Prepararea plasmidelor prin ultrasonicare

Ultrasonicarea este o tehnică fiabilă pentru fragmentarea ADN-ului plasmidic. Amplitudinea controlabilă cu precizie, modul de pulsație și controlul temperaturii sunt cele mai importante caracteristici ale unui ultrasonicator pentru fragmentarea plasmidelor fără deteriorare. În plus, utilizarea anumitor agenți ajută la protejarea împotriva degradării plasmidelor. Hielscher Ultrasonics oferă diverse soluții pentru fragmentarea controlată a plasmidelor, de la flacoane individuale și sonicarea simultană a numeroase probe până la plăci cu mai multe godeuri. Aflați mai multe despre fragmentarea ultrasonică reușită a plasmidelor!

Forfecarea plasmidelor prin ultrasonicare

Atunci când probele de ADN sunt supuse undelor ultrasonice, vibrațiile generate ultrasonic creează cavitație acustică în lichid, care forfecă sau rupe moleculele de ADN cu masă moleculară mare prin forțe mecanice. Sonicarea este cea mai utilizată metodă pentru experimentele de forfecare în masă a ADN-ului, inclusiv pentru aplicații precum imunoprecipitarea cromatinei (ChIP), pentru care dimensiunile mici ale fragmentelor sunt absolut esențiale pentru obținerea unei rezoluții înalte. (cf. Tseng et al., 2012)
ADN-ul plasmidic (pDNA) este o formă specifică de ADN, caracterizată prin forma sa inelară, și se găsește în bacterii și în unele eucariote.
pDNA superspiralizat este forma dorită a ADN-ului plasmidic, deoarece prezintă cele mai bune rezultate în procesele din aval, cum ar fi secvențierea automată și transfecția. Ultrasonicarea este adecvată pentru fragmentarea cu succes a pDNA, inclusiv a pDNA superspiralizat.
Thompson et al. (2008) au demonstrat că sonicarea plasmidelor, cunoscută pentru faptul că fragmentează ADN-ul superspiralizat, este o modalitate eficientă de a îmbunătăți lungimile de citire phred20 ale secvențelor până la punctul în care acestea nu diferă semnificativ de șablonul de control Beckman Coulter sau de plasmidele linearizate enzimatic.

Utilizarea vectorilor plasmidici

Plasmidele sunt adesea utilizate ca instrumente pentru clonarea, transferul și manipularea genelor. Atunci când plasmidele sunt utilizate experimental în aceste scopuri, ele sunt numite vectori. Fragmente de ADN sau gene pot fi inserate într-un vector plasmidic, creând o așa-numită plasmidă recombinantă. Vectorii plasmidici sunt utilizați ca vehicule pentru a introduce ADN recombinant într-o celulă gazdă și reprezintă o componentă-cheie a clonării moleculare.
„Vectorii non-virali sunt studiați intens pentru potențiala lor utilizare în terapia genică pentru tratarea diverselor boli complicate. Vectorii non-virali protejează ADN-ul plasmidic împotriva degradării fizice, chimice și enzimatice și livrează molecula de ADN la situsul țintă. De exemplu, lipozomii cationici, chitosanul și alte nanoparticule încărcate pozitiv formează complecși cu ADN-ul plasmidic prin interacțiuni electrostatice. Cu toate acestea, complecșii lipozomi cationici/ADN plasmidic, care se formează ușor, sunt relativ mari (adică 300–400 nm) și heterogeni prin natura lor, ceea ce îi face dificil de utilizat în aplicații farmaceutice. Complecșii mari și heterogeni ADN plasmidic/lipozomi, ADN plasmidic/aerosoli și ADN plasmidic/peptide pot fi reduși la particule mai mici și omogene prin ultrasonicare.” (Sarker et al., 2019)
Un exemplu proeminent de utilizare a vectorilor plasmidici este CRISPR–Cas9. Sistemul CRISPR–Cas9 este de obicei livrat celulelor sub forma unei singure plasmide mari sau a mai multor plasmide mai mici care codifică o secvență țintă, un ghid CRISPR și Cas9.

Prepararea ultrasonică a nanoparticulelor PLGA încărcate cu ADN prin nanoprecipitare

Jo et al. (2020) au utilizat poli(acid lactic-co-glicolic) (PLGA) pentru a forma un purtător nanoparticulat pentru livrarea unei plasmide model CRISPR–Cas9 în macrofage primare derivate din măduva osoasă. Pentru nanoprecipitarea nanoparticulelor PLGA, s-a utilizat PLGA cu două grupări terminale diferite (grupări ester și amină), cu obiectivul ca terminațiile amină încărcate pozitiv să crească eficiența de încapsulare și încărcarea datorită interacțiunilor de sarcină dintre acestea și scheletul încărcat negativ al ADN-ului. Într-un tub conic de centrifugă din polipropilenă de 50 mL, 100 mg de Pluronic F127 au fost dizolvate în 20 mL de apă DI autoclavată prin amestecare vortex, urmată de 30 min de sonicare blândă folosind o baie ultrasonică (vedeți CupHorn). S-a adăugat o bară de agitare magnetică autoclavată, iar soluția a fost amestecată la 600 RPM timp de 30 min, în timp ce au fost preparate celelalte soluții. Pe tot parcursul s-au utilizat ustensile de laborator din plastic în locul celor din sticlă, pentru a minimiza adsorbția nespecifică a ADN-ului. Soluțiile de PLGA dizolvat în DMF (44,48 mg/ ml) și de TIPS pentacen dizolvat în THF (0,667 mg/ml) au fost preparate separat. PLGA a fost lăsat în repaus să se umecteze în DMF timp de 30 min înainte de a fi sonicat timp de 30 min. (pentru protocolul complet, vedeți Jo et al., 2020)

Protecția ADN-ului plasmidic în timpul sonicării

ADN-ul, inclusiv plasmidele și plasmidele superspiralizate, este foarte sensibil la degradare. Toate metodele de fragmentare disponibile sunt cunoscute pentru anumite dezavantaje. Fragmentarea ultrasonică a ADN-ului este una dintre metodele preferate, deoarece sonicarea controlată, în combinație cu măsuri de protecție, permite reducerea deteriorării catenelor de ADN induse de forfecare și de căldură.
Pe lângă setările de amplitudine scăzută, modul de pulsație și controlul temperaturii în timpul forfecării ultrasonice a ADN-ului, utilizarea anumitor agenți a prezentat un efect protector semnificativ împotriva degradării ADN-ului. De exemplu, diverși polimeri, peptide și lipide protejează ADN-ul plasmidic în timpul ultrasonicării.

Stabilitatea ADN-ului plasmidic și a nanocomplecșilor ADN plasmidic/IL față de stresul de forfecare ultrasonic a fost investigată folosind testul de electroforeză în gel de agaroză. Atât ADN-ul plasmidic, cât și nanocomplecșii ADN plasmidic/IL au fost supuși stresului de forfecare ultrasonic pentru diferite intervale de timp. ADN-ul plasmidic a fost expus stresului de forfecare ultrasonic timp de 0, 10, 20, 30 și 40 de minute. În schimb, nanocomplecșii ADN plasmidic/IL au fost expuși stresului de forfecare ultrasonic timp de 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 și 120 de minute.
(studiu și imagine: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) au demonstrat că, atunci când nanostructurile ADN plasmidic / lichid ionic (pDNA/IL) au fost supuse stresului de forfecare ultrasonic timp de 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 și 120 min și complexate cu agentul cationic de livrare a genelor disponibil comercial lipofectamină, procentul celulelor fluorescent pozitive a fost de 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65% și, respectiv, 50% (vedeți graficul de mai jos). Procentul celulelor fluorescent pozitive a crescut atunci când nanostructurile au fost supuse stresului de forfecare ultrasonic timp de 10 și 20 min, iar ulterior a scăzut lent.

Influența lichidului ionic [Bmim][PF6] asupra livrării ADN-ului plasmidic în celulele COS7. Nanocomplecșii ADN plasmidic/IL (lichid ionic) au fost supuși stresului de forfecare ultrasonic timp de până la 120 de minute și complexați cu LA înainte de livrarea în celulele COS7. Datele arată numărul mediu (%) de celule HeLa GFP pozitive numărate în 10 câmpuri microscopice diferite, iar experimentul a fost efectuat de mai multe ori, în trei zile diferite. (Studiu și grafic: ©Sarker et al., 2019)

Prepararea ultrasonică a lizatului

Protocol de liză celulară ultrasonică
Începeți cu o probă îmbogățită de celule, care a fost preparată printr-o metodă de separare celulară (de ex., separarea celulară imunomagnetică, sortarea celulară activată prin fluorescență (FACS), centrifugarea în gradient de densitate, izolarea celulară prin imunodensitate).
Probele de celule trebuie să aibă un volum de tampon de liză adecvat obiectivului experimental și ultrasonicatorului cu sondă.
Sunt preferate tampoanele hipotone, deoarece acestea intensifică liza celulară ultrasonică. Este important ca aditivii și concentrația de sare să fie utilizate în mod adecvat.
Selectați dispozitivul de liză ultrasonică: pentru sonicarea indirectă a flacoanelor, se recomandă VialTweeter sau CupHorn. Pentru plăcile cu mai multe godeuri, UIP400MTP este ultrasonicatorul ideal. Iar pentru sonicarea clasică cu sondă, cele mai potrivite sunt omogenizatoarele cu ultrasunete precum UP100H sau UP200Ht cu microvârf.
Protocol pentru sonicarea cu sondă: Introduceți sonda ultrasonicatorului în volumul probei dintr-un tub de microcentrifugă și sonicați timp de aprox. 10 secunde. În funcție de proba de ADN, sonicarea poate fi repetată încă o dată sau de două ori. Aportul de energie ultrasonică necesar (Ws/mL) depinde de vâscozitatea probei și de tipul de ADN. Răcirea în baie de gheață și modul de pulsație al ultrasonicatorului ajută la prevenirea degradării termice a probei.
După liza ultrasonică, proba este centrifugată pentru a separa resturile din sediment (care conțin celule nelizate, nuclee și organite nelizate)
Dacă proba nu este procesată imediat în continuare, aceasta poate fi depozitată la o temperatură adecvată pentru a-i păstra viabilitatea.

Ultrasonicatoare pentru fragmentarea ADN-ului

Hielscher Ultrasonics oferă diverse platforme bazate pe ultrasunete pentru fragmentarea ADN-ului, ARN-ului și cromatinei. Aceste platforme diferite includ sonde ultrasonice (sonotrode), soluții de sonicare indirectă pentru prepararea simultană a probelor din mai multe tuburi sau plăci cu mai multe godeuri (de ex., plăci cu 96 de godeuri, plăci de microtitrare), sonoreactoare și dispozitive CupHorn ultrasonice. Toate platformele pentru forfecarea ADN-ului sunt alimentate de procesoare ultrasonice de înaltă performanță, cu frecvență acordată, care sunt controlabile cu precizie și oferă rezultate reproductibile.

Procesoare ultrasonice pentru orice număr și dimensiune de probe

Cu ultrasonicatoarele multi-probă Hielscher VialTweeter (pentru până la 10 eprubete) și UIP400MTP (pentru microplăci/ plăci cu mai multe godeuri), devine ușor posibilă reducerea timpului de procesare a probelor datorită ultrasonicării intense și controlabile cu precizie, obținându-se în același timp distribuția dorită a dimensiunii fragmentelor de ADN și randamentul dorit. Fragmentarea ultrasonică a ADN-ului face ca etapele de preparare a plasmidelor să fie eficiente, fiabile și scalabile. Protocoalele pot fi scalate liniar de la una la numeroase probe prin aplicarea unor parametri ultrasonici constanți.
Ultrasonicatoarele cu sondă cu unul până la cinci degete sunt ideale pentru prepararea unui număr mai mic de probe. Ultrasonicatoarele de laborator Hielscher sunt disponibile cu diferite niveluri de putere, astfel încât să puteți alege dezintegratorul ultrasonic ideal pentru aplicația dumneavoastră legată de ADN.