Protocol pentru inactivarea coronavirusului SARS-CoV-2 prin sonicare

Hielscher VialTweeter este o unitate unică de preparare a probelor multiple cu ultrasunete, care este utilizată pentru inactivarea coronavirusului SARS-COV-2. VialTweeter permite prepararea simultană a până la 10 flacoane de probe și reprezintă astfel unitatea ideală pentru procesarea în masă a probelor.

Inactivarea coronavirusului SARS-CoV-2 cu VialTweeter

După îndepărtarea fixatorului, monostraturile au fost spălate de trei ori cu soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) înainte de raclarea celulelor în 1mL MEM/5% FBS și sonicate (3 × 10 secunde pornit, 10 secunde oprit la 100% putere și amplitudine) folosind procesorul cu ultrasunete Hielscher UP200St cu VialTweeter ca accesoriu. Supernatanții au fost clarificați prin centrifugare la 3000 × g timp de 10 min. Citiți mai jos protocolul complet pentru inactivarea coronavirusului SARS-CoV-2 de Welch et al. (2020):

Celule și virus

Celulele Vero E6 (Vero C1008; ATCC CRL-1586) au fost cultivate în mediu esențial minim Eagle modificat (MEM) suplimentat cu 10% (v/v) ser fetal de vițel (FCS). Virusul utilizat a fost tulpina SARS-CoV-2 hCOV-19/England/2/2020, izolată de PHE din primul grup de pacienți din Regatul Unit la 29/01/2020. Acest virus a fost obținut la pasajul 1 și utilizat pentru studiile de inactivare la pasajul 2 sau 3.
Pentru reactivii și substanțele chimice utilizate pentru inactivarea SARS-CoV-2, precum și pentru îndepărtarea citotoxicității reactivilor, vă rugăm să consultați raportul științific al Welch et al. (2020).

Inactivarea virusului cu detergenți – protocol de inactivare a coronavirusului SARS-CoV-2 de Welch et al. 2020

Inactivarea SARS-CoV-2


Pentru produsele comerciale, preparatele de virus (lichid de cultură tisulară, cu titruri variind de la 1 × 10⁶ la 1 × 10⁸ PFU/ml) au fost tratate în triplicat cu reactivi la concentrații și pentru timpi de contact recomandați în instrucțiunile de utilizare ale producătorului, acolo unde acestea sunt disponibile, sau la concentrații și timpi solicitați în mod specific de laboratoarele de testare. Acolo unde producătorul a indicat un interval de concentrații, s-a testat cel mai mic raport dintre produs și probă (adică cea mai mică concentrație recomandată a produsului de testat). Reactivii din tuburile de transport al specimenelor au fost testați folosind un raport de un volum de lichid de cultură tisulară la zece volume de reactiv, cu excepția cazului în care producătorul a specificat un raport volumetric dintre lichidul probei și reactiv. Detergenții, fixatorii și solvenții au fost testați la concentrațiile indicate pentru timpii indicați. Toți pașii de inactivare au fost efectuați la temperatura ambiantă a camerei (18 – 25°C). Pentru testarea tipurilor alternative de probe, virusul a fost introdus în matricea de probă indicată într-un raport de 1:9, apoi tratat cu reactivii de testare ca mai sus. Toate experimentele au inclus probe de control tratate simulat în triplicat, cu un volum echivalent de PBS în locul reactivului de testare. Imediat după timpul de contact necesar, 1mL de probă tratată a fost procesat folosind matricea de filtrare selectată corespunzător. Îndepărtarea reactivului pentru testarea inactivării a fost efectuată într-un format mai mare de coloană centrifugală folosind coloane centrifugale Pierce 4mL Detergent Removal Spin Columns (Thermo Fisher) sau prin umplerea coloanelor de centrifugare goale Pierce cu capacitate de 10mL (Thermo Fisher) cu SM2 Bio-Beads, Sephacryl S-400HR sau Sephadex LH-20 pentru a obține 4mL de bile/rășină tasate. Pentru purificarea cu filtre Amicon, 2 × 500μl de probe au fost purificate folosind două filtre centrifugale prin metoda descrisă anterior, apoi reunite împreună. Pentru îndepărtarea formaldehidei și a formaldehidei cu glutaraldehidă, s-a folosit un filtru cu 1× 500μl volum de probă, resuspendat după procesare în 500μl PBS și adăugat la 400ul MEM/5% FBS. Pentru inactivarea monostraturilor infectate, baloane de 12,5 cm² cu celule Vero E6 (2,5 × 10⁶ celule/balon în 2,5mL MEM/5% FBS) au fost infectate la MOI 0,001 și incubate la 37°C/5% CO₂ timp de 24 de ore. Supernatantul a fost îndepărtat, iar celulele au fost fixate folosind 5mL de formaldehidă sau formaldehidă și glutaraldehidă la temperatura camerei timp de 15 sau 60 min. Fixatorul a fost îndepărtat, iar monostraturile au fost spălate de trei ori cu PBS înainte de raclarea celulelor în 1mL MEM/5% FBS și sonicate (3 × 10 secunde pornit, 10 secunde oprit la 100% putere și amplitudine) folosind un UP200St cu accesoriul VialTweeter (Hielscher Ultrasound Technology). Supernatanții au fost clarificați prin centrifugare la 3000 × g timp de 10 min.


Detalii privind reactivul utilizat pentru inactivarea coronavirusului SARS-CoV-2 cu VialTweeter cu ultrasunete conform protocolului de Welch et al. 2020

Protocolul complet, inclusiv utilizarea VialTweeter de la Hielscher, poate fi găsit aici:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

Dezmembratoare ultrasonice sofisticate și dezintegratoare de celule

Ultrasonicatorul pentru probe multiple VialTweeter este doar una dintre numeroasele soluții ultrasonice pentru prepararea probelor în laboratoarele biologice, biochimice și clinice. Hielscher Ultrasonics oferă dezmembratorul ultrasonic ideal pentru aplicația dumneavoastră, de ex. liza celulelor, extracția celulară, omogenizarea țesuturilor, solubilizarea lizatului, dizolvarea, degazarea probelor etc.
Spuneți-ne câte probe trebuie să procesați pe oră și pe zi, dacă preferați sonicarea directă sau indirectă și care este obiectivul tratamentului ultrasonic al probelor. Vă vom recomanda cea mai potrivită unitate ultrasonică pentru rutina dumneavoastră zilnică de lucru!
Procesoarele ultrasonice digitale ale Hielscher Ultrasonics sunt echipate cu software inteligent, înregistrare automată a datelor, opțiuni ușoare de presetare pentru controlul temperaturii, durata sonicării, modul ciclu/impuls, precum și iluminarea probei și control de la distanță prin browser. Ne străduim să facem dispozitivele noastre ultrasonice cât mai inteligente posibil, astfel încât cercetarea și rutina dumneavoastră de lucru să devină cât mai convenabile și de succes posibil.
Faceți clic aici pentru a găsi mai multe aplicații, inclusiv protocoale de preparare ultrasonică a probelor cu VialTweeter!