Protocol pentru inactivarea coronavirusului SARS-CoV-2 cu sonicare

Hielscher VialTweeter este o unitate unică de pregătire cu ultrasunete multi-probă, care este utilizat pentru a inactiva coronavirusul SARS-COV-2. VialTweeter permite prepararea simultană a până la 10 flacoane de probă și, prin urmare, este unitatea ideală pentru prelucrarea probelor în masă.

Inactivarea coronavirusului SARS-CoV-2 cu VialTweeter

După îndepărtarea fixativului, monostraturile au fost spălate de trei ori cu soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) înainte de răzuirea celulelor în 1 ml MEM / 5% FBS și sonicated (3 × 10 secunde pe, 10 secunde off la 100% putere și amplitudine) folosind procesorul cu ultrasunete Hielscher UP200St cu VialTweeter atașare. Supernatanții au fost limpeziți prin centrifugare la 3000 × g timp de 10 minute. 

Citiți protocolul complet aici pentru inactivarea coronavirusului SARS-CoV-2 de către Welch et al. (2020) de mai jos:

Celule și viruși

Celule Vero E6 (Vero C1008; ATCC CRL-1586) au fost cultivate în mediul minim esențial modificat al Eagle (MEM) suplimentat cu 10% (v / v) ser fetal de vițel (FCS). Virusul utilizat a fost tulpina SARS-CoV-2 hCOV-19 / Anglia / 2 / 2020, izolată de PHE din primul grup de pacienți din Marea Britanie la 29/01/2020. Acest virus a fost obținut la pasajul 1 și utilizat pentru studii de inactivare la pasajul 2 sau 3.
Pentru reactivi și substanțe chimice utilizate pentru inactivarea SARS-CoV-2, precum și pentru eliminarea citotoxicității reactivului, a se vedea raportul științific al lui Welch et al. (2020).

Inactivarea virusului de către detergenți – Protocolul de inactivare a coronavirusului SARS-CoV-2 de Welch și colab. 2020

Inactivare SARS-CoV-2

Pentru produsele comerciale, preparate virale (lichid de cultură tisulară, titruri cuprinse între 1 × 10⁶ până la 1 × 10⁸ PFU/ml) au fost tratate în trei exemplare cu reactivi la concentrații și timpi de contact recomandați în instrucțiunile de utilizare ale producătorilor, dacă sunt disponibile, sau pentru concentrații și momente solicitate în mod specific de laboratoarele de testare. În cazul în care producătorul a dat un interval de concentrații, a fost testat cel mai mic raport dintre produs și probă (adică cea mai mică concentrație recomandată a produsului testat). Reactivii tuburilor de transport pentru probe au fost testați utilizând un raport de un volum de fluid de cultură tisulară la zece volume de reactiv, cu excepția cazului în care producătorul a specificat un raport volumic între lichidul de probă și reactiv. Detergenții, fixatorii și solvenții au fost testați la concentrațiile indicate pentru momentele indicate. Toate etapele de inactivare au fost efectuate la temperatura camerei (18 – 25°C). Pentru testarea tipurilor alternative de probe, virusul a fost introdus în matricea de probă indicată într-un raport de 1:9, apoi tratat cu reactivi de testare ca mai sus. Toate experimentele au inclus probe de control triplu tratate simulat cu un volum echivalent de PBS în locul reactivului de testare. Imediat după timpul de contact necesar, 1 ml de probă tratată a fost procesată folosind matricea de filtrare selectată corespunzător. Îndepărtarea reactivului pentru testarea inactivării a fost efectuată într-un format de coloană de centrifugare mai mare folosind coloane de centrifugare Pierce 4mL Detergent Removal (Thermo Fisher) sau prin umplerea coloanelor goale de centrifugă Pierce cu capacitate de 10 ml (Thermo Fisher) cu SM2 Bio-Beads, Sephacryl S-400HR sau Sephadex LH-20 pentru a obține 4 ml mărgele ambalate / rășină. Pentru purificare folosind filtre Amicon, probele de 2 × 500 μl au fost purificate folosind două filtre centrifuge prin metoda descrisă anterior, apoi grupate. Pentru formaldehidă și formaldehidă cu îndepărtarea glutaraldehidei, a fost utilizat un filtru cu un volum de probă de 1× 500μl, resuspendat după prelucrare în PBS de 500μl și adăugat la 400ul MEM / 5% FBS. Pentru inactivarea infectate monostrat, 12.5 cm² baloane cu celule Vero E6 (2,5 × 10⁶ celule/balon în 2,5 ml MEM/5% FBS) au fost infectate la MOI 0,001 și incubate la 37°C/5% CO₂ timp de 24 de ore. Supernatantul a fost îndepărtat și celulele fixate folosind 5 ml de formaldehidă sau formaldehidă și glutaraldehidă la temperatura camerei timp de 15 sau 60 de minute. Fixativul a fost îndepărtat, și monostraturi spălate de trei ori cu PBS înainte de răzuirea celulelor în 1mL MEM / 5% FBS și sonicated (3 × 10 secunde pe, 10 secunde off la 100% putere și amplitudine) folosind un UP200St cu atașament VialTweeter (Hielscher Ultrasound Technology). Supernatanții au fost limpeziți prin centrifugare la 3000 × g timp de 10 minute.

Detalii despre reactivul utilizat pentru inactivarea coronavirusului SARS-CoV-2 cu ultrasunete VialTweeter conform protocolului de Welch et al. 2020

Protocolul complet, inclusiv utilizarea Hielscher VialTweeter pot fi găsite aici:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

Dismembratori cu ultrasunete sofisticate și perturbatoare celulare

Ultrasonicator multi-eșantion VialTweeter este doar una dintre numeroasele soluții cu ultrasunete pentru pregătirea probei în laboratoarele biologice, biochimice și clinice. Hielscher Ultrasonics oferă dismembrator cu ultrasunete ideal pentru aplicația dvs., de exemplu, liza celulară, extracția celulelor, omogenizarea țesuturilor, solubilizarea lsatului, dizolvarea, degazarea probei etc.
Spuneți-ne câte probe trebuie să procesați pe oră și zi, dacă preferați sonicare directă sau indirectă și care este ținta tratamentului cu eșantion cu ultrasunete. Vă vom recomanda cea mai potrivită unitate cu ultrasunete pentru rutina zilnică de lucru!
Hielscher Ultrasonics' procesoare digitale cu ultrasunete sunt echipate cu software inteligent, înregistrare automată a datelor, opțiuni ușoare de pre-setare pentru controlul temperaturii, durata sonicare, ciclu / modul puls, precum și iluminarea eșantionului și telecomanda browserului. Ne străduim să facem dispozitivele noastre cu ultrasunete cât mai inteligente posibil, astfel încât rutina de cercetare și de lucru să devină cât mai convenabilă și de succes posibil.
Click aici, pentru a găsi mai multe aplicații, inclusiv protocoale de pregătire a probei cu ultrasunete cu VialTweeter!