Liza celulară a celulelor BL21 prin ultrasonication
Celulele BL21 sunt o tulpină de E. coli care este utilizat pe scară largă în laboratoarele de cercetare, biotehnologie și producția industrială datorită capacității lor de a exprima proteine foarte eficient. Întreruperea celulelor cu ultrasunete, liză și extracția proteinelor este metoda comună pentru a izola și colecta proteinele vizate din interiorul celular al celulelor BL21. Sonicare perturbă celula complet și eliberează toate proteinele prinse, făcând 100% din proteine disponibile.
Celule BL21 pentru expresia proteinelor
Celula BL21 este o tulpină bacteriană E. coli competentă din punct de vedere chimic, adecvată pentru transformare și pentru exprimarea proteinelor la nivel înalt, utilizând un sistem de inducție ARN polimerazei-IPTG T7. Celulele BL21 permit expresia proteică de înaltă eficiență a oricărei gene care se află sub controlul unui promotor T7. Tulpina E. coli BL21(DE3) este o tulpină de producție de proteine pe bază de ARN T7, combinată cu vectori de expresie pe bază de promotor T7 și este aplicată pe scară largă în laboratoare și industrie pentru a produce proteine recombinante. În BL21(DE3), expresia genei care codifică proteina recombinantă este transcrisă de arn-ul T7 codificat cromozomial (T7 RNAP), care transcrie de opt ori mai repede decât RNAP-ul convențional E. coli. Acest lucru face tulpina BL21(DE3) extrem de eficient și se transformă într-unul dintre cele mai preferate sisteme de celule de expresie a proteinelor.
Protocol pentru liză cu ultrasunete și extracție de proteine din celulele BL21
Liza celulară a celulelor BL21 se efectuează în cea mai mare parte folosind ultrasonication în combinație cu lauroyl sarcosinat de sodiu (de asemenea, cunoscut sub numele de sarkosyl) ca tampon de liză. Avantajele întreruperii celulelor cu ultrasunete și extracția proteinelor constă în fiabilitatea, reproductibilitatea, precum și funcționarea simplă, sigură și rapidă a ultrasonicators. Protocolul de mai jos oferă o direcție pas cu pas pentru lysis celular cu ultrasunete BL21:
- Pentru a elimina proteinele de însoțitor, peletele bacteriene BL21 au fost resuspendate în 50 ml de tampon de sodiu tris-EDTA (STE) rece ca gheața (constând în 10 mM Tris-HCL, pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl completat cu 100 mM PMSF).
- Se adaugă 500 ul de lizozim (10 mg/ ml), iar celulele se incubează pe gheață timp de 15 minute.
- Ulterior, se adaugă 500 ul de DTT și 7 ml de sarkosyl (10% (w/v) alcătuit în tampon STE).
- Este esențial să se păstreze toate tampoanele de purificare reci ca gheața și să se mențină eșantioanele pe gheață tot timpul. Toate etapele de purificare ar trebui să fie efectuate în camera rece, dacă este posibil.
- Pentru liză cu ultrasunete și extracție de proteine, probele sunt sonicate în VialTweeter MultiSample Ultrasonicator timp de 4 x 30 sec la amplitudine de 100%, cu un interval de 2 min între fiecare sonicare. Alternativ, un omogenizator cu ultrasunete de tip sondă cu micro-vârf, de exemplu, Uf200 ः t cu S26d2 (3 x 30 sec, 2 min. pauză între cicluri cu ultrasunete, amplitudine 80%) pot fi utilizate.
- Pentru etapele suplimentare de purificare, eșantioanele trebuie păstrate pe gheață sau depozitate alternativ la -80°C până la prelucrarea ulterioară.
Disruptor de celule cu ultrasunete UP200St cu micro-vârf S26d2 pentru liză și extracție de proteine
Liză cu ultrasunete sub Control temperatura Prescise
Controlul precis și fiabil al temperaturii este esențial atunci când se manipulează probe biologice. Temperaturile ridicate inițiază degradarea proteinelor induse termic în probe.
Ca toate tehnicile mecanice de preparare a probelor, sonicare creează căldură. Cu toate acestea, temperatura probelor poate fi bine controlată atunci când se utilizează VialTweeter. Vă prezentăm diferite opțiuni pentru a monitoriza și controla temperatura probelor în timp ce le pregătiți cu VialTweeter și VialPress pentru analiză.
- Monitorizarea temperaturii eșantionului: Procesorul cu ultrasunete UP200St, care conduce VialTweeter, este echipat cu un software inteligent și un senzor de temperatură pluggable. Conectați senzorul de temperatură la UP200St și introduceți vârful senzorului de temperatură într-unul dintre tuburile de probă. Prin intermediul afișajului tactil color digital, puteți seta în meniul up200St un interval de temperatură specific pentru sonicarea eșantionului. Ultrasonicator se va opri automat atunci când temperatura maximă este atinsă și pauză până când temperatura eșantionului este în jos la valoarea mai mică a temperaturii stabilite ∆. Apoi sonicare începe automat din nou. Această caracteristică inteligentă previne degradarea indusă de căldură.
- Blocul VialTweeter poate fi răcit în prealabil. Pune blocul VialTweeter (numai sonotrodul fără traductor!) în frigider sau congelator pentru a pre-răci blocul de titan ajută la amânarea creșterii temperaturii în probă. Dacă este posibil, proba în sine poate fi pre-răcit prea.
- Utilizați gheață uscată pentru a se răci în timpul sonicare. Utilizați o tavă de mică adâncime umplută cu gheață uscată și așezați VialTweeter pe gheață, astfel încât căldura să se poată disipa rapid.
Clienții din întreaga lume utilizează VialTweeter și VialPress pentru activitatea lor zilnică de pregătire a probelor în laboratoare biologice, biochimice, medicale și clinice. Software-ul inteligent și controlul temperaturii procesorului UP200St, temperatura este controlată în mod fiabil și degradarea probei induse de căldură evitată. Pregătirea probei cu ultrasunete cu VialTweeter și VialPress oferă rezultate extrem de fiabile și reproductibile!
Găsiți disruptorul optim cu ultrasunete pentru aplicația de liză
Hielscher Ultrasonics este producător cu experiență de lungă durată de disruptoare de celule cu ultrasunete de înaltă performanță și omogenizatoare pentru laboratoare, banc-top și sisteme de scară industrială. Dimensiunea culturii de celule bacteriene, scopul de cercetare sau de producție și volumul de celule pentru a procesa pe oră sau zi sunt factori esențiali pentru a găsi disruptor dreptul de celule cu ultrasunete pentru cererea dumneavoastră.
Hielscher Ultrasonics oferă diverse soluții pentru sonicarea simultană a mai multor eșantioane (până la 10 flacoane cu VialTweeter) și a probelor de masă (de exemplu, plăci de microtitr / plăci ELISA cu UIP400MTP), precum și ultrasonizator clasic de laborator de tip sondă cu diferite niveluri de putere de la 50 la 400 wați la procesoare cu ultrasunete complet industriale cu până la 16.000watți pe unitate pentru întreruperea celulelor comerciale și extracția proteinelor în producție mare. Toate ultrasonicators Hielscher sunt construite pentru funcționarea 24/7/365 sub sarcină completă. Robustețea și fiabilitatea sunt caracteristicile de bază ale dispozitivelor noastre cu ultrasunete.
Toate omogenizatoarele digitale cu ultrasunete sunt echipate cu software inteligent, afișaj tactil colorat și protocolare automată a datelor, care fac dispozitivul cu ultrasunete într-un instrument de lucru convenabil în laborator și facilități de producție.
Anunțați-ne, ce fel de celule, ce volum, cu ce frecvență și cu ce țintă aveți pentru a procesa probele biologice. Vă vom recomanda cel mai potrivit disruptor de celule cu ultrasunete pentru cerințele de proces.
Tabelul de mai jos vă oferă o indicație a capacității aproximative de procesare a sistemelor noastre cu ultrasunete de la omogenizatoare compacte de mână și Ultrasonicators MultiSample la procesoare cu ultrasunete industriale pentru aplicații comerciale:
| volum lot | Debit | Aparate recomandate |
|---|---|---|
| Plăci de 96 de sonde / microtitre | N / A. | UIP400MTP |
| 10 flacoane à 0.5 la 1.5mL | N / A. | VialTweeter la UP200St |
| 0.01 până la 250mL | 5 până la 100mL/min | UP50H |
| 00,01 până la 500mL | 10 până la 200 ml / min | UP100H |
| 10 la 2000ml | 20 până la 400ml / min | Uf200 ः t. UP400St |
| 0.1 la 20L | 0.2 4L / min | UIP2000hdT |
| 10 100L | 2 până la 10L / min | UIP4000hdT |
| N / A. | 10 la 100L / min | UIP16000 |
| N / A. | mai mare | grup de UIP16000 |
Contacteaza-ne! / Intreaba-ne!
Ultrasonicator Uf200 ः t cu microtip de 2 mm S26d2 pentru sonicarea probelor mici
Literatură / Referințe
- Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
- LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
- Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
- Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.
Ce trebuie să știți
Escherichia Coli Bacteria
Escherichia coli este un tip de bacterie, care este non-spori-formarea, Gram-negativ și se caracterizează prin forma sa de o tijă dreaptă. Bacteriile E.coli sunt prezente în mediul înconjurător, alimente, și intestine de oameni și animale. E. coli este, de obicei motile prin utilizarea flagella peritrichous, dar există tipuri de nonmotile, de asemenea. E.coli sunt așa-numitele organisme chemoorganotrope facultative anaerobe, ceea ce înseamnă că sunt capabile atât de metabolismul respirator, cât și de cel fermentativ. Majoritatea tipurilor de E.coli sunt benigne și îndeplinesc funcții utile în organism, de exemplu suprimarea creșterii speciilor bacteriene dăunătoare, sinteza vitaminelor etc.
Celulele bacteriilor Escherichia coli de tipul B sunt o categorie specială de tulpini de E.coli, care sunt utilizate pe scară largă în cercetare pentru a investiga mecanisme ar fi sensibilitatea bacteriofagului sau sistemele de modificare a restricțiilor. În plus, bacteriile E.coli sunt evaluate ca un cal de lucru de încredere pentru exprimarea proteinelor în biotehnologie și laboratoare de științe ale vieții. De exemplu, E.coli sunt folosite pentru a sintetiza compuși, ar fi proteine și oligozaharide la scară industrială. Datorită caracteristicilor specifice, ar fi deficitul de protează, producția scăzută de acetat la un nivel ridicat de glucoză și permeabilitatea sporită, celulele E. coli B sunt celulele gazdă utilizate cel mai frecvent pentru producția de proteine modificate genetic.
Proteină recombinantă
Proteinele recombinante (rProt) capătă o importanță semnificativă în diverse ramuri, inclusiv în producția chimică, farmaceutică, cosmetică, medicina umană și animală, agricultură, alimente, precum și în industriile de tratare a deșeurilor.
Producția de proteine recombinante necesită utilizarea unui sistem de expresie. Ca sisteme celulare de exprimare pentru producerea ADN-ului recombinant, se pot utiliza atât celule procariote, cât și celule eucariote. În timp ce celulele bacteriene sunt cele mai utilizate pe scară largă pentru exprimarea proteinelor din cauza unor factori, ar fi low cost, scalabilitate ușoară și condiții simple mass-media, mamifere, drojdie, alge, insecte și sisteme fără celule sunt stabilite alternative. Tipul de proteină, activitatea funcțională, precum și randamentul necesar al proteinei exprimate influențează selectarea sistemului celular utilizat pentru expresia proteinelor.
Pentru a exprima proteina recombinantă, o anumită celulă trebuie transfectată cu un vector ADN care conține șablonul de ADN recombinant. Celulele transfectate cu șablonul sunt apoi cultivate. Ca consecință a mecanismului celular, celulele transcrie și traduc proteina de interes, producând astfel proteina vizată.
Deoarece proteinele exprimate sunt prinse în matricea celulară, celula trebuie să fie lizat (perturbat și rupt) pentru a elibera proteinele. Într-o etapă ulterioară de purificare, proteina este separată și purificată.
Prima proteină recombinantă utilizată în tratament a fost insulina umană recombinantă în 1982. Astăzi, mai mult de 170 de tipuri de proteine recombinante sunt produse la nivel mondial pentru tratamente medicale. Proteinele recombinante utilizate în mod obișnuit utilizate în medicină sunt, de exemplu, hormoni recombinanti, interferoni, interleukine, factori de creștere, factori de necroză tumorală, factori de coagulare a sângelui, medicamente trombolitice și enzime pentru tratarea bolilor majore, ar fi diabetul, nanismul, infarctul miocardic, insuficiența cardiacă congestivă, apoplexie cerebrală, scleroza multiplă, neutropenia, trombocitopenia, anemia, hepatita, artrita reumatoidă, astmul, boala Crohn și terapiile împotriva cancerului. (vezi Phuc V. Pham, în Omics Technologies and Bio-Engineering, 2018)
Ultrasonice de înaltă performanță! Gama de produse Hielscher acoperă întregul spectru de la ultrasonicator de laborator compact peste unități banc-top la sisteme ultrasonice full-industriale.