Pregătirea probei cu ultrasunete pentru testele ELISA
Testele precum ELISA sunt utilizate pe scară largă pentru diagnosticarea in vitro, detectarea proteinelor legate de boli și controlul calității (de exemplu, monitorizarea alergenilor alimentari). Pregătirea probei cu ultrasunete este o tehnică rapidă, fiabilă și reproductibilă pentru a liza celulele și a izola proteinele intracelulare, ADN-ul, ARN-ul și organele. Hielscher Ultrasonics oferă diverse soluții cu ultrasunete pentru pregătirea convenabilă a probelor unice, flacoane multiple, precum și pentru plăci de microtitrare și plăci cu 96 de puțuri.
ELISA – Testul imunoabsorbant legat de enzime
ELISA înseamnă testul imunosorbant legat de enzime și este o tehnică de analiză biochimică utilizată pe scară largă din categoria testelor de legare a ligandului. În testul ELISA, se adaugă o probă lichidă pe o fază solidă staționară cu proprietăți speciale de legare. În mod normal, faza solidă staționară este aplicată ca acoperire pe o placă de puț sau pe o placă ELISA. Apoi, diferiți reactivi lichizi sunt adăugați secvențial, incubați și spălați, astfel încât, în final, are loc o schimbare optică (de exemplu, dezvoltarea culorii prin produsul unei reacții enzimatice) în lichidul final din puț. Schimbarea optică permite măsurarea cantității de analit printr-o așa-numită cantitate “lectură". Pentru citirea cantitativă, un spectrofotometru, fluorometru sau luminometru este utilizat pentru a detecta și măsura intensitatea luminii transmise. Sensibilitatea de detecție este influențată de amplificarea semnalului în timpul reacțiilor analitice. Deoarece reacțiile enzimatice sunt bine investigate și procese de amplificare fiabile, enzimele sunt utilizate pentru a crea semnalul. Enzimele sunt legate de reactivii de detecție în proporții fixe pentru a permite cuantificarea precisă, ceea ce explică, de asemenea, denumirea de test imunosorbant "legat de enzime".
Deoarece testele ELISA sunt efectuate pe plăci de microtitrare / plăci cu 96 de godeuri, este cunoscută sub numele de tehnică de testare pe bază de plăci și este utilizată, de exemplu, în diagnosticul clinic in vitro, cercetare, dezvoltarea de medicamente etc. pentru detectarea și cuantificarea anticorpilor, peptidelor, proteinelor și hormonilor.
Tehnica ELISA este frecvent utilizată ca instrument de diagnostic în medicină, biotehnologie, patologia plantelor și este, de asemenea, o măsură importantă de control al calității în mai multe industrii.
Pregătirea probei cu ultrasunete înainte de ELISA
Înainte ca testul ELISA să poată fi efectuat, probele necesită etape de preparare, cum ar fi liza celulară și extracția proteinelor intracelulare, ADN, ARN etc. Avantajul lizei celulelor cu ultrasunete și izolarea proteinelor este eficiența ridicată, fiabilitatea și reproductibilitatea. Toți acești factori sunt importanți pentru a obține rezultate de diagnosticare și cercetare de înaltă calitate
- Tratarea omogenă a probelor
- Liză completă
- Extracția completă a proteinelor (de exemplu, anticorpi, ADN)
- Adaptare optimă la tipul de celulă
- Pentru orice dimensiune a eșantionului
- Reproductibile
- temperatură controlată
- Protocolare automată a datelor pe cardul SD
Protocol pentru pre-ELISA Liza celulelor cu ultrasunete
- Pentru culturi celulare: Înainte de liza celulelor cu ultrasunete, centrifugați celulele timp de 5 minute la 270 x g într-o microcentrifugă. Se îndepărtează supernatantul prin aspirație și se omogenizează celulele în 30-100 μL de tampon RIPA. Apoi, incubați granula celulară pe gheață timp de 30 de minute.
- Acum, proba de celule este gata pentru liza cu ultrasunete:
Utilizați un ultrasonicator de tip sondă (de exemplu, UP200Ht cu sondă S26d2) sau un dispozitiv cu ultrasunete multi-eșantion (de exemplu, VialTweeter pentru sonicare simultană de până la 10 flacoane sau UIP400MPT pentru plăci de microtitrare / 96-godeuri plăci) în funcție de cantitatea de probe trebuie să pregătiți.
Pentru sonicare tip sondă a unei singure probe, plasați celulele în tuburi de microcentrifugă de 1,5 ml. - Pre-setați durata cu ultrasunete, consumul total de energie, modul ciclu și / sau limitele de temperatură în meniul digital al ultrasonicator. Acest lucru asigură sonicare extrem de fiabile și repetabilitate.
- Introduceți sonotrode și porniți dispozitivul cu ultrasunete. Mutați ușor micro-vârful sondei cu ultrasunete prin probă pentru a sonica proba uniform.
Pentru majoritatea celulelor, liza cu ultrasunete va fi finalizată după 2 -4 cicluri de 10 sec sonicare. - După sonicare, scoateți sonotroda din probă. Probele trebuie incubate pe gheață timp de 5 minute. Apoi, centrifugați la 10.000 x g timp de 20 de minute pentru a granula resturile. Se transferă supernatanții într-un tub nou de microcentrifugă. Etichetați analiții și depozitați la -20°C.
- Sonotroda cu ultrasunete pot fi curățate ștergându-l în mod corespunzător cu alcool sau sonicate într-un pahar umplut cu alcool, de exemplu 70% etanol. Toate sondele cu ultrasunete fabricate din titan sunt autoclavabile.
- Clătiți țesutul cu PBS rece ca gheața (0,01M, pH = 7,4) pentru a îndepărta bine excesul de hemoliză.
- Se cântărește țesutul (rinichi, inimă, plămân, splină etc.) și se macerează în bucăți mici, care se omogenizează în PBS. Volumul de PBS necesar este legat de greutatea țesutului. Ca regulă generală, 1g de țesut necesită aproximativ 9 ml PBS. Se recomandă adăugarea unui inhibitor de protează la PBS. (RIPA sau tamponul de liză hipotonic care conține cocktail de protează și inhibitor de fosfatază pot fi utilizate alternativ.)
- În funcție de dimensiunea țesutului, un tratament scurt cu vortex (aproximativ 1-2 minute în 15 sec. impulsuri) poate fi util pentru a pre-trata țesutul.
- Montați un micro-tip, de exemplu S26d2, la ultrasonicator. Se introduce eprubeta cu șervețelul într-o baie de gheață.
- Sonicate proba cu ultrasonicator, de exemplu, UP200St (80% amplitudine) pentru 1 min. în modul puls (15sec on, 15sec pauză). Se păstrează proba în baia de gheață.
- Omogenatele sunt apoi centrifugate pentru a obține probe specifice (citosolice, nucleare, mitocondriale sau lizozomiale) pentru a îmbogăți proteina pentru analiză. Prin centrifugarea probei timp de 5 minute la 5000 × g, se obține supernatantul.
Control fiabil al temperaturii în timpul sonicare
Temperatura este un factor crucial de influențare a procesului, care este deosebit de important pentru tratarea probelor biologice, de exemplu pentru a preveni degradarea termică a proteinelor. Ca toate tehnicile mecanice de pregătire a probelor, sonicare creează căldură. Cu toate acestea, temperatura probelor poate fi bine controlată atunci când se utilizează dispozitivele Hielscher Ultrasonics. Vă prezentăm diverse opțiuni pentru a monitoriza și controla temperatura probelor în timp ce le pregătiți cu un ultrasonicator de tip sondă sau VialTweeter preanalitic.
- Monitorizarea temperaturii probei: Toate procesoarele digitale cu ultrasunete Hielscher sunt echipate cu un software inteligent și un senzor de temperatură conectabil. Conectați senzorul de temperatură la dispozitivul cu ultrasunete (de exemplu, UP200Ht, UP200St, VialTweeter, Sonicator cu plăci cu mai multe godeuri UIP400MTP) și introduceți vârful senzorului de temperatură într-unul dintre tuburile de probă. Prin intermediul afișajului tactil digital colorat, puteți seta în meniul procesorului cu ultrasunete un anumit interval de temperatură pentru sonicarea probei. Ultrasonicatorul se va opri automat când temperatura maximă este atinsă și se va opri până când temperatura probei va scădea la valoarea mai mică a temperaturii setate ∆. Apoi sonicarea începe automat din nou. Această caracteristică inteligentă previne degradarea indusă de căldură.
- În ceea ce privește unitatea cu ultrasunete multi-eșantion VialTweeter, blocul de titan, care dețin tuburile de probă, pot fi pre-răcite. Puneți blocul VialTweeter (numai sonotrode fără traductor!) în frigider sau congelator pentru a pre-răci blocul de titan ajută la amânarea creșterii temperaturii în probă. Dacă este posibil, eșantionul în sine poate fi și pre-răcit.
- Utilizați o baie de gheață sau gheață uscată pentru a se răci în timpul sonicare. Plasați tuburile de probă în timpul sonicare într-o baie de gheață. Pentru VialTweeter, utilizați o tavă de mică adâncime umplută cu gheață carbonică și așezați VialTweeter pe gheața carbonică, astfel încât căldura să se disipeze rapid.
Clienții din întreaga lume folosesc ultrasunetele de tip sondă Hielscher, precum și unitățile de sonicare cu mai multe probe VialTweeter și UIP400MTP pentru munca lor zilnică de pregătire a probelor în laboratoarele biologice, biochimice, medicale și clinice. Software-ul inteligent și controlul temperaturii procesoarelor Hielscher, temperatura este controlată în mod fiabil și se evită degradarea probelor indusă de căldură. Pregătirea probelor cu ultrasunete cu soluțiile cu ultrasunete Hielscher oferă rezultate extrem de fiabile și reproductibile!
Citiți mai multe despre sonicarea cu randament ridicat folosind sonicatorul cu plăci cu mai multe godeuri UIP400MTP pentru teste!
Contactează-ne! / Întreabă-ne!
Literatură / Referințe
- Brandy Verhalen , Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed. Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
Fapte care merită știute
Ce tipuri de ELISA există?
Există mai multe tipuri de ELISA, care se disting prin principiul lor de funcționare. Acestea sunt cunoscute sub numele de ELISA directă, ELISA indirectă, ELISA sandwich, ELISA competitivă și ELISA inversă. Mai jos, vă prezentăm o prezentare generală a diferitelor tipuri ELISA și a principalelor caracteristici și diferențe ale acestora.
ELISA poate fi executat într-un format calitativ sau cantitativ. Rezultatele calitative oferă un rezultat pozitiv sau negativ simplu, în timp ce în testul ELISA cantitativ densitatea optică (DO) a probei este comparată cu o curbă standard, care este de obicei o diluție serială a unei soluții cu concentrație cunoscută a moleculei țintă.
ELISA directă
ELISA directă este cea mai simplă formă de testare a Elisa, în care se utilizează numai un anticorp primar marcat enzimatic și nu sunt necesari anticorpi secundari. Anticorpul primar marcat cu enzimă se leagă direct de țintă, adică de antigen. Soluția antigenică tamponată se adaugă în fiecare godeu al unei plăci de microtitrare (de obicei plăci cu 96 de godeuri, plăci ELISA), unde aderă la suprafața plasticului prin interacțiuni de încărcare. Când enzima legată de anticorpul primar reacționează cu substratul său, produce un semnal vizibil care poate fi măsurat prin spectrofotometru, fluorometru sau luminometru.
ELISA indirectă
Pentru testul ELISA indirect, sunt necesare atât un anticorp primar, cât și un anticorp secundar. Cu toate acestea, spre deosebire de testul ELISA direct, nu anticorpul primar, ci anticorpul secundar este etichetat cu o enzimă. Antigenul este imobilizat pe placa godeu și legat de anticorpul primar. Ulterior, anticorpul secundar marcat enzimatic se leagă de anticorpul primar. În cele din urmă, enzima legată de anticorpul secundar reacționează cu substratul său pentru a produce un semnal vizibil care poate fi detectat.
Sandwich ELISA
În timp ce în testele ELISA directe și indirecte, antigenul este imobilizat și acoperit pe suprafața plăcii puțului, în testul ELISA sandwich anticorpul este imobilizat pe suprafața plastică a plăcii ELISA. Anticorpii imobilizați din ELISA sandwich sunt cunoscuți sub numele de anticorpi de captură. În plus față de anticorpii de captare, în ELISA sandwich sunt necesari și așa-numiții anticorpi de detecție. Anticorpii de detecție includ un anticorp de detectare primară nemarcat și un anticorp secundar de detectare marcat enzimatic.
În trepte, antigenul de interes se leagă de anticorpul de captură imobilizat pe placă. Apoi, anticorpul primar de detectare se leagă de antigen. Ulterior, anticorpul secundar de detectare se leagă de anticorpul primar de detecție. În etapa finală de reacție, enzima reacționează cu substratul său pentru a produce un semnal vizibil care poate fi detectat optic.
ELISA competitiv
ELISA competitivă, cunoscută și sub denumirea de ELISA inhibiție, este cel mai complex tip ELISA, deoarece implică utilizarea unui antigen inhibitor. Fiecare dintre cele trei formate, ELISA direct, indirect și sandwich, poate fi adaptat la formatul ELISA competitiv. În testul ELISA competitiv, antigenul inhibitor și antigenul de interes concurează pentru legarea de anticorpul primar.
Pentru testul ELISA competitiv, anticorpul nemarcat este incubat în prezența antigenului său, adică a probei. Aceste complexe anticorp/antigen legate sunt apoi adăugate într-un godeu acoperit cu antigen.
Placa este spălată, astfel încât anticorpii nelegați să fie îndepărtați. ELISA competitiv își are numele datorită faptului că cu cât mai mult antigen este în probă, cu atât se formează mai multe complexe antigen-anticorpi. Aceasta înseamnă că există mai puțini anticorpi nelegați disponibili pentru a se lega de antigenul din godeu, iar antigenele trebuie să concureze pentru un anticorp disponibil. Se adaugă un anticorp secundar, care corespunde anticorpului primar. Acest al doilea anticorp este legat de enzimă. Când se adaugă substratul, enzimele rămase produc un semnal cromogen sau fluorescent.
În acest moment, reacția este oprită pentru a evita eventuala saturație a semnalului.
Unele kituri ELISA competitive includ un antigen legat de enzime în locul unui anticorp legat de enzime. Antigenul marcat concurează pentru situsurile primare de legare a anticorpilor cu antigenul eșantion (nemarcat). Cu cât este mai puțin antigen în probă, cu atât mai mult antigen marcat este reținut în godeu și cu atât semnalul este mai puternic.
ELISA inversă
Reverse ELISA nu utilizează plăci cu godeuri, ci lasă antigenele suspendate în lichidul de testare. Testul ELISA invers măsoară cantitatea de anticorp legat prin antigen. Acesta a fost dezvoltat special pentru a detecta și investiga proteina învelișului virusului West Nile și modul în care este capabilă să găsească anticorpi specifici virusului.
Ce markeri enzimatici sunt utilizați pentru ELISA?
Lista de mai jos prezintă cei mai comuni markeri enzimatici utilizați în testele ELISA, care permit măsurarea rezultatelor testului la finalizare.
- OPD (diclorhidrat de o-fenilendiamină) transformă chihlimbarul pentru a detecta HRP (peroxidaza din hrean), care este adesea folosită ca proteină conjugată.
- TMB (3,3′,5,5′-tetrametilbenzidină) devine albastră la detectarea HRP și devine galbenă după adăugarea de acid sulfuric sau fosforic.
- ABTS (2,2′-Azinobis [acid 3-etilbenzotiazolină-6-sulfonic]-sare de diamoniu) devine verde la detectarea HRP.
- PNPP (fosfat p-nitrofenil, sare disodică) devine galben atunci când detectează fosfataza alcalină.