Liză cu ultrasunete de Drosophila melanogaster Probe

Drosophila melanogaster este utilizat pe scară largă în laboratoare ca organism model. Prin urmare, trebuie efectuate frecvent etape de pregătire preanalitică, ar fi liză, întreruperea celulelor, extracția proteinelor și forfecarea ADN-ului probelor de Drosophila melanogaster. Dismembratoare cu ultrasunete sunt fiabile și eficiente și pot fi utilizate pentru a efectua diverse sarcini, ar fi liză, extracție de proteine sau fragmentarea ADN-ului la usurinta prin ajustarea parametrilor de proces cu ultrasunete numai. Omogenizatoare cu ultrasunete sunt astfel instrumente flexibile, cu o gamă largă de aplicații.

Liză cu ultrasunete și extracția proteinelor

Liză, solubilizare celulară, omogenizare a țesuturilor și extracție de proteine sunt sarcini tipice pentru dismembratoare cu ultrasunete în laboratoarele biologice. Dismbratoarele cu ultrasunete și disruptoarele celulare sunt potrivite pentru omogenizarea țesuturilor animale, a insectelor (de exemplu, Drosophila melanogaster, C. elegans) sau a specimenelor de plante. Aplicațiile ulterioare de sonicare sunt liza suspensiilor celulare și pelete, precum și extracția proteinelor intracelulare.
Liză cu ultrasunete și extracția proteinelor sunt procese extrem de fiabile și reproductibile, care pot efectua pe baza protocoalelor stabilite. Deoarece intensitatea procesului cu ultrasunete poate fi ajustată exact prin intermediul parametrilor sonicare, ar fi amplitudinea, ciclul / modul puls, temperatura și volumul eșantionului, o dată dovedit protocoale pot fi repetate cu același rezultat de peste si peste.

ADN-ul cu ultrasunete și fragmentarea ARN

După liză celulară și extracția proteinelor, o etapă comună necesară în prepararea probei este forfecarea și fragmentarea ADN-ului, ARN-ului și cromatinei, de exemplu înainte de imunoprecipitarea cromatinei (ChIP). Fragmentarea ADN-ului și ARN-ului poate fi realizată în mod fiabil prin ruperea legăturilor covalente care țin ADN-ul împreună de forțele fizice. Folosind forfecare fizică, ar fi sonicare, la început firele de ADN sunt rupte, apoi ADN-ul este fragmentat în bucăți mai mici.
Fragmentarea ADN-ului cu ultrasunete este fiabilă și eficientă în forfecarea ADN-ului la o lungime țintită, de exemplu 500bp (perechi de bază). Avantajele majore ale fragmentării ADN-ului cu ultrasunete includ controlul precis al parametrilor procesului cu ultrasunete și intensitatea. Parametrii procesului cu ultrasunete pot fi ajustate prin reglarea intensității sonicare, cicluri și timp cu precizie. Acest lucru face posibilă crearea dimensiunilor dorite ale ADN-ului, iar lungimea ADN-ului vizat poate fi produsă în mod fiabil, precum și reprodusă. Forfecare a ADN-ului cu ultrasunete este, de asemenea, ideal pentru a crea fragmente de ADN de greutate moleculară ridicată.

Protocoale pentru liză cu ultrasunete de Drosophila melanogaster

Mai jos puteți găsi diferite protocoale pentru liza ultrasonically-asistată, extracția proteinelor, și fragmentarea ADN-ului sau cromatinei de probe Drosophila.

Liza cu ultrasunete pentru eco-legarea Imunoprecipitation (CLIP) Test

Testul CLIP a fost efectuat așa s-a raportat anterior cu unele modificări. Aproximativ 20 mg ovare de la femele de tip sălbatic de 0 până la 1 zi au fost legate cu RAZE UV încrucișate (3 × 2000 μJ/cm2), omogenizate pe gheață în tampon RCB 1 mL (50 mM HEPES pH 7.4, 200 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 mM zaharoză, 1 mM DTT, 1× Inhibitori completi de protează fără EDTA, 1 mM PMSF) completat cu 300 U RNAseOUT și plasat pe gheață timp de 30 min. Omogenatul a fost sonicat pe gheață, la 80% putere, de cinci ori în 20 s explozii cu o odihnă de 60 s între utilizarea procesorului cu ultrasunete Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) și centrifugate (16000 × g timp de 5 min la 4°C). Extractul solubil a fost preînvățat cu 20 μl de proteine-G dynabeads timp de 20 min la 4°C. După îndepărtarea probelor pentru imunoblotting și cuantificarea intrării de ARN (1%), HP1 a fost imunoprecipitat cu anticorpi anti-HP1 9A9 din extract preclearizat de 450 μl prin incubație timp de 4 ore cu dynabeade proteină-G de 50 μl. Imunoprecipitațiile au fost spălate de 4 ori cu RCB. Pentru a eluda ARN-urile imunoprecipitate, mărgelele pelete au fost fierte în 100 μL de apă tratată cu UltraPure DEPC timp de 5 min. 900 μL Reactiv Qiazol a fost adăugat la supernatantul recuperat pentru prepararea ARN. ARN purificat a fost folosit ca un șablon pentru a sintetiza cDNA folosind oligo dT, hexamers aleatoare și SuperScript reverse transcriptase III în conformitate cu protocolul producătorului.
(Cassale et al. 2019)

Liză cu ultrasunete pentru testul de imunoprecipitare cromatină

Imunoprecipitarea cromatinei a fost efectuată conform metodei descrise de Menet cu modificări minore. Aproximativ 20 mg ovare de la femele de tip sălbatic de la 0 la 1 zi au fost omogenizate în 1 ml de tampon NEB (10 mM HEPES-Na la pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,1 mM EGTA-Na la pH 8, 0,5 mM EDTA-Na la pH 8, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5 mM Spermidină, 0,15 mM Spermină, 1× Inhibitori de protează completă fără EDTA) cu un omogenizator / dispersor de imersiune 1 min (la 3000 rpm). Omogenatul a fost transferat într-un dunce de sticlă pre-refrigerat și 15 lovituri complete au fost aplicate cu un pistil strâns. Nucleele libere au fost apoi centrifugate la 6000xg timp de 10 min la 4°C. Peletele care conțin nuclee au fost resuspendate în 1 mL de NEB și centrifugate la 20000 × g timp de 20 min pe gradientul de zaharoză (0,65 ml de 1,6 M zaharoză în NEB, 0,35 ml de 0,8 M zaharoză în NEB). Peletul a fost resuspendat în 1 ml de NEB și formaldehidă la o concentrație finală de 1%. Nucleele au fost încrucișate timp de 10 min la temperatura camerei și stinse prin adăugarea a 1/10 vol de 1,375 M glicină. Nucleele au fost colectate prin centrifugare la 6000 × g timp de 5 min. Nucleele au fost spălate de două ori în 1 mL de NEB și resuspendate în 1 ml de tampon de liză (15 mM HEPES-Na la pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, 1 mM EDTA la pH 8, 1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 0,1% Na Deoxicholat, 0,1% SDS, 0,5% N-lauroylsarcosine și 1× inhibitori completi ai proteazei fără EDTA). Nucleele au fost sonicate folosind un procesor cu ultrasunete Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) de șase ori pentru 20 s pe și 1 min pe gheață. Nucleele sonicate au fost centrifugate la 13000 × g timp de 4 min la 4°C. Majoritatea cromatinei sonicate a fost de 500 până la 1000 de perechi de bază (bp) în lungime. Pentru fiecare imunoprecipitare, 15 μg de cromatină a fost incubată în prezența a 10 μg de anticorpi monoclonali HP1 9A9 (3 h la 4°C într-o roată rotativă). Apoi, s-au adăugat 50 μl de proteină G din dynabeads, iar incubația a continuat peste noapte la 4°C. Supernatanții au fost aruncați și probele au fost spălate de două ori în tampon de liză (fiecare spălare 15 min la 4 °C) și de două ori în tampon TE (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl la pH 8). Cromatina a fost elutată din mărgele în două etape; prima în 100 μl de tampon eluition 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl la pH 8) la 65°C timp de 15 min, urmată de centrifugarea și recuperarea supernatantului. Materialul margelelor a fost extras din 100 μl de TE + 0,67% SDS. Eluatul combinat (200 μl) a fost incubat peste noapte la 65°C pentru a inversa legăturile încrucișate și tratat cu 50 μg/ml RNaseA timp de 15 min la 65°C și cu 500 μg/ml Proteinază K timp de 3 ore la 65°C. Probele au fost extrase fenol-cloroform și etanol precipitat. ADN-ul a fost resuspendat în 25 μl de apă. Pentru maximizarea analizelor moleculare cu ADN imunoprecipitat, genele candidate au fost amplificate în perechi printr-un protocol duplex-PCR optimizat prin utilizarea a două seturi diferite de grunduri cu temperaturi de topire similare într-o singură reacție.
(Casale et al. 2019)

Disruptoare de celule ultrasonice de înaltă performanță pentru probe biologice

Hielscher Ultrasonics este partenerul tau cu experienta de mult timp atunci când vine vorba de ultrasonicators de înaltă performanță pentru întreruperea celulelor, liză, extracție de proteine, ADN- ul, ARN, și fragmentarea cromatinei, precum și alte măsuri de pregătire a probei pre-analitice. Oferind un portofoliu cuprinzător de omogenizatoare de laborator cu ultrasunete și unități de pregătire a probelor, Hielscher are dispozitivul cu ultrasunete ideal pentru aplicarea și cerințele biologice.
Clasic sonda de tip ultrasonicator cu micro-vârf, ar fi UP200St (200W; a se vedea imaginea din stânga) sau una dintre unitățile de preparare a probelor cu ultrasunete VialTweeter sau UP200ST_TD_CupHorn cu VialHolder sunt modele preferate în laboratoarele de cercetare și analiză. Sonda cu ultrasunete clasic este ideal, atunci când se pregătesc mai puține probe trebuie să fie lizat, extrase sau fragmentate. Unitățile de preparare a probelor VialTweeter și UP200St_TD_CupHorn permit sonicarea simultană a până la 10 sau, respectiv, 5 flacoane.
În cazul în care se prelucrează un număr mare de eșantioane (de exemplu, plăci cu 96 de sonde, plăci de microtitr etc.), UIP400MTP este setup sonicare ideal. UIP400MTP funcționează ca un cuphorn mai mare, care este umplut cu apă și are suficient spațiu pentru a deține plăci micro-bine. Alimentat de un procesor cu ultrasunete 400 wați puternic, UIP400MTP oferă o sonicare foarte uniformă și intensă a plăcilor multi-bine, în scopul de a perturba celulele, probe de lyse, pelete solubiliza, proteine extract sau ADN forfecare.

Control precis prin software inteligent

Toate soluțiile de sonicare Hielscher de la 200 wați în sus sunt echipate cu un ecran tactil color digital și un software inteligent. Prin intermediul datelor inteligente protocolare toți parametrii de proces cu ultrasunete sunt salvate automat ca fișier CSV pe un sd-card încorporat de îndată ce ultrasonicator este pornit. Acest lucru face de cercetare și protocolare atât de mult mai convenabil. După studiile sonicare sau pregătirea probei, puteți revizui pur și simplu parametrii sonicare ai fiecărui a alerga sonicare și să le compare.
Prin intermediul meniului intuitiv, numeroase parametri pot fi presetate înainte de sonicare: De exemplu, pentru a controla temperatura din eșantion și pentru a preveni degradarea termică a acestuia, se poate seta o limită superioară a temperaturii eșantionului. Un senzor de temperatură pluggable, care vine cu unitatea cu ultrasunete, oferă feedback-ul procesorului cu ultrasunete cu privire la temperatura reală sonicare. Când se atinge limita superioară de temperatură, dispozitivul cu ultrasunete se oprește până când limita inferioară a setului ∆T este atinsă și începe apoi sonicarea automată din nou.
În cazul în care sonicare cu o intrare de energie specifice este necesară, puteți preseta energia finală cu ultrasunete a alerga sonicare. Desigur, pulsația cu ultrasunete și modul ciclu poate fi setat individual, de asemenea.
Pentru a reutilia parametrii de sonicare cei mai de succes, puteți salva diferite moduri de sonicare (de exemplu, timpul de sonicare, intensitatea, modul de ciclu etc.) ca moduri de pre-setare, astfel încât acestea să poată fi ușor și rapid pornit din nou.
Pentru mai mult confort operațional, toate unitățile cu ultrasunete digitale pot fi operate prin intermediul telecomenzii browserului în orice browser comun (de exemplu, InternetExplorer, Safari, Chrome etc.). Conexiunea LAN este o configurare simplă plug-n-play și nu necesită instalare suplimentară de software.
Noi, cei de la Hielscher, știm că sonicarea cu succes a probelor biologice necesită precizie și repetabilitate. Prin urmare, am proiectat ultrasonicators noastre ca dispozitive inteligente, cu toate caracteristicile care permit un preparat eficient, fiabil, reproductibil și convenabil eșantion.

Tabelul de mai jos vă oferă o indicație a capacității aproximative de procesare a sistemelor noastre cu ultrasunete de la micro-sfaturi cu ultrasunete și omogenizatoare cu ultrasunete clasice la ultrasonicators multisample pentru pregătirea convenabilă, fiabilă a numeroase probe: