Fragmentarea ADN-ului cu ultrasunete pentru secvențierea de generație următoare

Secvențierea de generație următoare (NGS) necesită forfecarea și fragmentarea fiabilă a ADN-ului genomic pentru a secvenția catenele de ADN genomic și pentru a crea biblioteci de genomi. Fragmentarea controlată a ADN-ului în fragmente de ADN este o etapă esențială de pregătire a probei necesară înainte ca ADN-ul să fie secvențiat. Ultrasonication este dovedit ca o tehnică eficientă și fiabilă pentru fragmentarea ADN-ului de o anumită lungime. Protocoalele de fragmentare a ADN-ului cu ultrasunete obțin rezultate de fragmentare reproductibile. Hielscher ultrasonicators sunt capabile să producă o gamă largă de distribuții genomice ale dimensiunii fragmentelor de ADN, controlabile cu precizie prin intermediul parametrilor de funcționare. Deoarece Hielscher sisteme de forfecare ADN cu ultrasunete sunt disponibile pentru flacoane unice și multiple, precum și pentru microplate, pregătirea probei devine extrem de eficientă.

Secvențierea de ultimă generație: fragmentarea ADN-ului cu ultrasunete pentru pregătirea bibliotecii

Pentru a efectua o secvențiere de generație următoare, trebuie efectuate cele trei etape de bază ale (1) pregătirii bibliotecii, (2) secvențierii și (3) analizei datelor. În timpul pregătirii bibliotecii, ADN-ul este fragmentat, apoi capetele fragmentelor sunt reparate (lustruite) prin adăugarea unei singure baze de adenină, iar fragmentele țintă sunt convertite în ADN dublu catenar. În cele din urmă, așa-numitele adaptoare sunt atașate prin ligaturare, PCR sau etichetare, astfel încât produsul final al ADN-ului bibliotecii să poată fi cuantificat pentru secvențiere.
Fragmentarea ADN-ului folosind sonicare: Mai ales atunci când tehnologiile de secvențiere cu citire scurtă, ar fi Illumina, care nu pot citi cu ușurință fragmente de ADN mai lungi, standurile ADN trebuie să fie fragmentate la o anumită dimensiune, care poate fi realizată în mod fiabil prin ultrasonication.
Ultrasonication poate fi utilizat în mod fiabil pentru fragmentarea ADN-ului, ARN și cromatinei.

Secvențiere de ultimă generație – Pregătirea bibliotecii

Fragmentarea ADN-ului cu ultrasunete este frecvent utilizată în pregătirea bibliotecilor de secvențiere a ADN-ului pentru platformele de secvențiere de generație următoare (NGS). Această tehnică este utilizată pentru a sparge moleculele de ADN în fragmente mai mici dintr-o gamă de dimensiuni dorite, ceea ce facilitează pașii ulteriori în pregătirea bibliotecii. Fragmentarea ADN-ului cu ultrasunete este de obicei necesară în timpul etapei de pregătire a bibliotecii fluxurilor de lucru NGS pentru a fragmenta ADN-ul genomic în bucăți mai mici, potrivite pentru procesarea și secvențierea în aval. Acesta joacă un rol crucial în asigurarea succesului experimentului de secvențiere prin generarea de fragmente de ADN cu intervalul de dimensiuni adecvat pentru platforma specifică de secvențiere utilizată.

Secvențiere de generație următoare – Etapele procesului:

• Fragmentarea ADN-ului cu ultrasunete: Înainte de construirea bibliotecii, ADN-ul genomic este fragmentat în bucăți mai mici, mai ușor de gestionat. Fragmentarea cu ultrasunete implică utilizarea undelor sonore de înaltă frecvență pentru a forfeca moleculele de ADN în fragmente din gama de dimensiuni dorite. Acest pas este crucial, deoarece ajută la asigurarea faptului că citirile de secvențiere generate ulterior vor avea o lungime adecvată pentru platforma de secvențiere utilizată. Gama de dimensiuni a fragmentelor poate fi ajustată pe baza cerințelor specifice ale experimentului de secvențiere.
• Amplificare clonală prin PCR: După fragmentarea cu ultrasunete, fragmentele de ADN suferă reparații finale, ligaturarea adaptorului și amplificarea PCR pentru a genera bibliotecile finale de secvențiere a ADN-ului. Acești pași pregătesc moleculele fragmentate de ADN pentru procesul de secvențiere prin adăugarea secvențelor adaptoare necesare pentru legarea la platforma de secvențiere și furnizarea de locuri de amorsare pentru amplificarea PCR.
• Secvențierea ADN-ului prin sinteză: Odată ce bibliotecile de secvențiere sunt pregătite, începe procesul de secvențiere ADN prin sinteză (SBS). În timpul SBS, secvența ADN este determinată prin adăugarea secvențială de nucleotide la catena complementară. Această etapă implică reacții ciclice de încorporare a nucleotidelor, imagistică și scindare, permițând determinarea secvenței ADN pe baza semnalelor fluorescente emise de nucleotidele încorporate.
• Secvențiere masivă paralelă: În etapa finală, șabloanele ADN amplificate segregate spațial sunt secvențiate simultan într-un mod masiv paralel. Această abordare de secvențiere cu randament ridicat permite generarea a milioane până la miliarde de citiri de secvențiere într-o singură secvențiere, permițând determinarea eficientă și rapidă a secvențelor ADN.

Cum funcționează fragmentarea ADN-ului cu ultrasunete?

Sonicare, de asemenea, cunoscut sub numele de prelucrare a probei acustice, este o metodă utilizată pe scară largă pentru a fragmenta ADN-ul. Pentru forfecarea ADN-ului cu ultrasunete, probele sunt expuse undelor ultrasonice în condiții controlate. Principiul de lucru al fragmentării ADN-ului ultrasonic se bazează pe vibrațiile și cavitația generate de undele cu ultrasunete. Forțele de forfecare care rezultă din cavitația cu ultrasunete (acustică) sparg moleculele de ADN cu greutate moleculară mare. Setarea sonicare, ar fi intensitatea (amplitudinea, durata), modul de pulsație și temperatura permit fragmentarea precisă a ADN-ului la o anumită lungime dorită de fragmente de ADN. În timp ce ADN-ul este adesea redus la 100 la 600 bp folosind ultrasonication, fragmente de ADN mai lungi de până la 1300 bp pot fi obținute atunci când se aplică condiții cu ultrasunete mai blânde.

Controlul temperaturii pentru a preveni degradarea ADN-ului

Forma moleculară dublu catenară a ADN-ului este foarte sensibilă la temperaturi ridicate, astfel încât controlul exact al temperaturii în timpul etapelor de pregătire a probelor este un factor crucial pentru rezultate fiabile ale analizei.
Fie că utilizați ultrasonicators sonda Hielscher, VialTweeter sau UIP400MTP – Monitorizarea și controlul continuu al temperaturii sunt asigurate datorită unui senzor de temperatură conectabil și software-ului dispozitivului inteligent. Pentru a menține temperatura într-un anumit interval, puteți seta o limită superioară și inferioară a temperaturii. În consecință, ultrasonicator va întrerupe de îndată ce această limită de temperatură este depășită și automat va continua să sonicate atunci când temperatura a scăzut cu un set ∆T.
Software-ul sofisticat al ultrasonicators Hielscher asigură menținerea fiabilă a condițiilor ideale de tratare a probelor.

Fragmentarea ADN-ului eșantionului de masă cu UIP400MTP Ultrasonicator placă multi-puț

Numărul eșantioanelor din domeniul științelor vieții a crescut semnificativ în ultimul deceniu. Aceasta înseamnă că un număr foarte mare de probe (de exemplu, 384, 1536 sau 3456 godeuri per microplacă) trebuie prelucrate în timpul pregătirii și analizei probelor în condiții egale în mod constant, pentru a obține rezultate comparabile și valide. Cu UIP400MTP, Hielscher Ultrasonics urmează tendința procesării probelor de masă. UIP400MTP este un ultrasonicator pentru prepararea probei folosind microplăci. UIP400MTP poate procesa plăci cu 6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536 sau 3456 puțuri. În funcție de tipul microplăcii, fiecare godeu poate conține, de obicei, volume de probă cuprinse între zeci de nanolitri și câțiva mililitri. Utilizat pe scară largă în cercetarea științelor vieții, UIP400MTP este foarte frecvent utilizat pentru pregătirea probelor înainte de teste, cum ar fi ELISA (testul imunosorbant legat de enzime) sau PCR, înainte de analiza proteinelor, precum și pentru prepararea cromatinei înainte de CHiP și CHiP-seq, identificarea modificării histonelor și alte tratamente analitice (de exemplu, electroforeză în gel, spectrometrie de masă).

VialTweeter pentru proba de până la 10 flacoane

VialTweeter este un ultrasonicator de laborator utilizat pe scară largă VialTweeter, care permite sonicare eficientă și confortabilă de până la 10 flacoane simultan. Deoarece flacoanele și eprubetele (de exemplu, flacoane Eppendorf, flacoane crio, tuburi de centrifugă) sunt sonicate indirect, orice contaminare încrucișată este evitată. Ca aceeași intensitate cu ultrasunete este livrată la fiecare probă, toate rezultatele sonicare sunt omogene și reproductibile. VialTweeter oferă toate caracteristicile inteligente ca și celelalte dispozitive digitale ale noastre (de exemplu, meniu inteligent, setări programabile, control al temperaturii, telecomandă etc.), astfel încât să se asigure cel mai înalt confort al utilizatorului.

Sonde cu mai multe degete pentru plăci cu microgodeuri

Disponibile pentru omogenizatoare sondă cu ultrasunete UP200Ht și UP200St, sonde multi-degete cu 4 sau 8 degete sunt o opțiune confortabilă pentru sonicate mai multe probe în același timp, în aceleași condiții. De exemplu, sonotrode MTP-24-8-96 este o sondă cu opt degete, care este ideală pentru integrarea în sisteme automate sau pregătirea manuală eficientă a probelor din puțurile plăcilor cu mai multe godeuri. Sonotrode cu mai multe degete este ideal pentru automatizate pentru laboratoare, în cazul în care cele mai multe pahare și eprubete folosind un sonotrode standard cu ultrasunete sunt procesate. Sondele cu mai multe degete și standard pot fi inter-schimbate rapid în câteva minute, transformând ultrasonicatorul cu o singură sondă într-un disruptor cu ultrasunete multi-sondă.

Hielscher ultrasonicators pentru fragmentarea ADN-ului

Hielscher Ultrasonics oferă diverse platforme bazate pe ultrasunete pentru ADN, ARN, și fragmentarea cromatinei. Aceste platforme diferite includ sonde cu ultrasunete (sonotrodes), soluții indirecte sonicare pentru pregătirea simultană a probei de mai multe tuburi sau plăci cu mai multe godeuri (de exemplu, plăci cu 96 de puțuri, plăci de microtitrare), sonoreactori și cuphorns cu ultrasunete. Toate platformele pentru forfecarea ADN-ului sunt alimentate de procesoare cu ultrasunete de înaltă performanță, reglate în frecvență, care sunt controlabile cu precizie și oferă rezultate reproductibile.

Procesoare cu ultrasunete pentru orice număr și dimensiune de probă

Cu ultrasonicators multi-eșantion Hielscher VialTweeter (pentru până la 10 eprubete) și UIP400MTP (pentru microplates / plăci multiwell), devine ușor posibil să se reducă timpul de procesare a probei datorită ultrasonication intens și precis controlabil, obținând în același timp distribuția dorită a dimensiunii fragmentelor de ADN și randamentul. Fragmentarea ADN-ului cu ultrasunete face ca pregătirea probei să fie eficientă, fiabilă și scalabilă. Protocoalele pot fi scalate liniar de la una la mai multe probe prin aplicarea ultrasunetelor controlate constant.
Sonda ultrasonicators cu unul până la cinci degete sunt ideale pentru prepararea unui număr mai mic de probe. Hielscher ultrasonicators de laborator sunt disponibile la diferite dimensiuni, astfel încât să vă putem recomanda dispozitivul ideal pentru cererea și cerințele dumneavoastră.

Control precis al procesului

Setările de sonicare controlabile cu precizie sunt cruciale, deoarece sonificarea exhaustivă poate distruge ADN-ul, ARN și cromatina, dar forfecarea inadecvată cu ultrasunete are ca rezultat fragmente prea lungi de ADN și cromatină. Hielscher ultrasonicators digitale pot fi setate cu ușurință la parametrul precis sonicare. Setările specifice sonicare pot fi, de asemenea, salvate ca setare programată pentru repetarea rapidă a aceleiași proceduri.
Toate sonicare sunt protocoale automate și stocate ca fișier CSV pe un built-in SD-card. Acest lucru permite o documentare exactă a studiilor efectuate și face posibilă revizuirea sonicare ruleaza cu ușurință.
Prin telecomanda browserului, toate ultrasonicators digitale pot fi operate și monitorizate prin orice browser standard. Nu este necesară instalarea unui software suplimentar, deoarece o conexiune LAN permite o configurare plug-n-play foarte simplă.

Cea mai mare ușurință în utilizare în pregătirea probei cu ultrasunete

Toate ultrasonicators Hielscher sunt concepute pentru a furniza ultrasunete de înaltă performanță, în timp ce, în același timp, fiind întotdeauna foarte ușor de utilizat și ușor de operat. Toate setările sunt bine structurate într-un meniu clar, care poate fi accesat cu ușurință prin intermediul afișajului tactil colorat sau al telecomenzii browserului. Software-ul inteligent cu setări programabile și înregistrare automată a datelor asigură setări optime de sonicare pentru rezultate fiabile și reproductibile. Interfața de meniu curată și ușor de utilizat transformă ultrasonicators Hielscher în dispozitive ușor de utilizat și eficiente.
Tabelul de mai jos vă oferă o indicație a capacității aproximative de procesare a ultrasonicators noastre de laborator, care sunt ideale pentru sarcinile de pregătire a probelor, ar fi fragmentarea ADN și ARN, liza celulară, precum și extracția proteinelor: