Liza celulelor BL21 prin ultrasonicare

Celulele BL21 sunt o tulpină de E. coli utilizată pe scară largă în laboratoarele de cercetare, în biotehnologie și în producția industrială datorită capacității lor de a exprima proteine cu eficiență ridicată. Dezintegrarea celulelor, liza și extracția proteinelor cu ultrasunete reprezintă metoda uzuală de izolare și colectare a proteinelor țintă din interiorul celular al celulelor BL21. Ultrasonicarea dezintegrează complet celula și eliberează toate proteinele captive, făcând disponibile 100% din proteine.

Celulele BL21 pentru expresia proteinelor

Celula BL21 este o tulpină bacteriană de E. coli competentă chimic, adecvată pentru transformare și pentru expresia proteinelor la nivel ridicat folosind un sistem de inducție ARN polimerază T7-IPTG. Celulele BL21 permit expresia de înaltă eficiență a proteinelor pentru orice genă aflată sub controlul unui promotor T7. Tulpina E. coli BL21(DE3) este o tulpină de producție a proteinelor bazată pe ARN polimeraza T7, combinată cu vectori de expresie bazați pe promotorul T7, și este aplicată pe scară largă în laboratoare și în industrie pentru producerea proteinelor recombinante. În BL21(DE3), expresia genei care codifică proteina recombinantă este transcrisă de ARN polimeraza T7 codificată cromozomial (T7 RNAP), care transcrie de opt ori mai rapid decât RNAP convențională a E. coli. Acest lucru face ca tulpina BL21(DE3) să fie foarte eficientă și o transformă într-unul dintre cele mai preferate sisteme celulare de expresie a proteinelor.

Protocol pentru liza cu ultrasunete și extracția proteinelor din celulele BL21

Liza celulelor BL21 se realizează în cele mai multe cazuri prin ultrasonicare în combinație cu lauroil sarcozinat de sodiu (cunoscut și sub denumirea de sarkosyl) ca tampon de liză. Avantajele dezintegrării celulelor și ale extracției proteinelor cu ultrasunete constau în fiabilitatea, reproductibilitatea, precum și în operarea simplă, sigură și rapidă a ultrasonicatoarelor. Protocolul de mai jos oferă îndrumări pas cu pas pentru liza cu ultrasunete a celulelor BL21:

• Pentru a îndepărta proteinele chaperone, peletele bacteriene BL21 au fost resuspendate în 50 ml de tampon Sodium Tris-EDTA (STE) rece ca gheața (constând din 10 mM Tris-HCL, pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl suplimentat cu 100 mM PMSF).
• Apoi se adaugă 500 ul de lizozim (10 mg/ ml), iar celulele sunt incubate pe gheață timp de 15 min.
• Ulterior, se adaugă 500 ul de DTT și 7 ml de sarkosyl (10% (w/v) preparat în tampon STE).
• Este esențial ca toate tampoanele de purificare să fie menținute reci ca gheața, iar probele să fie ținute pe gheață în permanență. Toți pașii de purificare ar trebui efectuați, dacă este posibil, în camera frigorifică.



• Pentru liza cu ultrasunete și extracția proteinelor, probele sunt sonicate în ultrasonicatorul MultiSample VialTweeter timp de 4 x 30 sec la amplitudine 100%, cu un interval de 2 min între fiecare sonicare. Alternativ, se poate utiliza un omogenizator cu ultrasunete de tip sondă cu microvârf, de ex., UP200Ht cu S26d2 (3 x 30 sec, pauză de 2 min. între ciclurile ultrasonice, amplitudine 80%).
• Pentru etapele ulterioare de purificare, probele trebuie menținute pe gheață sau, alternativ, depozitate la -80°C până la procesarea ulterioară.

Liza cu ultrasunete sub control precis al temperaturii

Controlul precis și fiabil al temperaturii este crucial atunci când se manipulează probe biologice. Temperaturile ridicate inițiază degradarea termică a proteinelor din probe.
Ca toate tehnicile mecanice de preparare a probelor, sonicarea generează căldură. Cu toate acestea, temperatura probelor poate fi bine controlată atunci când utilizați VialTweeter. Vă prezentăm diverse opțiuni pentru monitorizarea și controlul temperaturii probelor dumneavoastră în timp ce le pregătiți pentru analiză cu VialTweeter și VialPress.

1. Monitorizarea temperaturii probei: Procesorul cu ultrasunete UP200St, care acționează VialTweeter, este echipat cu un software inteligent și un senzor de temperatură conectabil. Conectați senzorul de temperatură la UP200St și introduceți vârful senzorului de temperatură într-unul dintre tuburile cu probe. Prin intermediul ecranului tactil digital color, puteți seta în meniul UP200St un anumit interval de temperatură pentru sonicarea probei dumneavoastră. Ultrasonicatorul se va opri automat la atingerea temperaturii maxime și va rămâne în pauză până când temperatura probei scade la valoarea inferioară a ∆ de temperatură setat. Apoi sonicarea pornește din nou automat. Această funcție inteligentă previne degradarea indusă de căldură.
2. Blocul VialTweeter poate fi prerăcit. Introducerea blocului VialTweeter (doar sonotroda, fără traductor!) în frigider sau în congelator pentru prerăcirea blocului de titan ajută la întârzierea creșterii temperaturii în probă. Dacă este posibil, poate fi prerăcită și proba însăși.
3. Utilizați gheață carbonică pentru răcire în timpul sonicării. Folosiți o tavă puțin adâncă umplută cu gheață carbonică și așezați VialTweeter pe gheață, astfel încât căldura să se poată disipa rapid.

Clienți din întreaga lume utilizează VialTweeter și VialPress pentru activitatea zilnică de preparare a probelor în laboratoare biologice, biochimice, medicale și clinice. Datorită software-ului inteligent și controlului temperaturii ale procesorului UP200St, temperatura este controlată în mod fiabil, iar degradarea probelor indusă de căldură este evitată. Prepararea probelor cu ultrasunete cu VialTweeter și VialPress oferă rezultate extrem de fiabile și reproductibile!

Găsiți dezintegratorul cu ultrasunete optim pentru aplicația dumneavoastră de liză

Hielscher Ultrasonics este un producător cu experiență îndelungată de dezintegratoare celulare și omogenizatoare cu ultrasunete de înaltă performanță pentru laboratoare, sisteme de banc și sisteme la scară industrială. Dimensiunea culturii dumneavoastră de celule bacteriene, obiectivul dumneavoastră de cercetare sau de producție și volumul de celule de procesat pe oră sau pe zi sunt factori esențiali pentru a găsi dezintegratorul celular cu ultrasunete potrivit pentru aplicația dumneavoastră.
Hielscher Ultrasonics oferă diverse soluții pentru sonicarea simultană a mai multor probe (până la 10 flacoane cu VialTweeter) și a unui număr mare de probe (adică plăci de microtitrare / plăci ELISA cu UIP400MTP), precum și ultrasonicatorul clasic de laborator de tip sondă, cu diferite niveluri de putere de la 50 la 400 wați, până la procesoare cu ultrasunete complet industriale, cu până la 16.000 wați per unitate, pentru dezintegrarea celulelor și extracția proteinelor la scară comercială în producția de mari dimensiuni. Toate ultrasonicatoarele Hielscher sunt construite pentru funcționare 24/7/365 la sarcină maximă. Robustețea și fiabilitatea sunt caracteristici esențiale ale dispozitivelor noastre cu ultrasunete.
Toate omogenizatoarele digitale cu ultrasunete sunt echipate cu software inteligent, ecran tactil color și protocolare automată a datelor, ceea ce face din dispozitivul cu ultrasunete un instrument de lucru convenabil în laborator și în unitățile de producție.
Spuneți-ne ce tip de celule, ce volum, cu ce frecvență și cu ce scop trebuie să procesați probele dumneavoastră biologice. Vă vom recomanda cel mai potrivit dezintegrator celular cu ultrasunete pentru cerințele procesului dumneavoastră.

Tabelul de mai jos vă oferă o indicație privind capacitatea aproximativă de procesare a sistemelor noastre cu ultrasunete, de la omogenizatoare compacte ținute în mână și ultrasonicatoare MultiSample până la procesoare industriale cu ultrasunete pentru aplicații comerciale:

Literatură / Referințe

• Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
• LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
• Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
• Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.