Pregătirea probelor cu ultrasunete pentru testele ELISA

Testele precum ELISA sunt utilizate pe scară largă pentru diagnosticul in vitro, detectarea proteinelor asociate bolilor și controlul calității (de ex. monitorizarea alergenilor alimentari). Pregătirea probelor cu ultrasunete este o tehnică rapidă, fiabilă și reproductibilă pentru liza celulelor și izolarea proteinelor intracelulare, a ADN-ului, ARN-ului și a organitelor. Hielscher Ultrasonics oferă diverse soluții cu ultrasunete pentru pregătirea comodă a probelor individuale, a mai multor flacoane, precum și pentru plăci de microtitrare și plăci cu 96 de godeuri.

ELISA – Testul imunosorbent legat de enzime (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

ELISA înseamnă enzyme-linked immunosorbent assay (test imunosorbent legat de enzime) și este o tehnică de analiză biochimică larg utilizată, din categoria testelor de legare a liganzilor. În ELISA, o probă lichidă este adăugată pe o fază solidă staționară cu proprietăți speciale de legare. În mod normal, faza solidă staționară este aplicată ca acoperire pe o placă cu godeuri sau pe o placă ELISA. Apoi, diverși reactivi lichizi sunt adăugați secvențial, incubați și spălați, astfel încât, în final, în lichidul final din godeu apare o modificare optică (de ex., dezvoltarea culorii de către produsul unei reacții enzimatice). Modificarea optică permite măsurarea cantității de analit printr-o așa-numită „citire” cantitativă. Pentru citirea cantitativă se utilizează un spectrofotometru, un fluorometru sau un luminometru, pentru a detecta și măsura intensitatea luminii transmise. Sensibilitatea detecției este influențată de amplificarea semnalului în timpul reacțiilor analitice. Deoarece reacțiile enzimatice sunt procese de amplificare bine investigate și fiabile, enzimele sunt utilizate pentru a crea semnalul. Enzimele sunt legate de reactivii de detecție în proporții fixe pentru a permite o cuantificare precisă, ceea ce explică și denumirea de test imunosorbent „legat de enzime” (enzyme-linked).
Deoarece testele ELISA se efectuează în plăci de microtitrare / plăci cu 96 de godeuri, tehnica este cunoscută ca tehnică de testare pe bază de plăci și este utilizată, de ex., în diagnosticul clinic in vitro, în cercetare, în dezvoltarea de medicamente etc. pentru detectarea și cuantificarea anticorpilor, peptidelor, proteinelor și hormonilor.
Tehnica ELISA este frecvent utilizată ca instrument de diagnostic în medicină, biotehnologie, fitopatologie și reprezintă, de asemenea, o măsură importantă de control al calității în numeroase industrii.

Pregătirea probelor cu ultrasunete înainte de ELISA

Înainte de efectuarea testului ELISA, probele necesită etape de pregătire precum liza celulelor și extracția proteinelor intracelulare, a ADN-ului, ARN-ului etc. Avantajul lizei celulare și al izolării proteinelor cu ultrasunete constă în eficiența, fiabilitatea și reproductibilitatea ridicate. Toți acești factori sunt importanți pentru a obține rezultate de diagnostic și de cercetare de înaltă calitate

Protocol pentru liza celulară cu ultrasunete înainte de ELISA

• Pentru culturi celulare: Înainte de liza celulară cu ultrasunete, centrifugați celulele timp de 5 min la 270 x g într-o microcentrifugă. Îndepărtați supernatantul prin aspirare și resuspendați celulele în 30 – 100 μL de tampon RIPA. Apoi, incubați peletul celular pe gheață timp de 30 min.
• Acum, proba celulară este pregătită pentru liza cu ultrasunete:
  Utilizați un ultrasonicator cu sondă (de ex. UP200Ht cu sonotroda S26d2) sau un dispozitiv cu ultrasunete pentru probe multiple (de ex. VialTweeter pentru sonicarea simultană a până la 10 flacoane sau UIP400MPT pentru plăci de microtitrare / plăci cu 96 de godeuri), în funcție de numărul de probe pe care trebuie să le pregătiți.
  Pentru sonicarea cu sondă a unei singure probe, plasați celulele în tuburi de microcentrifugă de 1,5 mL.
• Presetați durata sonicării, aportul total de energie, modul ciclic și/sau limitele de temperatură în meniul digital al ultrasonicatorului. Acest lucru asigură o sonicare extrem de fiabilă și repetabilitate.
• Introduceți sonotroda și porniți dispozitivul cu ultrasunete. Deplasați ușor microvârful sonotrodei ultrasonice prin probă pentru a sonica proba uniform.
  Pentru majoritatea celulelor, liza cu ultrasunete va fi completă după 2–4 cicluri de sonicare de câte 10 sec.
• După sonicare, scoateți sonotroda din probă. Probele trebuie incubate pe gheață timp de 5 min. Apoi, centrifugați la 10.000 x g timp de 20 min pentru a sedimenta resturile. Transferați supernatanții într-un tub de microcentrifugă nou. Etichetați analiții și păstrați-i la -20°C.
• Sonotroda ultrasonică poate fi curățată ștergând-o corespunzător cu alcool sau prin sonicare într-un pahar Berzelius umplut cu alcool, de ex. etanol 70%. Toate sonotrodele ultrasonice din titan sunt autoclavabile.

• Clătiți țesutul cu PBS răcit la gheață (0,01M, pH=7,4) pentru a îndepărta temeinic excesul de sânge hemolizat.
• Cântăriți țesutul (rinichi, inimă, plămân, splină etc.) și mărunțiți-l în bucăți mici, care sunt omogenizate în PBS. Volumul de PBS necesar depinde de greutatea țesutului. Ca regulă generală, 1g de țesut necesită aprox. 9mL PBS. Se recomandă adăugarea unei cantități de inhibitor de protează în PBS. (Alternativ, se poate utiliza tampon RIPA sau tampon de liză hipoton care conține un cocktail de inhibitori de protează și fosfatază.)
• În funcție de dimensiunea țesutului, un scurt tratament în vortex (aprox. 1–2 min. în impulsuri de 15 sec.) poate fi util pentru pretratarea țesutului.
• Montați un microvârf, de ex. S26d2, pe ultrasonicatorul dumneavoastră. Plasați tubul cu proba de țesut într-o baie de gheață.
• Sonicați proba cu ultrasonicatorul dumneavoastră, de ex. UP200St (amplitudine 80%), timp de 1 min. în modul puls (15sec pornit, 15sec pauză). Mențineți proba în baia de gheață.
• Omogenatele sunt apoi centrifugate pentru a obține fracțiuni specifice (citosolice, nucleare, mitocondriale sau lizozomale), în scopul îmbogățirii proteinei pentru analiză. Prin centrifugarea probei timp de 5 minute la 5000×g, se recuperează supernatantul.

Controlul fiabil al temperaturii în timpul sonicării

Temperatura este un factor crucial care influențează procesul și este deosebit de important pentru tratarea probelor biologice, de ex. pentru a preveni degradarea termică a proteinelor. Ca toate tehnicile mecanice de pregătire a probelor, sonicarea generează căldură. Totuși, temperatura probelor poate fi bine controlată atunci când se utilizează dispozitivele Hielscher Ultrasonics. Vă prezentăm diverse opțiuni pentru monitorizarea și controlul temperaturii probelor dumneavoastră în timp ce le pregătiți preanalitic cu un ultrasonicator cu sondă sau cu VialTweeter.

1. Monitorizarea temperaturii probei: Toate procesoarele digitale cu ultrasunete Hielscher sunt echipate cu un software inteligent și un senzor de temperatură conectabil. Conectați senzorul de temperatură la dispozitivul cu ultrasunete (de ex., UP200Ht, UP200St, VialTweeter, sonicatorul pentru plăci cu godeuri multiple UIP400MTP) și introduceți vârful senzorului de temperatură într-unul dintre tuburile cu probe. Prin intermediul ecranului tactil digital color, puteți seta în meniul procesorului cu ultrasunete un interval specific de temperatură pentru sonicarea probei. Ultrasonicatorul se va opri automat la atingerea temperaturii maxime și va face pauză până când temperatura probei scade la valoarea inferioară a ∆ de temperatură setat. Apoi sonicarea pornește din nou automat. Această funcție inteligentă previne degradarea indusă de căldură.
2. În ceea ce privește unitatea cu ultrasunete pentru probe multiple VialTweeter, blocul de titan, care susține tuburile cu probe, poate fi prerăcit. Plasarea blocului VialTweeter (doar sonotroda, fără traductor!) în frigider sau congelator pentru prerăcirea blocului de titan ajută la amânarea creșterii temperaturii în probă. Dacă este posibil, poate fi prerăcită și proba însăși.
3. Utilizați o baie de gheață sau gheață carbonică pentru răcire în timpul sonicării. Plasați tubul (tuburile) cu probe într-o baie de gheață în timpul sonicării. Pentru VialTweeter, utilizați o tavă puțin adâncă umplută cu gheață carbonică și așezați VialTweeter pe gheața carbonică, astfel încât căldura să se poată disipa rapid.

Clienții din întreaga lume utilizează ultrasonicatoarele cu sondă Hielscher, precum și unitățile de sonicare pentru probe multiple VialTweeter și UIP400MTP pentru activitatea zilnică de pregătire a probelor în laboratoare biologice, biochimice, medicale și clinice. Datorită software-ului inteligent și controlului temperaturii procesoarelor Hielscher, temperatura este controlată în mod fiabil, iar degradarea probelor indusă de căldură este evitată. Pregătirea probelor cu ultrasunete cu soluțiile cu ultrasunete Hielscher oferă rezultate extrem de fiabile și reproductibile!
Citiți mai multe despre sonicarea cu capacitate mare de procesare a probelor utilizând sonicatorul pentru plăci cu godeuri multiple UIP400MTP pentru teste!