Fragmentarea ultrasonică a ADN-ului pentru secvențierea de nouă generație

Secvențierea de nouă generație (NGS) necesită forfecarea și fragmentarea fiabilă a ADN-ului genomic pentru a secvenția catenele de ADN genomic și a crea biblioteci genomice. Fragmentarea controlată a ADN-ului în fragmente de ADN este o etapă esențială de pregătire a probelor, necesară înainte de secvențierea ADN-ului. Ultrasonicarea s-a dovedit a fi o tehnică eficientă și fiabilă pentru fragmentarea ADN-ului la o anumită lungime. Protocoalele de fragmentare ultrasonică a ADN-ului obțin rezultate de fragmentare reproductibile. Ultrasonicatoarele Hielscher pot produce o gamă largă de distribuții ale dimensiunii fragmentelor de ADN genomic, controlabile precis prin parametrii de funcționare. Deoarece sistemele ultrasonice Hielscher de forfecare a ADN-ului sunt disponibile pentru flacoane individuale și multiple, precum și pentru microplăci, pregătirea probelor devine extrem de eficientă.

Secvențierea de nouă generație: fragmentarea ultrasonică a ADN-ului pentru pregătirea bibliotecilor

Pentru a realiza o secvențiere de nouă generație, trebuie efectuați cei trei pași de bază: (1) pregătirea bibliotecii, (2) secvențierea și (3) analiza datelor. În timpul pregătirii bibliotecii, ADN-ul este fragmentat, apoi capetele fragmentelor sunt reparate (finisate) prin adăugarea unei singure baze de adenină, iar fragmentele țintă sunt convertite în ADN dublu catenar. În final, așa-numiții adaptori sunt atașați prin ligare, PCR sau tagmentare, astfel încât produsul final de ADN al bibliotecii să poată fi cuantificat pentru secvențiere.
Fragmentarea ADN-ului prin sonicare: Mai ales în cazul tehnologiilor de secvențiere cu citiri scurte, precum Illumina, care nu pot citi cu ușurință fragmente mai lungi de ADN, catenele de ADN trebuie fragmentate la o anumită dimensiune, ceea ce se poate realiza în mod fiabil prin ultrasonicare.
Ultrasonicarea poate fi utilizată în mod fiabil pentru fragmentarea ADN-ului, ARN-ului și cromatinei.

Secvențierea de nouă generație – pregătirea bibliotecii

Fragmentarea ultrasonică a ADN-ului este utilizată frecvent în pregătirea bibliotecilor de secvențiere a ADN-ului pentru platformele de secvențiere de nouă generație (NGS). Această tehnică este folosită pentru a rupe moleculele de ADN în fragmente mai mici, dintr-un interval de dimensiuni dorit, ceea ce facilitează etapele ulterioare ale pregătirii bibliotecii. Fragmentarea ultrasonică a ADN-ului este de obicei necesară în etapa de pregătire a bibliotecii din fluxurile de lucru NGS, pentru a fragmenta ADN-ul genomic în bucăți mai mici, adecvate procesării ulterioare și secvențierii. Ea joacă un rol crucial în asigurarea succesului experimentului de secvențiere, generând fragmente de ADN din intervalul de dimensiuni adecvat pentru platforma de secvențiere specifică utilizată.

Secvențierea de nouă generație – etapele procesului:

• Fragmentarea ultrasonică a ADN-ului: Înainte de construirea bibliotecii, ADN-ul genomic este fragmentat în bucăți mai mici, mai ușor de gestionat. Fragmentarea ultrasonică presupune utilizarea undelor sonore de înaltă frecvență pentru a forfeca moleculele de ADN în fragmente din intervalul de dimensiuni dorit. Această etapă este crucială, deoarece contribuie la asigurarea faptului că citirile de secvențiere generate ulterior vor avea o lungime adecvată pentru platforma de secvențiere utilizată. Intervalul de dimensiuni al fragmentelor poate fi ajustat în funcție de cerințele specifice ale experimentului de secvențiere.
• Amplificarea clonală prin PCR: După fragmentarea ultrasonică, fragmentele de ADN sunt supuse reparării capetelor, ligării adaptorilor și amplificării prin PCR pentru a genera bibliotecile finale de secvențiere a ADN-ului. Aceste etape pregătesc moleculele de ADN fragmentate pentru procesul de secvențiere prin adăugarea secvențelor adaptoare necesare legării de platforma de secvențiere și prin furnizarea situsurilor de amorsare pentru amplificarea prin PCR.
• Secvențierea ADN-ului prin sinteză: Odată pregătite bibliotecile de secvențiere, începe procesul de secvențiere a ADN-ului prin sinteză (SBS). În timpul SBS, secvența ADN-ului este determinată prin adăugarea secvențială de nucleotide la catena complementară. Această etapă implică reacții ciclice de încorporare a nucleotidelor, imagistică și clivare, permițând determinarea secvenței ADN-ului pe baza semnalelor fluorescente emise de nucleotidele încorporate.
• Secvențierea masiv paralelă: În etapa finală, matrițele de ADN amplificate și separate spațial sunt secvențiate simultan, într-un mod masiv paralel. Această abordare de secvențiere cu capacitate mare de procesare permite generarea a milioane până la miliarde de citiri de secvențiere într-o singură rulare de secvențiere, permițând determinarea eficientă și rapidă a secvențelor de ADN.

Cum funcționează fragmentarea ultrasonică a ADN-ului?

Sonicarea, cunoscută și ca procesare acustică a probelor, este o metodă utilizată pe scară largă pentru fragmentarea ADN-ului. Pentru forfecarea ultrasonică a ADN-ului, probele sunt expuse undelor ultrasonice în condiții controlate. Principiul de funcționare al fragmentării ultrasonice a ADN-ului se bazează pe vibrațiile și cavitația generate de undele ultrasonice. Forțele de forfecare care rezultă din cavitația ultrasonică (acustică) rup moleculele de ADN cu greutate moleculară mare. Setările sonicării, precum intensitatea (amplitudine, durată), modul de pulsare și temperatura, permit fragmentarea precisă a ADN-ului la o anumită lungime dorită a fragmentelor de ADN. Deși ADN-ul este adesea redus la 100 până la 600 bp prin ultrasonicare, se pot obține fragmente de ADN mai lungi, de până la 1300 bp, atunci când se aplică condiții ultrasonice mai blânde.

Controlul temperaturii pentru prevenirea degradării ADN-ului

Forma moleculară dublu catenară a ADN-ului este foarte sensibilă la temperaturi ridicate, astfel încât controlul exact al temperaturii în timpul etapelor de pregătire a probelor este un factor crucial pentru rezultate fiabile ale analizelor.
Indiferent dacă utilizați ultrasonicatoarele cu sondă Hielscher, VialTweeter sau UIP400MTP – monitorizarea și controlul continuu al temperaturii sunt asigurate datorită unui senzor de temperatură conectabil și software-ului inteligent al dispozitivului. Pentru a menține temperatura într-un anumit interval, puteți seta o limită superioară și una inferioară de temperatură. Prin urmare, ultrasonicatorul se va opri temporar imediat ce această limită de temperatură este depășită și va continua automat sonicarea atunci când temperatura a scăzut cu un ∆T setat.
Software-ul sofisticat al ultrasonicatoarelor Hielscher asigură menținerea fiabilă a condițiilor ideale de tratare a probelor.

Fragmentarea ADN-ului pentru un număr mare de probe cu ultrasonicatorul pentru plăci multi-godeu UIP400MTP

Numărul de probe din științele vieții a crescut semnificativ în ultimul deceniu. Aceasta înseamnă că un număr foarte mare de probe (de ex., 384, 1536 sau 3456 de godeuri per microplacă) trebuie procesate în timpul pregătirii probelor și al analizei în condiții constant egale, pentru a obține rezultate comparabile și valide. Cu UIP400MTP, Hielscher Ultrasonics urmează tendința procesării unui număr mare de probe. UIP400MTP este un ultrasonicator pentru pregătirea probelor în microplăci. UIP400MTP poate procesa plăci cu 6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536 sau 3456 de godeuri. În funcție de tipul microplăcii, fiecare godeu poate conține de obicei volume de probă cuprinse între zeci de nanolitri și câțiva mililitri. Utilizat pe scară largă în cercetarea din științele vieții, UIP400MTP este folosit foarte frecvent pentru pregătirea probelor înaintea testelor precum ELISA (test imunoenzimatic, enzyme-linked immunosorbent assay) sau PCR, înaintea analizelor proteice, precum și pentru pregătirea cromatinei înainte de CHiP și CHiP-seq, identificarea modificărilor histonelor și alte tratamente analitice (de ex., electroforeză în gel, spectrometrie de masă).
Aflați mai multe despre procesarea plăcilor PCR cu capacitate mare de procesare!

VialTweeter pentru pregătirea probelor din până la 10 flacoane

VialTweeter este un ultrasonicator de laborator VialTweeter utilizat pe scară largă, care permite sonicarea eficientă și comodă a până la 10 flacoane simultan. Deoarece flacoanele și eprubetele (de ex., flacoane Eppendorf, criofiole, tuburi de centrifugă) sunt sonicate indirect, orice contaminare încrucișată este evitată. Întrucât aceeași intensitate a ultrasunetelor este transmisă fiecărei probe, toate rezultatele sonicării sunt omogene și reproductibile. VialTweeter oferă toate funcțiile inteligente ale celorlalte dispozitive digitale ale noastre (de ex., meniu inteligent, setări programabile, controlul temperaturii, control de la distanță etc.), astfel încât este asigurat cel mai înalt confort pentru utilizator.

Sonotrode cu mai multe degete pentru plăci cu microgodeuri

Disponibile pentru omogenizatoarele cu ultrasunete cu sondă UP200Ht și UP200St, sonotrodele cu mai multe degete, cu 4 sau 8 degete, reprezintă o opțiune comodă pentru sonicarea mai multor probe în același timp, în aceleași condiții. De exemplu, sonotroda MTP-24-8-96 este o sonotrodă cu opt degete, ideală pentru integrarea în sisteme automatizate sau pentru pregătirea manuală eficientă a probelor din godeurile plăcilor multi-godeu. Sonotroda cu mai multe degete este ideală pentru automatizarea în laboratoare în care se procesează în principal pahare Berzelius și eprubete folosind o sonotrodă ultrasonică standard. Sonotrodele cu mai multe degete și cele standard pot fi înlocuite rapid între ele în câteva minute, transformând ultrasonicatorul cu o singură sonotrodă într-un dezintegrator ultrasonic cu mai multe sonotrode.

Ultrasonicatoare Hielscher pentru fragmentarea ADN-ului

Hielscher Ultrasonics oferă diverse platforme bazate pe ultrasunete pentru fragmentarea ADN-ului, ARN-ului și cromatinei. Aceste platforme diferite includ sonde ultrasonice (sonotrode), soluții de sonicare indirectă pentru pregătirea simultană a probelor din mai multe tuburi sau plăci multi-godeu (de ex., plăci cu 96 de godeuri, plăci de microtitrare), sonoreactoare și dispozitive CupHorn ultrasonice. Toate platformele pentru forfecarea ADN-ului sunt alimentate de procesoare ultrasonice de înaltă performanță, cu frecvență reglată, care sunt controlabile precis și oferă rezultate reproductibile.

Procesoare ultrasonice pentru orice număr și dimensiune de probe

Cu ultrasonicatoarele Hielscher pentru probe multiple VialTweeter (pentru până la 10 eprubete) și UIP400MTP (pentru microplăci/ plăci multi-godeu) se permite reducerea timpului de procesare a probelor datorită ultrasonicării intense și controlabile precis, obținând în același timp distribuția dorită a dimensiunii fragmentelor de ADN și randamentul dorit. Fragmentarea ultrasonică a ADN-ului face ca pregătirea probelor să fie eficientă, fiabilă și scalabilă. Protocoalele pot fi scalate liniar de la una la numeroase probe prin aplicarea ultrasunetelor controlate constant.
Ultrasonicatoarele cu sondă cu unul până la cinci degete sunt ideale pentru pregătirea unui număr mai mic de probe. Ultrasonicatoarele de laborator Hielscher sunt disponibile în diverse dimensiuni, astfel încât vă putem recomanda dispozitivul ideal pentru aplicația și cerințele dumneavoastră.

Control precis al procesului

Setările de sonicare controlabile precis sunt cruciale, deoarece o sonicare excesivă poate distruge ADN-ul, ARN-ul și cromatina, în timp ce o forfecare ultrasonică insuficientă duce la fragmente de ADN și cromatină prea lungi. Ultrasonicatoarele digitale Hielscher pot fi setate cu ușurință la parametri de sonicare preciși. Setările specifice de sonicare pot fi, de asemenea, salvate ca setări programate pentru repetarea rapidă a aceleiași proceduri.
Toate sonicările sunt înregistrate automat și stocate ca fișier CSV pe un card SD încorporat. Acest lucru permite documentarea exactă a încercărilor efectuate și face posibilă revizuirea ușoară a rulărilor de sonicare.
Prin controlul de la distanță prin browser, toate ultrasonicatoarele digitale pot fi operate și monitorizate prin orice browser standard. Nu este necesară instalarea unui software suplimentar, deoarece o conexiune LAN permite o configurare plug-n-play foarte simplă.


Cea mai mare ușurință în utilizare în pregătirea probelor cu ultrasunete

Toate ultrasonicatoarele Hielscher sunt concepute pentru a furniza ultrasunete de înaltă performanță, fiind în același timp întotdeauna foarte ușor de utilizat și de operat. Toate setările sunt bine structurate într-un meniu clar, care poate fi accesat cu ușurință prin ecranul tactil color sau prin controlul de la distanță prin browser. Software-ul inteligent, cu setări programabile și înregistrare automată a datelor, asigură setări optime de sonicare pentru rezultate fiabile și reproductibile. Interfața de meniu clară și ușor de utilizat transformă ultrasonicatoarele Hielscher în dispozitive eficiente și ușor de utilizat.
Tabelul de mai jos vă oferă o indicație privind capacitatea aproximativă de procesare a ultrasonicatoarelor noastre de laborator, care sunt ideale pentru sarcini de pregătire a probelor precum fragmentarea ADN-ului și ARN-ului, liza celulară, precum și extracția proteinelor: