Liza cu ultrasunete a probelor Drosophila Melanogaster

Drosophila melanogaster este utilizat pe scară largă în laboratoare ca organism model. Prin urmare, trebuie efectuate frecvent etape de pregătire preanalitică, cum ar fi liza, întreruperea celulelor, extracția proteinelor și forfecarea ADN-ului probelor de Drosophila melanogaster. Dezmembratoarele cu ultrasunete sunt fiabile și eficiente și pot fi utilizate pentru a efectua diverse sarcini, ar fi liza, extracția proteinelor sau fragmentarea ADN-ului la ușurință prin ajustarea parametrilor procesului cu ultrasunete. Omogenizatoare cu ultrasunete sunt astfel instrumente flexibile cu o gamă largă de aplicații.

Liza cu ultrasunete și extracția proteinelor

Liza, solubilizarea celulelor, omogenizarea țesuturilor și extracția proteinelor sunt sarcini tipice pentru dezmembratorii cu ultrasunete în laboratoarele biologice. Dezmembratoarele cu ultrasunete și perturbatorii celulari sunt foarte potrivite pentru omogenizarea țesuturilor animale, insecte (de exemplu, Drosophila melanogaster, C. elegans) sau specimene de plante. Aplicațiile ulterioare ale ultrasonication sunt liza suspensiilor celulare și pelete, precum și extracția proteinelor intracelulare.
Liza cu ultrasunete și extracția proteinelor sunt procese extrem de fiabile și reproductibile, care pot fi efectuate pe baza protocoalelor stabilite. Deoarece intensitatea procesului cu ultrasunete poate fi ajustată exact prin intermediul parametrilor sonicare, ar fi amplitudinea, modul ciclu / puls, temperatura și volumul eșantionului, protocoalele odată dovedite pot fi repetate cu același rezultat din nou și din nou.

Fragmentarea ADN-ului și ARN-ului cu ultrasunete

După liza celulară și extracția proteinelor, o etapă comună necesară în pregătirea probei este forfecarea și fragmentarea ADN-ului, ARN-ului și cromatinei, de exemplu înainte de imunoprecipitarea cromatinei (ChIP). Fragmentarea ADN-ului și ARN poate fi realizată în mod fiabil prin ruperea legăturilor covalente care țin ADN-ul împreună de forțele fizice. Folosind forfecare fizică, cum ar fi sonicare, la început catenele ADN sunt rupte, apoi ADN-ul este fragmentat în bucăți mai mici.
Fragmentarea ADN-ului cu ultrasunete este fiabilă și eficientă în forfecarea ADN-ului la o lungime vizată, de exemplu 500bp (perechi de baze). Avantajele majore ale fragmentării ADN-ului cu ultrasunete includ controlul precis al parametrilor procesului cu ultrasunete și intensitatea. Parametrii procesului cu ultrasunete pot fi ajustate prin reglarea intensității sonicare, cicluri și timp precis. Acest lucru face posibilă crearea dimensiunilor dorite ale ADN-ului, iar lungimea ADN-ului vizată poate fi produsă și reprodusă în mod fiabil. Forfecarea ADN-ului cu ultrasunete este, de asemenea, ideală pentru a crea fragmente de ADN cu greutate moleculară mare.

Protocoale pentru liza cu ultrasunete a Drosophila melanogaster

Mai jos puteți găsi diferite protocoale pentru liza asistată ultrasonically, extracția proteinelor și fragmentarea ADN-ului sau cromatinei probelor Drosophila.

Liza cu ultrasunete pentru testul de imunoprecipitare reticulară (CLIP)

Testul CLIP a fost efectuat așa cum s-a raportat anterior, cu unele modificări. Aproximativ 20 mg ovare de la femele de tip sălbatic în vârstă de 0 până la 1 zi au fost reticulate UV (3 × 2000 μJ / cm2), omogenizate pe gheață în tampon RCB de 1 ml (50 mM HEPES pH 7,4, 200 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 mM zaharoză, 1 mM DTT, 1× inhibitori compleți de protează fără EDTA, 1 mM PMSF) suplimentați cu 300 U RNAseOUT și plasați pe gheață timp de 30 min. Omogenatul a fost sonicated pe gheață, la 80% putere, de cinci ori în 20 s explozii cu o odihnă 60 s între folosind procesorul cu ultrasunete Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) și centrifugate (16000 × g timp de 5 minute la 4 °C). Extractul solubil a fost preeliminat cu 20 μl de dinabele de proteină-G timp de 20 de minute la 4°C. După prelevarea probelor pentru imunoblotting și cuantificarea aportului de ARN (1%), HP1 a fost imunoprecipitat cu anticorp anti-HP1 9A9 din 450 μl extract preclar prin incubare timp de 4 ore cu 50 μl Protein-G dinabelate. Imunoprecipitatele au fost spălate de 4 ori cu RCB. Pentru a elua ARN-urile imunoprecipitate, granulele granulate au fost fierte în 100 μL de apă tratată cu DEPC ultrapură timp de 5 minute. 900 μL reactiv qiazol a fost adăugat la supernatantul recuperat pentru prepararea ARN. ARN-ul purificat a fost folosit ca șablon pentru a sintetiza ADNc folosind oligo dT, hexameri aleatorii și SuperScript revers transcriptază III conform protocolului producătorului.
(Cassale și colab. 2019)

Liza cu ultrasunete pentru testul de imunoprecipitare a cromatinei

Imunoprecipitarea cromatinei a fost efectuată conform metodei descrise de Menet, cu modificări minore. Aproximativ 20 mg ovare de la femele de tip sălbatic în vârstă de 0 până la 1 zi au fost omogenizate în 1 ml de tampon NEB (10 mM HEPES-Na la pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,1 mM EGTA-Na la pH 8, 0,5 mM EDTA-Na la pH 8, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5 mM Spermidină, 0,15 mM Spermină, 1× inhibitori compleți de protează fără EDTA) cu un omogenizator / dispersor de imersie 1 min (la 3000 rpm). Omogenatul a fost transferat într-o sticlă pre-răcită și au fost aplicate 15 lovituri complete cu un pistil strâns. Nucleele libere au fost apoi centrifugate la 6000xg timp de 10 minute la 4°C. Granulele care conțin nuclee au fost resuspendate în 1 ml de NEB și centrifugate la 20000 × g timp de 20 min pe gradient de zaharoză (0,65 ml de zaharoză 1,6 M în NEB, 0,35 ml de zaharoză 0,8 M în NEB). Peleta a fost resuspendată în 1 ml de NEB și formaldehidă până la o concentrație finală de 1%. Nucleii au fost reticulați timp de 10 minute la temperatura camerei și stinși prin adăugarea a 1/10 vol de glicină 1.375 M. Nucleele au fost colectate prin centrifugare la 6000 × g timp de 5 minute. Nucleii au fost spălați de două ori în 1 ml de NEB și resuspendați în 1 ml de tampon de liză (15 mM HEPES-Na la pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, 1 mM EDTA la pH 8, 1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 0,1% Na deoxicolat, 0,1% SDS, 0,5% N-lauroylsarcosine și 1× inhibitori compleți de protează fără EDTA). Nucleele au fost sonicated folosind un procesor cu ultrasunete Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) de șase ori timp de 20 s pe gheață și 1 min pe gheață. Nucleele sonicate au fost centrifugate la 13000 × g timp de 4 minute la 4 ° C. Majoritatea cromatinei sonicate a fost de 500 până la 1000 perechi de baze (bp) în lungime. Pentru fiecare imunoprecipitare, s-au incubat 15 μg cromatină în prezența a 10 μg anticorp monoclonal HP1 9A9 (3 ore la 4°C într-o roată rotativă). Apoi, s-au adăugat 50 μl de proteină G din dinabe, iar incubarea a fost continuată peste noapte la 4°C. Supernatanții au fost aruncați și probele au fost spălate de două ori în tampon de liză (fiecare spălare 15 min la 4 °C) și de două ori în tampon TE (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl la pH 8). Cromatina a fost eluată din mărgele în două etape; prima în 100 μl de tampon de elită 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl la pH 8) la 65 °C timp de 15 minute, urmată de centrifugarea și recuperarea supernatantului. Materialul de mărgele a fost reextras în 100 μl de TE + 0,67% FDS. Eluatul combinat (200 μl) a fost incubat peste noapte la 65°C pentru a inversa legăturile încrucișate și tratat cu 50 μg/ml RNaseA timp de 15 minute la 65°C și cu 500 μg/ml proteinază K timp de 3 ore la 65°C. Probele au fost extrase fenol-cloroform și etanol precipitat. ADN-ul a fost resuspendat în 25 μl de apă. Pentru maximizarea analizelor moleculare cu ADN imunoprecipitat, genele candidate au fost amplificate în perechi printr-un protocol duplex-PCR optimizat prin utilizarea a două seturi diferite de primeri cu temperaturi de topire similare într-o singură reacție.
(Casale și colab. 2019)
 

Perturbatoare de celule cu ultrasunete de înaltă performanță pentru probe biologice

Hielscher Ultrasonics este partenerul tău cu experiență îndelungată atunci când vine vorba de ultrasonicators de înaltă performanță pentru întreruperea celulelor, liză, extracție de proteine, ADN, ARN și fragmentarea cromatinei, precum și alte etape pre-analitice de pregătire a probelor. Oferind un portofoliu cuprinzător de omogenizatoare de laborator cu ultrasunete și unități de pregătire a probelor, Hielscher are dispozitivul cu ultrasunete ideal pentru aplicația biologică și cerințele.
Ultrasonicator clasic de tip sondă cu micro-tip, ar fi UP200St (200W; vezi imaginea din stânga) sau una dintre unitățile de pregătire a probei cu ultrasunete VialTweeter sau UP200ST_TD_CupHorn cu VialHolder sunt modele preferate în laboratoarele de cercetare și analitice. Sonda clasică cu ultrasunete este ideală, atunci când pregătiți mai puține probe trebuie lizate, extrase sau fragmentate. Unitățile de preparare a probei VialTweeter și UP200St_TD_CupHorn permit sonicarea simultană a până la 10 sau 5 flacoane, respectiv.
În cazul în care trebuie prelucrat un număr mare de eșantioane (de exemplu, plăci cu 96 de godeuri, plăci de microtitrare etc.), UIP400MTP este configurarea ideală sonicare. UIP400MTP funcționează ca un cuphorn mai mare, care este umplut cu apă și are suficient spațiu pentru a ține plăcile micro-godeurilor. Alimentat de un procesor cu ultrasunete puternic de 400 wați, UIP400MTP oferă o sonicare foarte uniformă și intensă a plăcilor multi-puț pentru a perturba celulele, probele de liză, solubiliza peletele, extrage proteine sau ADN-ul de forfecare.

Control precis prin Smart Software

Toate soluțiile de sonicare Hielscher de la 200 wați în sus sunt echipate cu un ecran tactil color digital și un software inteligent. Prin intermediul protocolului inteligent de date, toți parametrii procesului cu ultrasunete sunt salvați automat ca fișier CSV pe un card SD încorporat imediat ce ultrasonicator este pornit. Acest lucru face ca cercetarea și protocolul să fie mult mai convenabile. După încercările sonicare sau pregătirea probei, puteți revizui pur și simplu parametrii sonicare ale fiecărei rulări sonicare și le puteți compara.
Prin intermediul meniului intuitiv, numeroși parametri pot fi presetați înainte de sonicare: De exemplu, pentru a controla temperatura în probă și pentru a preveni degradarea termică, poate fi setată o limită superioară a temperaturii probei. Un senzor de temperatură conectabil, care vine cu unitatea cu ultrasunete, oferă feedback-ul procesorului cu ultrasunete cu privire la temperatura reală sonicare. Când se atinge limita superioară de temperatură, dispozitivul cu ultrasunete se întrerupe până când se atinge limita inferioară a setului ∆T și începe apoi sonicare automată din nou.
Dacă sonicare cu o intrare specifică de energie este necesară, puteți preseta energia ultrasonică finală a rula sonicare. Desigur, pulsația cu ultrasunete și modul ciclu pot fi setate individual, de asemenea.
Pentru a reutiliza parametrii sonicare cele mai de succes, puteți salva diferite moduri sonicare (de exemplu, timp sonicare, intensitate, modul ciclu etc.) ca moduri prestabilite, astfel încât acestea să poată fi ușor și rapid pornit din nou.
Pentru mai mult confort operațional, toate unitățile digitale cu ultrasunete pot fi operate prin telecomanda browserului în orice browser comun (de exemplu, InternetExplorer, Safari, Chrome etc.). Conexiunea LAN este o configurare simplă plug-n-play și nu necesită instalare software suplimentară.
Noi, la Hielscher, știm că sonicarea cu succes a probelor biologice necesită precizie și repetabilitate. Prin urmare, am proiectat ultrasonicators noastre ca dispozitive inteligente cu toate caracteristicile care permit o pregătire eficientă, fiabilă, reproductibilă și convenabilă a probei.

Tabelul de mai jos vă oferă o indicație a capacității aproximative de procesare a sistemelor noastre cu ultrasunete de la micro-sfaturi cu ultrasunete și omogenizatoare clasice cu ultrasunete la ultrasonicators MultiSample pentru pregătirea convenabilă și fiabilă a numeroaselor probe: