic) au fost supuse stresului de forfecare cu ultrasunete timp de până la 120 de minute și complexate cu LA înainte de a fi livrate în celulele COS7. Datele arată numărul mediu (%) de celule HeLa GFP pozitive numărate în 10 câmpuri microscopice diferite, iar experimentul a fost efectuat de mai multe ori în trei zile diferite. (Studiu și diagramă: ©Sarker și colab., 2019)

Pregătirea cu ultrasunete lizat

Protocol de liză celulară cu ultrasunete
Începeți cu un eșantion îmbogățit de celule care a fost preparat printr-o metodă de separare celulară (de exemplu, separarea celulelor imunomagnetice, sortarea celulelor activate prin fluorescență (FACS), centrifugarea gradientului de densitate, izolarea celulelor imunodensității).
Probele de celule trebuie să prezinte un volum de tampon de liză care este adecvat scopului experimental și ultrasonicator de tip sondă.
Tampoanele hipotonice sunt preferate, deoarece sporesc liza celulelor cu ultrasunete. Este important ca aditivii și concentrația de sare să fie utilizate în mod corespunzător.
Selectați dispozitivul de liză cu ultrasunete: Pentru sonicare indirectă a flacoanelor, se recomandă VialTweeter sau CupHorn. Pentru plăcile multiwell, UIP400MTP este ultrasonicatorul ideal. Și sonicare clasică de tip sondă, un omogenizator cu ultrasunete ca UP100H sau UP200Ht cu un micro-vârf sunt cele mai potrivite.
Protocol pentru sonicare tip sondă: Plasați sonda ultrasonicator în volumul probei într-un tub de microcentrifugă și sonicate timp de aproximativ 10 secunde. În funcție de proba de ADN, sonicare ar putea fi repetate o dată sau de două ori mai mult. Intrarea necesară a energiei cu ultrasunete (Ws / ml) depinde de vâscozitatea probei și de tipul ADN. Răcirea prin baie de gheață și modul de pulsare al ultrasonicator ajută la prevenirea degradării termice a eșantionului.
După liza cu ultrasunete, proba este centrifugată pentru a separa resturile de pelete (care conțin celule nelizate, nuclee și organite nelizate)
În cazul în care proba nu este prelucrată imediat în continuare, aceasta poate fi depozitată la o temperatură adecvată pentru a-și păstra viabilitatea.

Ultrasonicators pentru fragmentarea ADN-ului

Hielscher Ultrasonics oferă diverse platforme bazate pe ultrasunete pentru ADN, ARN, și fragmentarea cromatinei. Aceste platforme diferite includ sonde cu ultrasunete (sonotrodes), soluții indirecte sonicare pentru pregătirea simultană a probei de mai multe tuburi sau plăci cu mai multe godeuri (de exemplu, plăci cu 96 de puțuri, plăci de microtitrare), sonoreactori și cuphorns cu ultrasunete. Toate platformele pentru forfecarea ADN-ului sunt alimentate de procesoare cu ultrasunete de înaltă performanță, reglate în frecvență, care sunt controlabile cu precizie și oferă rezultate reproductibile.

Procesoare cu ultrasunete pentru orice număr și dimensiune de probă

Cu ultrasonicators multi-eșantion Hielscher VialTweeter (pentru până la 10 eprubete) și UIP400MTP (pentru microplates / plăci multiwell), devine ușor posibil să se reducă timpul de procesare a probei datorită ultrasonication intens și precis controlabil, obținând în același timp distribuția dorită a dimensiunii fragmentelor de ADN și randamentul. Fragmentarea ADN-ului cu ultrasunete face ca etapele de preparare a plasmidelor să fie eficiente, fiabile și scalabile. Protocoalele pot fi scalate liniar de la una la mai multe probe prin aplicarea unor parametri ecografici constanți.
Sonda ultrasonicators cu unul până la cinci degete sunt ideale pentru prepararea unui număr mai mic de probe. Hielscher ultrasonicators de laborator sunt disponibile cu diferite niveluri de putere, astfel încât să puteți alege disruptor cu ultrasunete ideal pentru aplicația legate de ADN.