Prepararea cu ultrasunete a probelor de C. Elegans

C. elegans, un vierme nematod, este un organism model utilizat pe scară largă în biologie. Pregătirea probelor înainte de analiză necesită liză, extracția proteinelor și a lipidelor, precum și fragmentarea ARN-ului, operații care pot fi realizate în mod fiabil prin sonicare. Dezintegratoarele celulare cu ultrasunete sunt dispozitive fiabile, sofisticate și ușor de utilizat pentru pregătirea rapidă a probelor de C. elegans.

Prepararea cu ultrasunete a probelor de C. elegans

Caenorhabditis elegans sunt viermi cilindrici, utilizați pe scară largă în laboratoarele de cercetare pentru investigarea genomicii, a biologiei dezvoltării și a bolilor. Multe gene din genomul C. elegans au omologi funcționali la om. Astfel, viermele nematod este un model extrem de util pentru bolile umane. Alte avantaje care explică utilizarea largă a C. elegans sunt cultivarea sa ușoară și ieftină pe plăci care conțin bacterii (de ex., E. coli), transparența sa, manipularea comodă, precum și posibilitatea de a congela și stoca viermii pentru o perioadă mai lungă.
Analizele de proteine și lipide sunt proceduri obișnuite în laboratoare, iar pregătirea probelor cu ultrasunete este metoda consacrată pentru liza nematodelor C. elegans în fiecare stadiu de dezvoltare (adică embrioni, larve L1–L4, adulți). Deoarece C. elegans este utilizat și ca sistem de expresie proteică pentru supraexprimarea proteinelor țintă, este necesară o metodă de liză și extracție a proteinelor fiabilă și reproductibilă, care să ofere randamente proteice ridicate. Sistemele cu ultrasunete pentru dezintegrarea celulelor și extracție sunt disponibile ca omogenizatoare cu sondă și ca sonicatoare pentru mai multe probe. Răspunzând nevoilor de pregătire comodă a probelor și tuturor tipurilor de dimensiuni și numere de probe, Hielscher Ultrasonics are dezintegratorul celular cu ultrasunete ideal pentru procedura dumneavoastră de laborator.

Protocoale cu ultrasunete pentru dezintegrarea și liza C. Elegans

Omogenizarea și liza cu ultrasunete a C. elegans și extracția ulterioară a proteinelor și lipidelor pot fi realizate prin diverse proceduri, folosind diferite tampoane de omogenizare și liză etc. Toate protocoalele de liză au în comun faptul că probele trebuie menținute continuu pe gheață pentru a preveni degradarea proteinelor. Mai jos vă prezentăm câteva protocoale fiabile și rapide de liză și extracție cu ultrasunete pentru prepararea unor probe de C. elegans de înaltă calitate, care conțin proteine sau lipide.

Avantajele lizei cu ultrasunete a C. elegans

• fiabilă
• reproductibilă
• cu temperatură controlată precis
• control fiabil al procesului
• metodă delicată
• ușor de aplicat
• sigură

Extracția cu ultrasunete a proteinelor din probe de C. elegans

Liza cu ultrasunete și extracția proteinelor din viermii C. elegans pot fi realizate folosind diverse protocoale. Mai jos vă prezentăm câteva protocoale de liză fiabile și rapide pentru rezultate reproductibile ale extracției proteinelor.

Prepararea rapidă a extractului citosolic din viermi C. elegans prin sonicare

Cu următorul protocol puteți prepara lizate de C. elegans în mai puțin de 30 de minute.
Colectarea C. elegans
Transferați viermii C. elegans doriți într-un tub de 1,5ml cu soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) sau spălați-i de pe o placă cu 1,5ml PBS. Centrifugați timp de 1min la 2000rpm pentru a obține un pelet. Păstrați probele în permanență pe gheață.
Apoi, spălați viermii de două ori cu PBS.
Ulterior, spălați viermii de două ori cu ddH₂O.
Resuspendați viermii în cel puțin 500ul de tampon de omogenizare (HB). Probele de viermi sunt acum pregătite pentru liza cu ultrasunete.
Pentru o calitate superioară a extractului proteic, este posibil să doriți să reduceți contaminarea bacteriană spălând viermii timp de câte 5min în PBS și în apă sterilă ultrapură (ddH₂O) sau să efectuați flotarea în zaharoză. Păstrați probele de viermi continuu pe gheață.

Protocol de liză cu ultrasunete pentru C. elegans

• Asigurați-vă că pregătiți sonicatorul în prealabil, astfel încât omogenizatorul cu ultrasunete să fie gata de utilizare (sonotroda montată, programul de sonicare presetat). 

Dacă sonicatorul dumneavoastră este montat pe stativ, plasați baia de gheață cu tuburile de probă sub sonotrodă și introduceți sonotroda în tubul de 1,5ml.

• Pentru liza C. elegans cu UP200St sau UP200Ht, sonicarea trebuie efectuată folosind un microvârf (de ex., sonotroda S26d2 de 2mm; vezi imaginea din stânga) la o amplitudine de 40% timp de 1sec, cu pauze de 30sec între impulsuri. 5 cicluri de sonicare de câte 1 secundă, cu pauze de 30sec, sunt ideale pentru liza C. elegans. Dacă efectuați liza pentru prima dată, puteți verifica progresul lizei în alicote mici din probă după fiecare impuls, folosind un microscop.
• Liza este finalizată cu succes atunci când viermii sunt dezintegrați. Suprasonicarea duce la ruperea nucleilor și devine vizibilă atunci când proba devine vâscoasă sau face spumă. Pentru a preveni degradarea probei, folosiți mai multe impulsuri, dacă este necesar. Pentru a obține extracte proteice de înaltă calitate, nu măriți durata fiecărui ciclu de impulsuri ultrasonice.
• Limpeziți lizatul celular prin centrifugarea viermilor lizați cu ultrasunete la 14.000rpm timp de 10min la 4ºC.
• Apoi, transferați supernatantul într-un tub nou și pregătiți-l pentru imunoprecipitare sau alte teste.

Notă privind tamponul de omogenizare: Preparați tamponul de omogenizare pentru protocolul de liză cu ultrasunete de mai sus după cum urmează:

Liza de mare capacitate a C. elegans în plăci cu 96 de godeuri folosind sonicatorul pentru plăci UIP400MTP

Liza C. elegans (nematode adulte)
UIP400MTP, amplitudine 80%, 20 de cicluri (fiecare ciclu de sonicare: 30 sec pornit, 30 sec oprit)
Tampon de liză:

• Opțiunea 1) 4% SDS, 0,1 M Tris/HCl pH 8,0, 1 mM EDTA
• Opțiunea 2) pentru co-imunoprecipitare (co-IP): 10 mM Tris HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,5 % NP-40 (cocktail complet de inhibitori de proteinaze)

Fragmentarea ADN-ului de mare capacitate
ADN de C. elegans (nematode adulte) 200–300bp: sonicator pentru plăci UIP400MTP – setați amplitudinea la 80%, 30 de impulsuri – fiecare 30sec pornit, 30sec oprit

Sonicatorul pentru plăci UIP400MTP pentru pregătirea probelor de mare capacitate realizează sonicarea uniformă a probelor din plăci multigodeu, plăci de microtitrare și plăci cu 96 de godeuri

Liza cu ultrasunete a C. elegans pentru teste cantitative de purificare prin afinitate

Embrionii de C. elegans (∼2 milioane per replicat) au fost recoltați proaspăt, în triplicat biologic, prin tratarea cu înălbitor a hermafroditelor tinere gravide și sonicați pe gheață (ciclu: 0,5 s, amplitudine: 40–45%, 5 impulsuri/sesiune, 5 sesiuni, interval între sesiuni: 30 s; procesorul cu ultrasunete UP200S cu microvârful S26d2 (Hielscher Ultrasonics GmbH)) în tampon de liză (volum total: ∼600 μl; 50 mm Tris-HCl, pH 7,4, 100 mm KCl, 1 mm MgCl2, 1 mm EGTA, 1 mm DTT, 10% glicerol, amestec de inhibitori de protează, 0,1% Nonidet P-40 Substitute). După sonicare, s-a adăugat Nonidet P-40 Substitute până la 1%, iar lizatele au fost incubate cu rotație cap peste coadă la 4°C timp de 30 min, urmată de centrifugare la 20.000 × g timp de 20 min la 4°C. Lizatul limpezit a fost apoi aspirat fără a perturba stratul lipidic superior și împărțit în două, fie pe bilele de agaroză anti-GFP, fie pe bilele de control blocate (40–50 μl). După rotația cap peste coadă la 4°C timp de 60–90 min, bilele au fost spălate o dată cu tampon de liză care conținea 0,1% Nonidet P-40 Substitute, urmată de două spălări fie în tamponul I (25 mm Tris-HCl, pH 7,4, 300 mm NaCl, 1 mm MgCl2), fie în tamponul II (1 mm Tris-HCl, pH 7,4, 150 mm NaCl, 1 mm MgCl2), fie în ambele. Pentru experimentele de pull-down GFP:MBK-2, au fost efectuate două experimente separate folosind condiții de spălare diferite. Proteinele au fost eluate prin agitare orbitală în 50 μl de uree 6 m/tiouree 2 M la temperatura camerei. Pentru experimentele de pull-down MBK-1::GFP, proteinele au fost eluate de două ori prin agitare în 50μl de clorură de guanidiniu 8 m la 90°C, urmată de precipitare cu etanol. Probele de proteine eluate au fost apoi digerate în soluție.
(cf. Chen et al., 2016)

Omogenizarea și liza viermilor cu ultrasunete

Pentru procedura de liză și extracție a proteinelor din C.elegans, au fost colectate per probă 30.000 de nematode în stadiul relevant, care au fost spălate în S-basal rece ca gheața, concentrate prin centrifugare la 1500 rpm timp de 2 min., spălate de șase ori cu S-basal rece ca gheața pentru îndepărtarea bacteriilor reziduale și apoi păstrate pe gheață până la utilizare. Pentru extracția proteinelor, viermii adulți gravizi au fost lăsați să formeze un pelet compact după ultima spălare cu S-basal. Peleții de viermi au fost apoi resuspendați în 1 ml de tampon de extracție rece ca gheața [20 mM fosfat de potasiu, pH 7,4, 2mM EDTA, 1% Triton-X-100, inhibitori de protează (Sigma P2714)] și procesați imediat.
∼30.000 de viermi adulți gravizi (corespunzând la ∼100 mg greutate umedă) au fost sonicați pe gheață folosind un sonicator cu sondă (de ex. UP50H cu microvârful MS2) la o amplitudine de 40%, timp de 10 cicluri de 3 sec pornit, 30 sec oprit, în 1 ml de tampon de extracție rece ca gheața. (cf. Baskharan et al. 2012)

Extracția cu ultrasunete a lipidelor din C. elegans

În lipidomică, o ramură a metabolomicii, complementul lipidic al sistemelor biologice este caracterizat și analizat. C. elegans este utilizat pe scară largă în lipidomică pentru investigarea interacțiunii lipidelor metabolice și a efectelor acestora asupra sănătății și duratei de viață.
Liza și extracția cu ultrasunete sunt utilizate pentru eliberarea lipidelor, cum ar fi sfingolipidele, din embrionii, larvele și viermii adulți de C. elegans. Sonicarea este utilizată pentru prepararea omogenatelor de viermi și, ulterior, pentru extracția lipidelor din probă.
Protocol pentru extracția cu ultrasunete a lipidelor din C. elegans
Decongelați peletul de C. elegans pe gheață și resuspendați-l în 0,5 ml de ultrawater. Sonicați probele de C. elegans în eprubete de 1,5mL, menținând probele continuu pe gheață.
Sonicarea poate fi realizată folosind un sonicator cu sondă, cum ar fi UP200Ht, unitatea cu ultrasunete pentru pregătirea probelor VialTweeter (sonicarea simultană a 10 probe) sau UIP400MTP (pentru sonicarea plăcilor multigodeu, cum ar fi plăcile cu 96 de godeuri). Pentru liza cu ultrasunete cu UP200Ht, folosiți microvârful S26d2. Presetați modul de ciclu ultrasonic în meniul digital. Setați amplitudinea la 10% și modul de ciclu de sonicare cu impulsuri de 2 sec, în 20 de cicluri, cu o pauză de 30 sec. între fiecare salvă de impulsuri ultrasonice.
Transferați supernatantele în tuburi de sticlă cu capac filetat. Efectuați extracția Folch adăugând 1 ml de ultrawater în fiecare tub de sticlă, apoi adăugând 6 ml de amestec cloroform/metanol (raport = 2:1) în fiecare tub de sticlă.
Vortexați fiecare tub de sticlă timp de 30 sec, de 4 ori. Centrifugați tuburile la 1.258 x g timp de 15 min (Eppendorf, 5810 R) pentru a îmbunătăți suplimentar separarea fazelor. Transferați fracția hidrofobă inferioară într-un tub de sticlă curat cu o pipetă Pasteur din sticlă. Uscați fracția hidrofobă inferioară sub flux de azot într-un evaporator cu azot. Păstrați peletul uscat într-un congelator la -80 °C până la utilizare. 


Prepararea cu ultrasunete a lizatelor de viermi

Lizat de viermi: viermii în stadiul L4 au fost recoltați și spălați de trei ori cu tampon M9 (42,26 mM Na₂HPO₄, 22,04 mM KH₂PO₄, 85,56 mM NaCl și 0,87 mM MgSO₄) pentru a îndepărta toate bacteriile. După îndepărtarea a cât mai mult posibil din tamponul M9, viermii au fost resuspendați în tampon de liză: 50 mM HEPES, 50 mM KCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 5 mM fosfat β-glicerol, 0,1% (v/v) Triton X-100, 50 mM fluorură de sodiu, 1 mM ortovanadat de sodiu, 5 mM pirofosfat de sodiu, 0,2 mM fenilmetansulfonilfluorură și inhibitor de protează. Viermii au fost congelați în azot lichid și decongelați la 37°C de trei ori, apoi au fost sonicați pe gheață carbonică cu o unitate VialTweeter cu ultrasunete pentru pregătirea simultană a 10 tuburi de probă. Sonicarea a fost efectuată la o amplitudine de 50%, în 10 cicluri de 2 sec., cu o pauză de 30 sec între salvele de sonicare. Ulterior, probele au fost centrifugate la 12.000 rpm la 4°C timp de 15 min. Supernatantul a fost colectat și păstrat la -70°C. O alicotă a fost utilizată pentru cuantificarea proteinelor prin testul Bradford.
Determinarea glutationului total, a GSH și a GSSG: Pentru cuantificarea glutationului, lizatele și determinarea au fost realizate în aceeași zi. Larvele L4 hrănite cu glucoză și cele de control au fost recoltate și spălate de trei ori cu tampon M9. După îndepărtarea a cât mai mult posibil din tamponul M9, viermii au fost resuspendați în acid metafosforic rece ca gheața (5% w/v), apoi au fost sonicați în gheață cu un VialTweeter cu ultrasunete la o amplitudine de 50%, în zece cicluri de sonicare de 2 sec., cu o pauză de 30 sec. între fiecare ciclu. Ulterior, au fost centrifugați la 12.000 rpm la 4 ̊C timp de 15 min.
(cf. Alcántar-Fernández et al., 2018)

Pregătirea probelor de C. elegans înainte de imunoprecipitare și Western blotting

Pe scurt, pentru extractele embrionare, larvele L1 de C. elegans au fost crescute până la stadiul adult în culturi lichide pe scară largă în mediu S. Embrionii au fost colectați folosind metoda standard cu înălbitor și suspendați în tampon de liză (50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 8,7% glicerol, 0,05% NP-40, 1􏰅 cocktail de inhibitori de protează și 1􏰅 cocktail de inhibitori de fosfatază I și II), congelați rapid în azot lichid și lizați prin dezintegrarea celulelor cu ultrasunete, folosind un sonicator cu microvârf, cum ar fi UP200Ht cu S26d2, cu 10 impulsuri pe parcursul a 10 s, la o amplitudine de 30%. Dacă trebuie pregătit un număr mai mare de probe, se recomandă unitatea cu ultrasunete VialTweeter sau MultiSample-Ultrasonicator UIP400MTP pentru plăci cu godeuri. După sonicare, extractele au fost prelimpezite prin centrifugare la 30.000g timp de 20 min la 4°C. Extractul prelimpezit (300µg proteină totală) a fost incubat cu 40µ􏰂g de anticorp anti-CDC-25.1 purificat prin afinitate (acest studiu), reticulat cu proteina A-agaroză, sau, drept control, a fost utilizată o cantitate similară de imunoglobulină (Ig)G de iepure reticulată cu proteina A-agaroză, într-un volum total de 200µl de tampon de liză care conținea 1% NP-40, a cărui includere a redus legarea nespecifică a proteinelor de matrice. Probele au fost rotite timp de 1 h la 4°C, bilele au fost spălate de trei ori cu tampon de liză și eluate cu 30µl de glicină/HCl și 200 mM NaCl, pH 2,2. După imunoprecipitare, eluatele au fost diluate în 30µ􏰂l de tampon de probă SDS, încălzite la 95°C timp de 4 min, iar de obicei 3% din total pentru input și 30% pentru eluate au fost aplicate pe SDS-PAGE, urmată de Western blotting cu anticorpi anti-CDC-25.1 (1:400), anti-LIN-23 (1:750), anti-ubiquitină (1:1000), anti-GSK3􏰁 (1:500) sau anti-􏰁β-actină (1:2000). Acolo unde extractele nu au fost supuse imunoprecipitării, aceeași cantitate de proteină totală derivată din aceste extracte a fost resuspendată în tampon de probă SDS, încălzită la 95°C și apoi aplicată direct pe SDS-PAGE și analizată prin Western blotting. (cf. Segref et al. 2020)

Liza cu ultrasunete sub control precis al temperaturii

Controlul precis și fiabil al temperaturii este esențial atunci când se manipulează probe biologice. Temperaturile ridicate inițiază degradarea termică a proteinelor din probe.
Ca toate tehnicile mecanice de pregătire a probelor, sonicarea generează căldură. Cu toate acestea, temperatura probelor poate fi bine controlată atunci când se utilizează VialTweeter. Vă prezentăm diverse opțiuni pentru monitorizarea și controlul temperaturii probelor dumneavoastră în timp ce le pregătiți pentru analiză cu VialTweeter și VialPress.

1. Monitorizarea temperaturii probei: Procesorul cu ultrasunete UP200St, care acționează VialTweeter, este echipat cu un software inteligent și un senzor de temperatură conectabil. Conectați senzorul de temperatură la UP200St și introduceți vârful senzorului de temperatură într-unul dintre tuburile de probă. Prin intermediul ecranului tactil digital color, puteți seta în meniul UP200St un interval specific de temperatură pentru sonicarea probei dumneavoastră. Sonicatorul se va opri automat când este atinsă temperatura maximă și va rămâne în pauză până când temperatura probei scade la valoarea inferioară a ∆ de temperatură setat. Apoi sonicarea pornește din nou automat. Această funcție inteligentă previne degradarea indusă de căldură.
2. Blocul VialTweeter poate fi prerăcit. Introducerea blocului VialTweeter (doar sonotroda, fără traductor!) în frigider sau congelator pentru prerăcirea blocului de titan ajută la întârzierea creșterii temperaturii în probă. Dacă este posibil, poate fi prerăcită și proba însăși.
3. Folosiți gheață carbonică pentru răcire în timpul sonicării. Folosiți o tavă puțin adâncă umplută cu gheață carbonică și plasați VialTweeter pe gheața carbonică, astfel încât căldura să se poată disipa rapid.

Găsiți dezintegratorul celular cu ultrasunete optim pentru aplicația dumneavoastră de liză

Hielscher Ultrasonics este un producător cu experiență îndelungată de dezintegratoare celulare și omogenizatoare cu ultrasunete de înaltă performanță pentru laboratoare, sisteme de banc și la scară industrială. Dimensiunea culturii dumneavoastră de celule bacteriene, obiectivul dumneavoastră de cercetare sau de producție și volumul de celule de procesat pe oră sau pe zi sunt factori esențiali pentru găsirea dezintegratorului celular cu ultrasunete potrivit pentru aplicația dumneavoastră.
Hielscher Ultrasonics oferă diverse soluții pentru sonicarea simultană a mai multor probe (până la 10 flacoane), precum și a unui număr mare de probe (adică plăci de microtitrare / plăci cu 96 de godeuri), de la sonicatorul clasic de laborator cu sondă, cu diferite niveluri de putere de la 50 la 400 de wați, până la procesoare cu ultrasunete complet industriale de până la 16,000wați per unitate pentru dezintegrarea comercială a celulelor și extracția proteinelor în producția la scară mare. Toate sonicatoarele Hielscher sunt construite pentru funcționare 24/7/365 la sarcină maximă. Robustețea și fiabilitatea sunt caracteristici esențiale ale dispozitivelor noastre cu ultrasunete.
Toate omogenizatoarele digitale cu ultrasunete sunt echipate cu software inteligent, ecran tactil color și protocolare automată a datelor, care fac din dispozitivul cu ultrasunete un instrument de lucru comod în laboratoare și unități de producție.
Spuneți-ne ce tip de celule, ce volum, cu ce frecvență și cu ce scop trebuie să procesați probele dumneavoastră biologice. Vă vom recomanda cel mai potrivit dezintegrator celular cu ultrasunete pentru cerințele procesului dumneavoastră.

Tabelul de mai jos vă oferă o indicație privind capacitatea aproximativă de procesare a sistemelor noastre cu ultrasunete, de la omogenizatoare compacte ținute în mână și sonicatoare MultiSample până la procesoare industriale cu ultrasunete pentru aplicații comerciale: