Pregătirea cu ultrasunete a probelor C. elegans

C. elegans, un vierme nematod, este un organism model utilizat pe scară largă în biologie. Pregătirea probei înainte de analiză necesită liză, extracție de proteine și lipide, precum și fragmentarea ARN, care poate fi efectuată în mod fiabil prin sonicare. Perturbatorii de celule cu ultrasunete sunt dispozitive fiabile, sofisticate și ușor de utilizat pentru pregătirea rapidă a probelor de C. elegans.

Pregătirea cu ultrasunete a probelor C. elegans

C. elegans sunt viermi rotunzi, care sunt utilizați pe scară largă în laboratoarele de cercetare pentru a investiga genomica, biologia dezvoltării și bolile. Multe gene din genomul C. elegans au omologi funcționali la om. Astfel, viermele nematod este un model extrem de util pentru bolile umane. Alte avantaje pentru utilizarea pe scară largă a C. elegans sunt cultivarea ușoară și ieftină pe plăci care conțin bacterii (de exemplu, E. coli), transparența, manipularea convenabilă, precum și posibilitatea de a îngheța și depozita viermii pentru o perioadă mai lungă.
Analiza proteinelor și a lipidelor sunt proceduri regulate în laboratoare și pregătirea probei cu ultrasunete este metoda stabilită pentru a liza nematodele C. elegans în fiecare etapă de dezvoltare (adică embrioni, larve L1-L4, adulți). Deoarece C. elegans este, de asemenea, utilizat ca sistem de expresie a proteinelor pentru a supra-exprima proteinele vizate, este necesară o liză fiabilă, reproductibilă și o metodă de extracție a proteinelor, care oferă randamente ridicate de proteine. Sistemele de întrerupere și extracție a celulelor cu ultrasunete sunt disponibile ca omogenizatoare de tip sondă și ca ultrasonicators multi-probă. Catering pentru pregătirea convenabilă a probei și tot felul de numere de dimensiuni de probă, Hielscher Ultrasonics are disruptor de celule cu ultrasunete ideal pentru procedura de laborator.

Protocoale cu ultrasunete pentru C. elegans perturbare și liză

Omogenizarea cu ultrasunete și liza C. elegans și extracția ulterioară a proteinelor și lipidelor pot fi efectuate folosind diferite proceduri folosind diferite tampoane de omogenizare și liză etc. Toate protocoalele de liză au în comun faptul că probele trebuie păstrate continuu pe gheață pentru a preveni degradarea proteinelor. Mai jos, vă prezentăm câteva lize cu ultrasunete fiabile și rapide și protocoale de extracție pentru prepararea probelor de C. elegans care conțin proteine sau lipide de înaltă calitate.

Avantajele ultrasunetelor C. elegans Liza

• Fiabil
• Reproductibile
• cu precizie la temperatură controlată
• Control fiabil al procesului
• Metoda blândă
• ușor de aplicat
• Seif

Extracția proteinelor cu ultrasunete din probele de C. elegans

Liza cu ultrasunete și extracția proteinelor de viermi C. elegans pot fi efectuate folosind diferite protocoale. Mai jos vă prezentăm câteva protocoale de liză fiabile și rapide pentru rezultate reproductibile de extracție a proteinelor.

Pregătirea rapidă a extractului citosolic din viermi C. elegans prin sonicare

Cu următorul protocol puteți prepara C. elegans lizate în mai puțin de 30 de minute.
Colecția de C. elegans
Alegeți viermii C. elegans doriți într-o soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) de 1,5 ml sau spălați-i de pe o placă cu PBS de 1,5 ml. Centrifugați la 1min la 2000rpm pentru a peleți. Păstrați eșantioanele în permanență pe gheață.
Apoi, spălați viermii de două ori cu PBS.
După aceea, spălați viermii de două ori cu ddH₂O.
Resuspensia viermilor în cel puțin 500ul de tampon de omogenizare (HB). Probele de vierme sunt acum pregătite pentru liza cu ultrasunete.
Pentru o calitate mai mare a extractului de proteine, poate doriți să reduceți contaminarea bacteriană prin spălarea viermilor timp de 5 minute fiecare în PBS și apă sterilă, ultra-pură (ddH₂O) sau efectuați plutirea zaharozei. Păstrați probele de vierme continuu pe gheață.

Protocolul de liză C. elegans cu ultrasunete

• Asigurați-vă că pregătiți ultrasonicator în avans, astfel încât omogenizatorul cu ultrasunete este gata de utilizare (sondă montat, program sonicare pre-setat).

În cazul în care ultrasonicator este montat în stand-mounted, plasați baia de gheață cu tuburile de probă sub sonda cu ultrasunete și introduceți sonda cu ultrasunete în tub 1.5ml.

• Pentru C. elegans liza cu UP200St sau UP200Ht, ultrasonication ar trebui să fie efectuate folosind un microtip (de exemplu, 2mm sondă S26d2; a se vedea imaginea din stânga) la 40% amplitudine pentru 1sec cu pauze 30sec între ele. 5 cicluri sonicare pentru fiecare 1 secundă cu pauze 30sec sunt ideale pentru C. elegans liza. Dacă efectuați liza pentru prima dată, puteți verifica progresia lizei în mici părți alicote ale probei după fiecare impuls folosind un microscop.
• Liza este finalizată cu succes atunci când viermii sunt perturbați. Over-sonicare duce la ruperea nucleelor și devine vizibilă atunci când proba devine vâscoasă sau spume. Pentru a preveni degradarea probei, utilizați mai multe impulsuri dacă este necesar. Nu creșteți timpul fiecărui ciclu de impulsuri cu ultrasunete pentru a obține extracte de proteine de înaltă calitate.
• Lizat celular clar prin centrifugarea viermilor ultrasonically lizate la 14,000rpm pentru 10min la 4 ° C.
• Apoi se transferă supernatantul într-un tub nou și se pregătește pentru imunoprecipitare sau alte teste.

Notă pentru tamponul de omogenizare: Pregătiți tamponul de omogenizare pentru protocolul de liză cu ultrasunete de mai sus, după cum urmează:

Liza cu randament ridicat a C. elegans în plăci cu 96 de puțuri folosind UIP400MTP Plate Sonicator

C. elegans Liza (nematode adulte)
UIP400MTP 80% amplitudine, 20 cicluri (fiecare ciclu sonicare: 30 sec ON, 30 sec OFF)
Tampon de liză:

• Opțiunea 1) 4% SDS, 0,1 M Tris/HCl pH 8,0, 1 mM EDTA
• Opțiunea 2) pentru co-imunoprecipitare (co-IP): 10 mM Tris HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,5% NP-40 (cocktail complet inhibitor de proteinază)

Fragmentare ADN cu randament ridicat
C. elegans (nematode adulte) ADN 200-300bp: UIP400MTP placă sonicator – set 80% amplitudine, 30impulsuri – fiecare 30sec pornit, 30sec oprit

UIP400MTP Plate Sonicator pentru prepararea probei de mare capacitate sonicates uniform probele în multi-puț, plăci de microtitrare și 96-puțuri plăci

Liza cu ultrasunete a C. elegans pentru teste cantitative de purificare afinitate

Embrionii de C. elegans (∼2 milioane pe replică) au fost proaspăt recoltați în triplu biologic prin albirea hermafrodiților gravizi tineri și sonicat pe gheață (ciclu: 0,5 s, amplitudine: 40-45%, 5 lovituri / sesiune, 5 sesiuni, interval între sesiuni: 30 s; UP200S procesor cu ultrasunete cu micro-tip S26d2 (Hielscher Ultrasonics GmbH)) în tampon de liză (volum total: ∼600 μl; 50 mm Tris-HCl, pH 7.4, 100 mm KCl, 1 mm MgCl2, 1 mm EGTA, 1 mm DTT, 10% glicerol, amestec inhibitor de protează, 0.1% Nonidet P-40 înlocuitor). După sonicare, Nonidet P-40 înlocuitor a fost adăugat până la 1% și lizații au fost incubați cu rotația capului peste coadă la 4 ° C timp de 30 min, urmată de centrifugare la 20.000 × g timp de 20 min la 4 ° C. Lizatul curățat a fost apoi aspirat fără a perturba stratul lipidic superior și împărțit la jumătate fie în margele de agaroză anti-GFP, fie în mărgele de control blocate (40-50 μl). După rotirea capului peste coadă la 4°C timp de 60–90 min, taloanele au fost spălate o dată cu tampon de liză care conținea 0,1% Nonidet P-40 Substitute, urmată de două spălări în oricare tampon I (25 mm Tris-HCl, pH 7,4, 300 mm NaCl, 1 mm MgCl2) sau tampon II (1 mm Tris-HCl, pH 7,4, 150 mm NaCl, 1 mm MgCl2) sau ambele. Pentru tragerile GFP: MBK-2, au fost efectuate două experimente separate folosind condiții diferite de spălare. Proteinele au fost eluate prin agitare orbitală în 50 μl de uree 6 m/tiouree 2 M la temperatura camerei. Pentru experimentele MBK-1::GFP, proteinele au fost eluate de două ori prin agitare în 50μl de clorură de guanidiniu 8 m la 90 °C, urmată de precipitarea etanolului. Probele de proteine eluate au fost apoi digerate în soluție.
(cf. Chen și colab., 2016)

Omogenizarea viermilor cu ultrasunete și liza

Pentru liza C. elegans și procedura de extracție a proteinelor, au fost colectate 30.000 de nemotode din etapa relevantă per probă și spălate în S-bazal rece ca gheața, concentrate prin centrifugare la 1500 rpm timp de 2 minute, spălate de șase ori cu S-bazal rece ca gheața pentru a îndepărta bacteriile reziduale și apoi depozitate pe gheață până când sunt gata de utilizare. Pentru extracția proteinelor, viermilor gravid-adulți li s-a permis să formeze o peletă compactă după ultima spălare bazală S. Peletele de vierme au fost apoi resuspendate în 1 ml de tampon de extracție rece ca gheața [20 mM fosfat de potasiu, pH 7,4, 2mM EDTA, 1% Triton-X-100, inhibitori de protează (Sigma P2714)] și procesate imediat.
∼30.000 viermi gravid-adult (corespunzând la ∼100 mg greutate umedă), au fost sonicated pe gheață folosind un ultrasonicator de tip sondă (de exemplu, UP50H cu microtip MS2) la amplitudine 40% pentru 10 cicluri de 3 sec pe, 30 sec off, în 1 ml de tampon de extracție rece ca gheața. (cf. Baskharan et al. 2012)

Extracția lipidelor cu ultrasunete de la C. elegans

În lipidomică, o ramură a metabolomicii, complementul lipidic al sistemelor biologice este caracterizat și analizat. C. elegans sunt utilizate pe scară largă în lipidomică pentru a investiga interacțiunea lipidelor metabolice și efectele lor asupra sănătății și duratei de viață.
Liza cu ultrasunete și extracția este utilizat pentru a elibera lipide, ar fi sfingolipide din embrioni C. elegans, larve, și viermi adulți. Ultrasonication este utilizat pentru a pregăti omogenate vierme și, ulterior, pentru a extrage lipidele din probă.
Protocol pentru extracția lipidelor cu ultrasunete de la C. elegans
Se dezgheață granula de C. elegans pe gheață și se omogenizează cu 0,5 ml ultraapă. 
Sonicate probele C. elegans în eprubete de 1,5 ml, păstrând în același timp probele continuu pe gheață.
Sonicare poate fi efectuată folosind o sondă-ultrasonicstor, cum ar fi UP200Ht, unitatea de pregătire a probei cu ultrasunete VialTweeter (sonicare simultană de 10 probe) sau UIP400MTP (pentru sonicarea plăcilor cu mai multe godeuri, cum ar fi plăcile cu 96 de godeuri). Pentru liza cu ultrasunete cu UP200Ht utilizați micro-vârful S26d2. Presetați modul ciclu ultrasonic din meniul digital. Setați amplitudinea la 10% și modul ciclului sonicare de impulsuri de 2 sec de 20 de cicluri cu o pauză de 30 sec. între fiecare explozie de pulsație cu ultrasunete.
Se transferă supernatanții în tuburi de sticlă cu capac filetat. 
Se efectuează extracția Folch prin adăugarea a 1 ml ultrawater în fiecare tub de sticlă, urmată de adăugarea a 6 ml de amestec cloroform/metanol (raport = 2:1) în fiecare tub de sticlă.
Se vortexează fiecare tub de sticlă timp de 30 sec timp de 4 ori. 
Centrifugați tuburile la 1.258 x g timp de 15 minute (Eppendorf, 5810 R) pentru a îmbunătăți și mai mult separarea fazelor. 
Transferați fracția hidrofobă inferioară într-un tub de sticlă curat printr-o pipetă Pasteur de sticlă. 
Se usucă fracțiunea hidrofobă inferioară sub debit de azot într-un evaporator de azot. 
Depozitați granula uscată într-un congelator la -80 °C până la utilizare.

Pregătirea cu ultrasunete a lizaților de vierme

Lizat de viermi: viermii în stadiul L4 au fost recoltați și spălați de trei ori cu tampon M9 (42,26 mM Na₂HPO₄, 22.04 mM KH₂PO₄, 85,56 mM NaCl și 0,87 mM MgSO₄) pentru a elimina toate bacteriile. După îndepărtarea cât mai mult posibil a tamponului M9, viermii au fost resuspendați în tampon de liză: 50 mM HEPES, 50 mM KCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 5 mM fosfat β-glicerol, 0,1% (v/v) Triton X-100, 50 mM fluorură de sodiu, 1 mM ortovanadat de sodiu, 5 mM pirofosfat de sodiu, 0,2 mM fenilmetansulfonilfluorură și inhibitor de protează. Viermii au fost înghețați în azot lichid și dezghețați la 37 ° C de trei ori, apoi viermii au fost sonicated pe gheață carbonică cu o unitate VialTweeter cu ultrasunete pentru prepararea simultană a 10 tuburi de probă. Sonicare a fost efectuată la 50% amplitudine în 10 cicluri de 2 sec. cu 30 sec pauză între exploziile sonicare. Ulterior, eșantioanele au fost centrifugate la 12000 rpm la 4 ° C timp de 15 minute. Supernatantul a fost colectat și păstrat la -70°C. O parte alicotă a fost utilizată pentru cuantificarea proteinelor prin testul Bradford.
Determinarea glutationului total, GSH și GSSG: Pentru cuantificarea glutationului, lizații și determinarea au fost efectuate în aceeași zi. Larvele L4 hrănite cu glucoză și de control au fost recoltate și spălate cu tampon M9 de trei ori. După îndepărtarea cât mai mult posibil de tampon M9, viermii au fost resuspensia în acid metafosforic rece ca gheața (5% w / v), apoi viermii au fost sonicated în gheață cu un VialTweeter cu ultrasunete la 50% amplitudine în zece cicluri de sonicare de 2 sec. cu 30 sec. pauză între fiecare ciclu. După aceea, centrifugat la 12000 rpm la 4 ̊C timp de 15 min.
(cf. Alcántar-Fernández et al., 2018)

C. elegans Pregătirea probei înainte de imunoprecipitare și Western Blotting

Pe scurt, pentru extractele embrionare, larvele C. elegans L1 au fost cultivate în culturi lichide S-medium la scară largă până la maturitate. Embrionii au fost colectați folosind metoda standard de înălbire și suspendați în tampon de liză (50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 8,7% glicerol, 0,05% NP-40, 1���� cocktail inhibitor de protează și 1���� inhibitor de fosfatază Cocktail I și II), înghețate rapid în azot lichid și lizate prin întreruperea celulelor cu ultrasunete folosind un ultrasonicator cu microtip, cum ar fi UP200Ht cu S26d2 pentru 10 impulsuri peste 10 s la amplitudine 30%. Dacă trebuie pregătit un număr mai mare de probe, ultrasunetele VialTweeter sau UIP400MTP MultiSample-Ultrasonicator pentru plăci bine sunt recomandate. După sonicare, extractele au fost pre-eliminate prin centrifugare la 30,000g pentru 20 min la 4 ° C. Extractul pre-eliminat (300μg din proteina totală) a fost incubat cu 40μμμg de anticorp purificat anti-CDC-25.1 cu afinitate (acest studiu) reticulat la proteina A-agaroză sau, ca control, o cantitate similară de imunoglobulină de iepure (Ig)G reticulată la proteina A-agaroză a fost utilizată într-un volum total de 200μl de tampon de liză conținând 1% NP-40, a cărui includere a redus legarea nespecifică a proteinelor la matrice. Probele au fost rotite timp de 1 oră la 4 ° C, mărgelele au fost spălate de trei ori cu tampon de liză și eluate cu 30 μl de glicină / HCl și 200 mM NaCl, pH 2,2. După imunoprecipitare, eluații au fost diluați în 30μ����l de tampon de probă SDS, încălzit la 95 ° C timp de 4 minute și, de obicei, 3% din total pentru intrare și 30% pentru eluați au fost aplicați pe SDS-PAGE, urmat de Western blotting cu anticorpi anti-CDC-25.1 (1:400), anti-LIN-23 (1:750), anti-ubiquitin (1:1000), anti-GSK3 (1:500) sau anti-CHICK��β-actină (1:2000). În cazul în care extractele nu au fost supuse imunoprecipitării, aceeași cantitate de proteine totale derivate din aceste extracte a fost resuspendată în tamponul de probă SDS, încălzită la 95 ° C și apoi aplicată direct pe SDS-PAGE și analizată prin Western blotting. (cf. Segref et al. 2020)

Liza cu ultrasunete sub controlul temperaturii Prescise

Controlul precis și fiabil al temperaturii este esențial atunci când se manipulează probe biologice. Temperaturile ridicate inițiază degradarea proteinelor indusă termic în probe.
Ca toate tehnicile mecanice de pregătire a probelor, sonicare creează căldură. Cu toate acestea, temperatura probelor poate fi bine controlată atunci când se utilizează VialTweeter. Vă prezentăm diferite opțiuni pentru a monitoriza și controla temperatura probelor în timp ce le pregătiți cu VialTweeter și VialPress pentru analiză.

1. Monitorizarea temperaturii probei: Procesorul cu ultrasunete UP200St, care conduce VialTweeter, este echipat cu un software inteligent și un senzor de temperatură conectabil. Conectați senzorul de temperatură la UP200St și introduceți vârful senzorului de temperatură într-una din eprubete. Prin intermediul digitale colorate touch-display, puteți seta în meniul UP200St un interval de temperatură specific pentru sonicare eșantion. Ultrasonicator se va opri automat atunci când temperatura maximă este atinsă și pauză până când temperatura probei este redusă la valoarea mai mică a temperaturii setate ∆. Apoi sonicare începe automat din nou. Această caracteristică inteligentă previne degradarea indusă de căldură.
2. Blocul VialTweeter poate fi răcit în prealabil. Puneți blocul VialTweeter (numai sonotrode fără traductor!) în frigider sau congelator pentru a pre-răci blocul de titan ajută la amânarea creșterii temperaturii în probă. Dacă este posibil, eșantionul în sine poate fi și pre-răcit.
3. Utilizați gheață carbonică pentru a se răci în timpul sonicare. Utilizați o tavă de mică adâncime umplută cu gheață carbonică și așezați VialTweeter pe gheața carbonică, astfel încât căldura să se disipeze rapid.

Găsiți disruptorul optim de celule cu ultrasunete pentru aplicația dvs. de liză

Hielscher Ultrasonics este producător cu experiență de lungă durată de disruptori de celule cu ultrasunete de înaltă performanță și omogenizatoare pentru laboratoare, banc-top și sisteme la scară industrială. Dimensiunea culturii celulare bacteriene, obiectivul dvs. de cercetare sau producție și volumul de celule de procesat pe oră sau pe zi sunt factori esențiali pentru a găsi disruptorul de celule cu ultrasunete potrivit pentru aplicația dumneavoastră.
Hielscher Ultrasonics oferă diverse soluții pentru sonicare simultană a mai multor probe (până la 10 flacoane), precum și probe de masă (adică plăci de microtitrare / plăci cu 96 de godeuri), ultrasonicator clasic de laborator de tip sondă cu diferite niveluri de putere de la 50 la 400 wați la procesoare cu ultrasunete complet industriale cu până la 16.000 wați pe unitate pentru întreruperea celulelor comerciale și extracția proteinelor în producție mare. Toate ultrasonicators Hielscher sunt construite pentru operațiunea 24/7/365 sub sarcină maximă. Robustețea și fiabilitatea sunt caracteristici de bază ale dispozitivelor noastre cu ultrasunete.
Toate omogenizatoarele digitale cu ultrasunete sunt echipate cu software inteligent, afișaj tactil colorat și protocolare automată a datelor, care fac dispozitivul cu ultrasunete într-un instrument de lucru convenabil în laborator și facilități de producție.
Spuneți-ne, ce fel de celule, ce volum, cu ce frecvență și cu ce țintă trebuie să procesați probele biologice. Vă vom recomanda cel mai potrivit disruptor de celule cu ultrasunete pentru cerințele de proces.

Tabelul de mai jos vă oferă o indicație a capacității aproximative de procesare a sistemelor noastre cu ultrasunete de la omogenizatoare compacte de mână și ultrasonicators multisample la procesoare industriale cu ultrasunete pentru aplicații comerciale: