Liza celulară a celulelor BL21 prin ultrasonication
Celulele BL21 sunt o tulpină de E. coli care este utilizată pe scară largă în laboratoarele de cercetare, biotehnologie și producție industrială datorită capacității lor de a exprima proteine extrem de eficiente. Întreruperea celulelor cu ultrasunete, liza și extracția proteinelor este metoda comună de izolare și colectare a proteinelor vizate din interiorul celular al celulelor BL21. Ultrasonication perturbă complet celula și eliberează toate proteinele prinse, făcând 100% din proteina disponibilă.
Celule BL21 pentru expresia proteinelor
Celula BL21 este o tulpină bacteriană E. coli competentă din punct de vedere chimic, potrivită pentru transformare și expresie proteică la nivel înalt folosind un sistem de inducție T7 ARN polimerază-IPTG. Celulele BL21 permit exprimarea proteinelor de înaltă eficiență a oricărei gene care se află sub controlul unui promotor T7. Tulpina de E. coli BL21 (DE3) este o tulpină de producție a proteinelor pe bază de ARN polimerază T7 combinată cu vectori de expresie pe bază de promotor T7 și este aplicată pe scară largă în laboratoare și industrie pentru a produce proteine recombinante. În BL21(DE3), expresia genei care codifică proteina recombinantă este transcrisă de ARN polimeraza T7 codificată cromozomial (T7 RNAP), care transcrie de opt ori mai repede decât E. coli RNAP convențional. Acest lucru face ca tulpina BL21 (DE3) să fie extrem de eficientă și o transformă într-unul dintre cele mai preferate sisteme celulare de expresie proteică.
Protocol pentru liza cu ultrasunete și extracția proteinelor din celulele BL21
Liza celulară a celulelor BL21 se realizează în cea mai mare parte folosind ultrasonication în combinație cu lauroyl sarcosinat de sodiu (cunoscut și sub numele de sarkosyl) ca tampon de liză. Avantajele întreruperii celulelor cu ultrasunete și extracția proteinelor constau în fiabilitatea, reproductibilitatea, precum și funcționarea simplă, sigură și rapidă a ultrasonicators. Protocolul de mai jos oferă o direcție pas cu pas pentru liza celulelor BL21 cu ultrasunete:
- Pentru a elimina proteinele însoțitoare, peletele bacteriene BL21 au fost resuspendate în 50 ml de tampon Sodium Tris-EDTA (STE) rece ca gheața (constând din 10 mM Tris-HCL, pH 8.0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl suplimentat cu 100 mM PMSF).
- Se adaugă 500 ul de lizozimă (10 mg/ ml) și celulele sunt incubate pe gheață timp de 15 min.
- Ulterior, se adaugă 500 ul de TDT și 7 ml de sarkosyl (10% (m/v) alcătuit în tampon STE).
- Este esențial să păstrați toate tampoanele de purificare reci ca gheața și să mențineți probele pe gheață tot timpul. Toate etapele de purificare trebuie efectuate în camera rece, dacă este posibil.
- Pentru liza cu ultrasunete și extracția proteinelor, probele sunt sonicate în VialTweeter MultiSample Ultrasonicator Pentru 4 x 30 sec la 100% amplitudine cu un interval de 2 minute între fiecare sonicare. Alternativ, un omogenizator cu ultrasunete de tip sondă cu micro-tip, de exemplu, UP200Ht cu S26d2 (3 x 30 sec, 2 min. pauză între cicluri cu ultrasunete, 80% amplitudine) pot fi utilizate.
- Pentru etapele ulterioare de purificare, eșantioanele trebuie păstrate pe gheață sau, alternativ, depozitate la -80 °C până la prelucrarea ulterioară.
Disruptor de celule cu ultrasunete UP200St cu micro-tip S26d2 pentru liza si extractia proteinelor
Liza cu ultrasunete sub controlul temperaturii Prescise
Controlul precis și fiabil al temperaturii este esențial atunci când se manipulează probe biologice. Temperaturile ridicate inițiază degradarea proteinelor indusă termic în probe.
Ca toate tehnicile mecanice de pregătire a probelor, sonicare creează căldură. Cu toate acestea, temperatura probelor poate fi bine controlată atunci când se utilizează VialTweeter. Vă prezentăm diferite opțiuni pentru a monitoriza și controla temperatura probelor în timp ce le pregătiți cu VialTweeter și VialPress pentru analiză.
- Monitorizarea temperaturii probei: Procesorul cu ultrasunete UP200St, care conduce VialTweeter, este echipat cu un software inteligent și un senzor de temperatură conectabil. Conectați senzorul de temperatură la UP200St și introduceți vârful senzorului de temperatură într-una din eprubete. Prin intermediul digitale colorate touch-display, puteți seta în meniul UP200St un interval de temperatură specific pentru sonicare eșantion. Ultrasonicator se va opri automat atunci când temperatura maximă este atinsă și pauză până când temperatura probei este redusă la valoarea mai mică a temperaturii setate ∆. Apoi sonicare începe automat din nou. Această caracteristică inteligentă previne degradarea indusă de căldură.
- Blocul VialTweeter poate fi răcit în prealabil. Puneți blocul VialTweeter (numai sonotrode fără traductor!) în frigider sau congelator pentru a pre-răci blocul de titan ajută la amânarea creșterii temperaturii în probă. Dacă este posibil, eșantionul în sine poate fi și pre-răcit.
- Utilizați gheață carbonică pentru a se răci în timpul sonicare. Utilizați o tavă de mică adâncime umplută cu gheață carbonică și așezați VialTweeter pe gheață, astfel încât căldura să se disipeze rapid.
Clienții din întreaga lume folosesc VialTweeter și VialPress pentru activitatea zilnică de pregătire a probelor în laboratoarele biologice, biochimice, medicale și clinice. Software-ul inteligent și controlul temperaturii procesorului UP200St, temperatura este controlată în mod fiabil și degradarea probei indusă de căldură este evitată. Pregătirea probei cu ultrasunete cu VialTweeter și VialPress oferă rezultate extrem de fiabile și reproductibile!
Găsiți disruptorul cu ultrasunete optim pentru aplicația dvs. de liză
Hielscher Ultrasonics este producător cu experiență de lungă durată de disruptori de celule cu ultrasunete de înaltă performanță și omogenizatoare pentru laboratoare, banc-top și sisteme la scară industrială. Dimensiunea culturii celulare bacteriene, obiectivul dvs. de cercetare sau producție și volumul de celule de procesat pe oră sau pe zi sunt factori esențiali pentru a găsi disruptorul de celule cu ultrasunete potrivit pentru aplicația dumneavoastră.
Hielscher Ultrasonics oferă diverse soluții pentru sonicare simultană a mai multor probe (până la 10 flacoane cu VialTweeter) și probe de masă (adică plăci de microtitrare / plăci ELISA cu UIP400MTP), precum și ultrasonicator clasic de laborator de tip sondă cu diferite niveluri de putere de la 50 la 400 wați la procesoare cu ultrasunete complet industriale cu până la 16.000 wați pe unitate pentru întreruperea celulelor comerciale și extracția proteinelor în producție mare. Toate ultrasonicators Hielscher sunt construite pentru operațiunea 24/7/365 sub sarcină maximă. Robustețea și fiabilitatea sunt caracteristici de bază ale dispozitivelor noastre cu ultrasunete.
Toate omogenizatoarele digitale cu ultrasunete sunt echipate cu software inteligent, afișaj tactil colorat și protocolare automată a datelor, care fac dispozitivul cu ultrasunete într-un instrument de lucru convenabil în laborator și facilități de producție.
Spuneți-ne, ce fel de celule, ce volum, cu ce frecvență și cu ce țintă trebuie să procesați probele biologice. Vă vom recomanda cel mai potrivit disruptor de celule cu ultrasunete pentru cerințele de proces.
Tabelul de mai jos vă oferă o indicație a capacității aproximative de procesare a sistemelor noastre cu ultrasunete de la omogenizatoare compacte de mână și ultrasonicators multisample la procesoare industriale cu ultrasunete pentru aplicații comerciale:
| Volumul lotului | Debitul | Dispozitive recomandate |
|---|---|---|
| 96 de godeuri / plăci de microtitrare | n.a. | UIP400MTP |
| 10 flacoane à 0,5 până la 1,5 ml | n.a. | VialTweeter la UP200St |
| 00,01 până la 250 ml | 5 până la 100 ml / min | UP50H |
| 0.01 până la 500ml | 10 până la 200 ml/min | UP100H |
| 10 până la 2000 ml | 20 până la 400 ml / min | UP200Ht, UP400St |
| 0.1 până la 20L | 00.2 până la 4L / min | UIP2000hdT |
| 10 până la 100L | 2 până la 10L / min | UIP4000hdT |
| n.a. | 10 până la 100L / min | UIP16000 |
| n.a. | mai mare | grup de UIP16000 |
Contactează-ne! / Întreabă-ne!
UIP400MTP placă sonicator pentru întreruperea celulelor cu randament ridicat în plăci cu 96 de godeuri
ultrasonicator UP200Ht cu 2mm microtip S26d2 pentru sonicare de probe mici
Citiți mai multe despre cum puteți utiliza omogenizatorul de țesut cu ultrasunete pentru pregătirea eficientă și fiabilă a soluțiilor tampon!
Fapte care merită știute
Escherichia Coli bacterii
Escherichia coli este un tip de bacterie, care nu formează spori, gram-negativ și se caracterizează prin forma sa de tijă dreaptă. Bacteriile E. coli sunt prezente în mediul, alimentele și intestinele oamenilor și animalelor. E. coli este de obicei motilă prin utilizarea flagelului peritrico, dar există și tipuri nemotile. E. coli sunt așa-numitele organisme chemoorganotrofe facultativ anaerobe, ceea ce înseamnă că sunt capabile atât de metabolismul respirator, cât și de cel fermentativ. Majoritatea tipurilor de E. coli sunt benigne și îndeplinesc funcții utile în organism, de exemplu, suprimarea creșterii speciilor bacteriene dăunătoare, sinteza vitaminelor etc.
Celulele bacteriene Escherichia coli din așa-numitul tip B sunt o categorie specială de tulpini de E. coli, care sunt utilizate pe scară largă în cercetare pentru a investiga mecanisme precum sensibilitatea bacteriofagilor sau sistemele de modificare a restricțiilor. În plus, bacteriile E. coli sunt apreciate ca un cal de povară fiabil pentru exprimarea proteinelor în laboratoarele de biotehnologie și științe ale vieții. De exemplu, E. coli sunt utilizate pentru a sintetiza compuși precum proteine și oligozaharide la scară industrială. Datorită caracteristicilor specifice, cum ar fi deficitul de protează, producția scăzută de acetat la un nivel ridicat de glucoză și permeabilitatea sporită, celulele E. coli B sunt celulele gazdă cel mai frecvent utilizate pentru producerea proteinelor modificate genetic.
Proteine recombinante
Proteinele recombinante (rProt) câștigă o importanță semnificativă în ramuri multiple, inclusiv în producția chimică, farmaceutică, cosmetică, medicina umană și animală, agricultură, alimentație, precum și industria de tratare a deșeurilor.
Producția de proteine recombinante necesită utilizarea unui sistem de expresie. Ca sisteme celulare de exprimare pentru producerea ADN-ului recombinant, pot fi utilizate atât celule procariote, cât și eucariote. În timp ce celulele bacteriene sunt cele mai utilizate pe scară largă pentru exprimarea proteinelor datorită unor factori precum costul redus, scalabilitatea ușoară și condițiile medii simple, sistemele fără mamifere, drojdii, alge, insecte și celule sunt alternative stabilite. Tipul de proteină, activitatea funcțională, precum și randamentul necesar al proteinei exprimate influențează selecția sistemului celular utilizat pentru exprimarea proteinelor.
Pentru a exprima proteina recombinantă, o anumită celulă trebuie transfecată cu un vector ADN care conține șablonul ADN-ului recombinant. Celulele transfecate cu șablonul sunt apoi cultivate. Ca o consecință a mecanismului celular, celulele transcriu și traduc proteina de interes, producând astfel proteina vizată.
Pe măsură ce proteinele exprimate sunt prinse în matricea celulară, celula trebuie lizată (perturbată și ruptă) pentru a elibera proteinele. Într-o etapă ulterioară de purificare, proteina este separată și purificată.
Prima proteină recombinantă utilizată în tratament a fost insulina umană recombinantă în 1982. Astăzi, mai mult de 170 de tipuri de proteine recombinante sunt produse în întreaga lume pentru tratamente medicale. Proteinele recombinante utilizate în mod obișnuit în medicină sunt, de exemplu, hormonii recombinanți, interferonii, interleukinele, factorii de creștere, factorii de necroză tumorală, factorii de coagulare a sângelui, medicamentele trombolitice și enzimele pentru tratarea bolilor majore, cum ar fi diabetul, nanismul, infarctul miocardic, insuficiența cardiacă congestivă, apoplexia cerebrală, scleroza multiplă, neutropenia, trombocitopenia, anemia, hepatita, artrita reumatoidă, astmul, boala Crohn și terapiile pentru cancer. (cf. Phuc V. Pham, în Omics Technologies and Bio-Engineering, 2018)
Literatură / Referințe
- Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
- LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
- Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
- Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.
Sonicator VialTweeter pentru sonicarea simultană a 10 probe, de exemplu pentru a perturba celulele BL21
Ultrasunete de înaltă performanță! Gama de produse Hielscher acoperă întregul spectru de la ultrasonicator de laborator compact peste unități banc-top la sisteme cu ultrasunete full-industriale.