Liza cu ultrasunete a probelor de Drosophila Melanogaster

Drosophila melanogaster este utilizată pe scară largă în laboratoare ca organism model. Prin urmare, etapele de pregătire preanalitică, cum ar fi liza, dezintegrarea celulelor, extracția proteinelor și forfecarea ADN-ului din probele de Drosophila melanogaster, trebuie efectuate frecvent. Dismembratoarele cu ultrasunete sunt fiabile și eficiente și pot fi utilizate pentru a efectua cu ușurință diverse sarcini, cum ar fi liza, extracția proteinelor sau fragmentarea ADN-ului, doar prin ajustarea parametrilor procesului ultrasonic. Omogenizatoarele cu ultrasunete sunt astfel instrumente flexibile, cu o gamă largă de aplicații.

Liza cu ultrasunete și extracția proteinelor

Liza, solubilizarea celulelor, omogenizarea țesuturilor și extracția proteinelor sunt sarcini tipice pentru dismembratoarele cu ultrasunete în laboratoarele biologice. Dismembratoarele cu ultrasunete și dezintegratoarele celulare sunt foarte potrivite pentru omogenizarea țesuturilor animale, a insectelor (de ex., Drosophila melanogaster, C. elegans) sau a specimenelor vegetale. Alte aplicații ulterioare ale ultrasonicării sunt liza suspensiilor celulare și a peleților, precum și extracția proteinelor intracelulare.
Liza cu ultrasunete și extracția proteinelor sunt procese extrem de fiabile și reproductibile, care pot fi efectuate pe baza unor protocoale consacrate. Deoarece intensitatea procesului ultrasonic poate fi ajustată exact prin parametrii de sonicare, cum ar fi amplitudinea, modul ciclu / puls, temperatura și volumul probei, protocoalele odată validate pot fi repetate iar și iar cu același rezultat.

Fragmentarea ADN-ului și ARN-ului cu ultrasunete

După liza celulară și extracția proteinelor, o etapă frecvent necesară în pregătirea probelor este forfecarea și fragmentarea ADN-ului, ARN-ului și cromatinei, de ex. înainte de imunoprecipitarea cromatinei (ChIP). Fragmentarea ADN-ului și ARN-ului poate fi realizată în mod fiabil prin ruperea, cu ajutorul forțelor fizice, a legăturilor covalente care țin ADN-ul laolaltă. Prin forfecare fizică, cum ar fi sonicarea, mai întâi catenele de ADN sunt rupte, apoi ADN-ul este fragmentat în bucăți mai mici.
Fragmentarea ADN-ului cu ultrasunete este fiabilă și eficientă în forfecarea ADN-ului la o lungime țintă, de ex. 500bp (perechi de baze). Principalele avantaje ale fragmentării ADN-ului cu ultrasunete includ controlul precis al parametrilor și intensității procesului ultrasonic. Parametrii procesului ultrasonic pot fi ajustați prin reglarea precisă a intensității sonicării, a ciclurilor și a timpului. Acest lucru face posibilă obținerea dimensiunilor dorite ale ADN-ului, iar lungimea țintă a ADN-ului poate fi produsă, precum și reprodusă, în mod fiabil. Forfecarea ADN-ului cu ultrasunete este, de asemenea, ideală pentru obținerea fragmentelor de ADN cu greutate moleculară mare.

Protocoale pentru liza cu ultrasunete a Drosophila melanogaster

Mai jos găsiți diverse protocoale pentru liza asistată de ultrasunete, extracția proteinelor și fragmentarea ADN-ului sau a cromatinei din probe de Drosophila.

Liza cu ultrasunete pentru testul de imunoprecipitare cu legare încrucișată (CLIP)

Testul CLIP a fost efectuat conform descrierii anterioare, cu unele modificări. Aproximativ 20 mg de ovare de la femele de tip sălbatic în vârstă de 0 până la 1 zi au fost supuse legării încrucișate UV (3 × 2000 μJ/cm2), omogenizate pe gheață în 1 mL tampon RCB (50 mM HEPES pH 7,4, 200 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 mM zaharoză, 1 mM DTT, 1× Complete Protease Inhibitors fără EDTA, 1 mM PMSF) suplimentat cu 300 U RNAseOUT și menținute pe gheață timp de 30 min. Omogenatul a fost sonicat pe gheață, la 80% putere, de cinci ori în impulsuri de 20 s, cu o pauză de 60 s între ele, utilizând procesorul ultrasonic Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) și centrifugat (16.000 × g timp de 5 min la 4°C). Extractul solubil a fost precurățat cu 20 μl Protein-G dynabeads timp de 20 min la 4°C. După prelevarea probelor pentru imunoblotting și cuantificarea ARN-ului de intrare (1%), HP1 a fost imunoprecipitată cu anticorpul anti-HP1 9A9 din 450 μl de extract precurățat, prin incubare timp de 4 h cu 50 μl Protein-G dynabeads. Imunoprecipitatele au fost spălate de 4 ori cu RCB. Pentru eluarea ARN-urilor imunoprecipitate, bilele sedimentate au fost fierte în 100 μL de UltraPure DEPC-treated Water timp de 5 min. Peste supernatantul recuperat pentru prepararea ARN-ului s-au adăugat 900 μL Qiazol Reagent. ARN-ul purificat a fost utilizat ca matriță pentru sinteza ADNc folosind oligo dT, hexameri aleatori și SuperScript reverse transcriptase III, conform protocolului producătorului.
(Cassale et al. 2019)

Liza cu ultrasunete pentru testul de imunoprecipitare a cromatinei

Imunoprecipitarea cromatinei a fost efectuată conform metodei descrise de Menet, cu modificări minore. Aproximativ 20 mg de ovare de la femele de tip sălbatic în vârstă de 0 până la 1 zi au fost omogenizate în 1 mL de tampon NEB (10 mM HEPES-Na la pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,1 mM EGTA-Na la pH 8, 0,5 mM EDTA-Na la pH 8, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5 mM spermidină, 0,15 mM spermină, 1× Complete Protease Inhibitors fără EDTA) cu un omogenizator / dispersor de imersie timp de 1 min (la 3000 rpm). Omogenatul a fost transferat într-un omogenizator Dounce din sticlă prerăcit și s-au aplicat 15 curse complete cu un pistil strâns. Nucleii liberi au fost apoi centrifugați la 6000xg timp de 10 min la 4°C. Peleții care conțineau nuclei au fost resuspendați în 1 mL de NEB și centrifugați la 20.000 × g timp de 20 min pe gradient de zaharoză (0,65 mL de zaharoză 1,6 M în NEB, 0,35 mL de zaharoză 0,8 M în NEB). Peletul a fost resuspendat în 1 mL de NEB și formaldehidă până la o concentrație finală de 1%. Nucleii au fost supuși legării încrucișate timp de 10 min la temperatura camerei, iar reacția a fost oprită prin adăugarea a 1/10 vol de glicină 1,375 M. Nucleii au fost colectați prin centrifugare la 6000 × g timp de 5 min. Nucleii au fost spălați de două ori în 1 mL de NEB și resuspendați în 1 mL de tampon de liză (15 mM HEPES-Na la pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, 1 mM EDTA la pH 8, 1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 0,1% deoxicolat de Na, 0,1% SDS, 0,5% N-lauroilsarcozină și 1× Complete Protease Inhibitors fără EDTA). Nucleii au fost sonicați utilizând un procesor ultrasonic Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) de șase ori, câte 20 s în funcțiune și 1 min pe gheață. Nucleii sonicați au fost centrifugați la 13.000 × g timp de 4 min la 4°C. Cea mai mare parte a cromatinei sonicate a avut o lungime de 500 până la 1000 de perechi de baze (bp). Pentru fiecare imunoprecipitare, 15 μg de cromatină au fost incubate în prezența a 10 μg de anticorp monoclonal HP1 9A9 (3 h la 4°C pe o roată rotativă). Apoi s-au adăugat 50 μl de dynabeads protein G, iar incubarea a continuat peste noapte la 4°C. Supernatanții au fost îndepărtați, iar probele au fost spălate de două ori în tampon de liză (fiecare spălare 15 min la 4 °C) și de două ori în tampon TE (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl la pH 8). Cromatina a fost eluată de pe bile în două etape: mai întâi în 100 μl de tampon de eluție 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl la pH 8) la 65°C timp de 15 min, urmată de centrifugare și recuperarea supernatantului. Materialul de pe bile a fost reextras în 100 μl de TE + 0,67% SDS. Eluatul combinat (200 μl) a fost incubat peste noapte la 65°C pentru inversarea legăturilor încrucișate și tratat cu 50 μg/ml RNaseA timp de 15 min la 65°C și cu 500 μg/ml proteinază K timp de 3 h la 65°C. Probele au fost extrase cu fenol–cloroform și precipitate cu etanol. ADN-ul a fost resuspendat în 25 μl de apă. Pentru maximizarea analizelor moleculare cu ADN-ul imunoprecipitat, genele candidate au fost amplificate în perechi printr-un protocol optimizat de duplex-PCR, utilizând într-o singură reacție două seturi diferite de primeri cu temperaturi de topire similare.
(Casale et al. 2019)

Dezintegratoare celulare cu ultrasunete de înaltă performanță pentru probe biologice

Hielscher Ultrasonics este partenerul dumneavoastră cu experiență îndelungată atunci când vine vorba de ultrasonicatoare de înaltă performanță pentru dezintegrarea celulelor, liză, extracția proteinelor, fragmentarea ADN-ului, ARN-ului și cromatinei, precum și pentru alte etape de pregătire preanalitică a probelor. Oferind un portofoliu cuprinzător de omogenizatoare de laborator cu ultrasunete și unități de pregătire a probelor, Hielscher are dispozitivul ultrasonic ideal pentru aplicația și cerințele dumneavoastră biologice.
Ultrasonicatorul clasic cu sondă și microvârf, cum ar fi UP200St (200W; vedeți imaginea din stânga), sau una dintre unitățile de pregătire a probelor cu ultrasunete VialTweeter sau UP200ST_TD_CupHorn cu VialHolder sunt modele preferate în laboratoarele de cercetare și analiză. Sonotroda ultrasonică clasică este ideală atunci când trebuie lizate, extrase sau fragmentate mai puține probe. Unitățile de pregătire a probelor VialTweeter și UP200St_TD_CupHorn permit sonicarea simultană a până la 10, respectiv 5 flacoane.
Dacă trebuie procesat un număr mare de probe (de ex. plăci cu 96 de godeuri, plăci de microtitrare etc.), UIP400MTP este configurația de sonicare ideală. UIP400MTP funcționează ca un CupHorn mai mare, care este umplut cu apă și are suficient spațiu pentru a găzdui plăci cu microgodeuri. Alimentat de un procesor ultrasonic puternic de 400 de wați, UIP400MTP asigură o sonicare foarte uniformă și intensă a plăcilor cu godeuri multiple, pentru a dezintegra celulele, a liza probele, a solubiliza peleții, a extrage proteine sau a forfeca ADN-ul.

Control precis prin software inteligent

Toate soluțiile de sonicare Hielscher începând de la 200 de wați sunt echipate cu un ecran tactil color digital și un software inteligent. Prin protocolarea inteligentă a datelor, toți parametrii procesului ultrasonic sunt salvați automat ca fișier CSV pe un card SD încorporat imediat ce ultrasonicatorul este pornit. Acest lucru face cercetarea și protocolarea mult mai comode. După testele de sonicare sau pregătirea probelor, puteți pur și simplu să revizuiți parametrii de sonicare ai fiecărei rulări și să îi comparați.
Prin meniul intuitiv, numeroși parametri pot fi presetați înainte de sonicare: de exemplu, pentru a controla temperatura în probă și a preveni degradarea termică a acesteia, se poate seta o limită superioară a temperaturii probei. Un senzor de temperatură conectabil, livrat împreună cu unitatea ultrasonică, transmite procesorului ultrasonic informații despre temperatura reală de sonicare. Când se atinge limita superioară de temperatură, dispozitivul ultrasonic se oprește temporar până când se atinge limita inferioară a ∆T setat, apoi reîncepe automat sonicarea.
Dacă este necesară sonicarea cu un anumit aport de energie, puteți preseta energia ultrasonică finală a rulării de sonicare. Desigur, pulsația ultrasonică și modul ciclu pot fi, de asemenea, setate individual.
Pentru a reutiliza cei mai reușiți parametri de sonicare ai dumneavoastră, puteți salva diverse moduri de sonicare (de ex. timpul de sonicare, intensitatea, modul ciclu etc.) ca moduri presetate, astfel încât acestea să poată fi pornite din nou ușor și rapid.
Pentru un confort operațional sporit, toate unitățile ultrasonice digitale pot fi operate prin control de la distanță prin browser, în orice browser obișnuit (de ex., InternetExplorer, Safari, Chrome etc.). Conexiunea LAN este o configurare simplă de tip plug-n-play și nu necesită instalarea de software suplimentar.
Noi, cei de la Hielscher, știm că sonicarea reușită a probelor biologice necesită precizie și repetabilitate. Prin urmare, am proiectat ultrasonicatoarele noastre ca dispozitive inteligente, cu toate funcțiile care permit o pregătire a probelor eficientă, fiabilă, reproductibilă și comodă.

Tabelul de mai jos vă oferă o indicație privind capacitatea aproximativă de procesare a sistemelor noastre ultrasonice, de la microvârfuri ultrasonice și omogenizatoare cu ultrasunete clasice până la ultrasonicatoare MultiSample pentru pregătirea comodă și fiabilă a numeroase probe: