Hielscher ultrasunete tehnologie

Extracția de proteine ​​cu ultrasunete din culturi de țesuturi și celule

  • extracție de proteine ​​este o probă pas esențial pregătire în proteomica.
  • Proteinele pot fi extrase din țesuturi vegetale și animale, drojdii și microorganisme.
  • Sonicare este o eficientă metodă sigură, extragerea proteinelor oferind randamente ridicate de proteine ​​într-un timp scurt de extracție.

 

Extracția proteinelor din țesuturi și celule

extracția proteinei din țesuturi și celule de cultură este o probă etapă de preparare esențială care se realizează pe parcursul mai multor tehnici biochimice și analitice cum ar fi ELISA, PAGE, Western sugativă, Spectrometrie de masă, sau purificarea proteinei. cu ultrasunete distrugere celulară, liza și extracție este o tehnica controlabil cu precizie pentru a asigura randamente ridicate de proteine.

extracția proteinei din țesuturi de origine animală

Pentru prepararea țesuturilor de dimensiuni întregi (de exemplu, rinichi, inimă, plămân, mușchi, etc.), țesutul trebuie disecat în bucăți foarte mici cu scule curățate, preferabil pe gheață și cât mai repede posibil pentru a preveni degradarea prin proteaze (de ex. tampon de liză, cum ar fi RIPA sau tampon de liză hipotonic care conține cocktail inhibitor de protează și inhibitor de fosfatază). După disecție, proba este scufundată în azot lichid pentru înghețarea instantanee. Proba poate fi depozitată la -80 ° C pentru utilizare ulterioară sau poate fi păstrată pe gheață pentru o omogenizare imediată. Imediat înainte de extracția cu ultrasunete, în tubul de probă se adaugă rapid tampon de liză rece (cu inhibitori de protează DTT, leupeptină și aprotinină) (pe ~ 10 mg de țesut sunt recomandate aproximativ 600 μL tampon). Aproximativ. Se recomandă 20-60 mg de țesut pe fiecare tub de probă.
omogenizare cu ultrasunete, liza și extracția se efectuează cu un omogenizator cu ultrasunete, cum ar fi Uf200 ः t sau UP200St, Echipat cu un sonotrod de micro-tip. Durata sonicare este de 60-90 sec. într-un mod ciclu ultrasonic de 15 sec. sonicare și 10 sec. timp de odihnă. Eșantionul trebuie să fie păstrate în gheață tot timpul.
După omogenizare cu ultrasunete / extracție, lizatul este centrifugat la 27,000g timp de aprox. 20 min. După aceea, supernatantul este colectat, astfel încât concentrația de proteină poate fi determinată printr-un test de proteină, cum ar fi Pierce test de proteină BCA.

Sonicare proteine este o metodă importantă de preparare eșantion

Extracția proteinelor cu ultrasunete din celule cu UP200St

Cerere de informatie





extracția proteinei din serul sanguin

Pentru un amestec omogen de ser și tamponul fosfat, proba este centrifugată înainte de a liza celulelor cu ultrasunete. Pentru liza cu ultrasunete, proba este sonicată cu un omogenizator de laborator cu ultrasunete, cum ar fi UP100H pentru 8 cicluri la 20% din amplitudinea, pentru cicluri de câte 5 secunde la 15 secunde și off. Sonocation se realizează prin sonicationg în cicluri și prin plasarea probei pe gheață, astfel încât supraîncălzirea și degradarea termică a probei este evitată. Deoarece serul conține o cantitate mare de proteine ​​cu greutate moleculară mare (cum ar fi albumina, α1-antitripsină, transferina, haptoglobulin, imunoglobulina G și imunoglobulină A), care interferează cu separarea proteinelor cu greutate moleculară mică în timpul IEF, este recomandat să le epuizeze din ser folosind o coloană epuizare.

extracția proteinei din țesutul plantei

Proaspete, țesuturi de plante moi, de ex mușchi etc., pot fi ușor perturbat prin plasarea materialului tocat probă în tampon de liză pentru sonicare. Dur, țesuturi vegetale ligenous, cum ar fi semințe, brad ace etc., trebuie să fie măcinate uscate. Unele materiale vegetale lemnoase dure trebuie să fie congelate și la sol în azot lichid înainte de a se extrage prin sonicare. Pentru suspensiile de culturi de celule de plante, un tratament cu ultrasunete între 30 și 150 de secunde într-un tampon de liză este în mare parte suficientă. materialul mai dur, cum ar fi semințele de dovleac necesită o sonicare mai intensă așa cum este descris mai jos.

Protocol pentru extracția cu ultrasunete de albumină din semințe de dovleac

omogenizator de țesut cu ultrasunete UP400St cu S24d40 - pentru extracția proteinelor din plantă și țesut animal (Click pentru a mari!)Pentru extracția proteinelor cu ultrasunete de albumină din pudră de semințe de dovleac fin măcinată, se adaugă 10 g de pulbere de semințe de dovleac degresată și 100 ml de apă deionizată ca solvent într-un pahar de sticlă 250mL. Extracția proteinelor constă în două etape: în primul rând, eșantionul este sonicate cu un ultrasonicator tip sondă UP400St (400W, 24kHz) cu sonotrode montat S24d7. Paharul de sticlă este plasat într-o baie cu apă rece în timpul omogenizării cu ultrasunete. Setarea ultrasonicator UP400St cu senzorul de temperatură conectabil a asigurat că temperatura probei este întotdeauna menținută sub 30 ° C. Prin controlul precis al temperaturii în timpul sonicării, se evită denaturarea albuminei. În al doilea rând, extracția a fost efectuată cu un mixer la o viteză de 200 rpm și la 30 ° C. Apoi, paharul este transferat într-un agitator termostatic. Globulina este îndepărtată prin dializă cu apă distilată. După îndepărtarea globulinei, extractul proteic poate fi prelevat pentru determinarea profilului albuminei și este apoi ajustat la pI = 3,0 utilizând HCI 0,1 M pentru coagularea albuminei. Faza solidă este separată prin centrifugare la 5000 g, 20 ° C și redizolvată în apă deionizată. Coagularea albuminei se efectuează de două ori pentru a crește raportul proteic în concentrația albuminei.

Cu ultrasunete extracție alcalină de proteine ​​pentru prepararea de concentrat de proteine ​​din tărâțe de orez arată că rezultatele tratamentului cu ultrasunete, cu un randament mai mare de proteine ​​într-un timp de extracție semnificativ mai scurt – în comparație cu metodele de extracție convenționale.

VialTweeter Dispozitiv cu ultrasunete pentru extragerea proteinelor din probe de țesut (Click pentru a mari!)

VialTweeter pentru sonicare indirectă.

avantaje

  • Rapidă
  • randamente ridicate
  • foarte eficient
  • un control precis asupra parametrilor
  • rezultate reproductibile
  • scalabilitate liniară

Protocol de preparare a probei pentru enzima funcțională iNOS

Pentru a obține enzimă pe deplin funcțional iNOS (de exemplu, pentru screening-ul de droguri), se recomandă următorul protocol: Suspensia de celule trebuie să fie plasată pe gheață și sonicat cu UP100H la amplitudinea 10um la modul ciclu de 5 sec. sonicare și 25 sec. odihnă pe gheață. Procedura trebuie repetată aprox. de 3 ori. Timpul de repaus între cicluri de sonicare reduce creșterea temperaturii și, prin urmare, se va reduce riscul de denaturare.

Cu ultrasunete de proteine ​​Solubilizarea

Sonicare poate accelera procesul de solubilizare de proteine, care de obicei necesită mai multe ore. Pentru a nu se supraîncălzi probei și pentru a preveni degradarea proteinelor și modificări în soluții care conțin uree, exploziile ultrasunete nu trebuie să dureze mai mult de câteva secunde.

Instrucțiuni generale

Controlul temperaturii: Pentru a asigura un randament ridicat de proteine ​​fără denaturare termică, temperatură în timpul extracției trebuie să fie controlată. state-of-art omogenizatoare cu ultrasunete Hielscher lui – de asemenea, numit dezintegratoare cu ultrasunete sau sonificator – sunt controlabile cu precizie. Ei vin cu un senzor de temperatură plugable. În opțiunile de setare ale omogenizator cu ultrasunete, o temperatură maximă poate fi setată. Când se atinge această temperatură maximă, ultrasonicator se oprește automat până când proba sa răcit.
Tampon: Unui tampon buna alegere adecvată și volumul corect de tampon variază de la tesut la tesut si trebuie sa fie gândit-out prin proces de testare și eroare.
Izolarea / purificare: Uzatele de proteine ​​poate conține un exces de biomolecule cum ar fi ADN sau carbohidrați, care pot fi îndepărtate prin precipitarea proteinei (acid-deoxicolat tricloracetic) sau tampon de schimb.

Chittapalo și Noomhorm (2009) a raportat că randamentul a crescut de proteine ​​folosind sonicare și că procesul de omogenizare a țesutului și liza cu ultrasunete poate îmbunătăți în mod semnificativ procesele de extracție existente – permițând pentru noi oportunități de extracție comerciale.

Sunet de protecție cu carcasă Hielscher de sunet SPB-L și UP200St dispozitiv cu ultrasunete. (Click pentru a mari!)

omogenizator de țesut cu ultrasunete UP200St pentru extracția proteinelor eficiente

Controlul precis al tratamentului cu ultrasunete (Click pentru a mari!)

Controlul în browser pentru funcționare precisă și monitorizare a procesului de sonicare

Echipament cu ultrasunete pentru extracție de proteine

Hielscher Ultrasonics oferă o gamă largă de omogenizatoare cu ultrasunete pentru dezintegrarea celulelor, țesuturilor, bacterii, microorganisme, drojdii și spori.
ultrasonicators de laborator Hielscher sunt puternice și ușor de operat. Construit pentru operare 24/7, ele sunt concepute ca dispozitive robuste și eficiente de laborator și de banc-top. Pentru toate dispozitivele, producția de energie și amplitudinea poate fi controlată cu precizie. Gama largă de Accesorii deschide opțiuni suplimentare de configurare. Dispozitivele digitale, cum ar fi VialTweeter. Uf200 ः t. UP200St, și UP400St au un control al temperaturii integrat și un built-in card SD pentru înregistrarea automată a datelor.
Pentru indirect, contaminării încrucișate și fără sonicare simultană a mai multor mostre, noi oferim VialTweeter sau cuphorn cu ultrasunete.
În funcție de aplicație, materiale, iar volumul de probă, vă vom recomanda cea mai potrivita pentru configurarea prep dvs. de probă. Contactati-ne azi!

Contacteaza-ne! / Intreaba-ne!

Va rugam sa folositi formularul de mai jos, în cazul în care doriți să solicite informații suplimentare cu privire la omogenizare cu ultrasunete. Vom fi bucuroși să vă oferim un sistem de ultrasunete îndeplinesc cerințele dumneavoastră.









Vă rugăm să rețineți Politica de confidentialitate.


Literatura / Referințe

  • Chittapalo T, Noomhorm A (2009): cu ultrasunete asistata de extracție alcalină de proteine ​​din tărâțe de orez degresată și proprietăți ale concentratelor proteice. Int J Food Sci Technol 44: 1843-1849.
  • Simoes, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joan.; Nunes, Ana M.; Gomes, Sofia E.; Roberts, Peter M.; Lo, Adrian C.; D'Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen C.; Borralho, Peter M.; Rodrigues, Cecilia M. P. (2013): Recuperarea eficienta a proteinelor din probe multiple sursă după Trizol sau Trizol LS extracția ARN și stocarea pe termen lung. BMC Genomics, 2013, 14: 181.


Ce trebuie să știți

proteomica

Proteomics este domeniul de cercetare care investighează proteinele și proteomul. Proteinele fullfil o gamă largă de funcții vitale din cadrul organismelor. Proteomul este întregul set de proteine ​​exprimate de un genom, celulă, țesut sau organism la un anumit moment. Proteomul variază în funcție de cerințele de timp și distincte, sau subliniază că o celulă sau organism suferă. Mai precis, acesta este setul de proteine ​​exprimate într-un anumit tip de celulă sau organism, la un moment dat, în condiții definite. Termenul este un amestec de proteine ​​si genomului. Proteomics este studiul proteome.

Proteină

Proteinele sunt sunt biomolecule mari, așa-numitele macromolecule – care sunt compuse din unul sau mai multe lanțuri lungi de reziduuri de aminoacizi. Proteinele sunt prezente în toate organismele de origine vegetală și animală și sunt esențiale pentru majoritatea funcțiilor biologice. Deoarece proteinele conțin o mulțime de informații biologice, ele sunt extrase pentru scopuri analitice, de exemplu pentru cercetarea proteomică. Cea mai importantă funcție efectuată de proteine ​​include cataliza reacțiilor metabolice, replicarea ADN-ului, răspunsul la stimuli și transportul moleculelor dintr-o locație în alta. Proteinele diferă unul față de celălalt în primul rând în secvența lor de aminoacizi, care este dictată de secvența de nucleotide a genelor lor și care, de obicei, duce la pliarea proteinelor într-o structură tridimensională specifică care determină activitatea sa. Sunt proteinele – în afară de peptide – una dintre componentele principale ale produselor alimentare. Prin urmare, proteomica este un instrument puternic în domeniul științei alimente pentru a optimiza procesele, siguranța alimentară și de evaluare nutrițională.

Electroforeză cu gel

Gel electroforeza este principala metodă de separare și analiză a macromoleculelor, cum ar fi ADN, ARN și proteine ​​precum și fragmente ale acestora, în funcție de mărime și de sarcina lor. Este utilizat în chimia clinică pentru separarea proteinelor prin încărcare și / sau dimensiunea (IEF agaroză, în esență, dimensiune independentă) și în biochimie, biologie moleculara si proteomica pentru a separa o populație mixtă de fragmente ADN și ARN de lungime, pentru a estima dimensiunea ADN-ului și fragmente de ARN sau pentru a separa proteinele de încărcare.

Culturi de celule

Cultura celulară este procesul de crestere controlata prin care celulele sunt cultivate în condiții controlate. Condițiile de cultură celulară variază pentru fiecare tip de celule. În general, mediul unei culturi de celule constă dintr-un vas adecvat (de exemplu, placă Petri) cu substrat sau mediu, care furnizează substanțele nutritive esențiale (aminoacizi, carbohidrați, vitamine, minerale), factori de creștere, hormoni, și gazele (CO2The2), Și reglementează mediul fizico-chimic (tampon de pH, presiunea osmotică, temperatura). Cele mai multe celule au nevoie de o suprafață sau substrat artificial, în timp ce alte culturi de celule pot fi cultivate liber plutind în mediu de cultură (cultură în suspensie, suspensie de celule).
Culturile de masă de linii celulare animale sunt utilizate în producția industrială de vaccinuri virale și alte produse derivate biotehnologic. Celulele stem umane sunt cultivate pentru a extinde numărul de celule și diferențierea celulelor în diferite tipuri de celule somatice în scopuri de transplant.

Probele de țesut

Țesutul Termenul descrie un intermediar celular, în care materialul celular este la nivel organizațional între celule și un organ complet. In țesut, celule similare, din aceeași origine, care împreună să efectueze o funcție specifică, sunt asamblate. Prin gruparea funcțională a mai multor țesuturi, sunt formate structurile complexe ale organelor.
Tissue este eșantionat pentru cercetare în biologie, histologie / histopatologie, parazitologie, biochimie, imunohistochimia precum și să cultive și extrage ADN-ul. Se poate distinge între animal (subdiviziune: țesut mamifer) și țesutul plantei. țesuturile animale sunt grupate în patru tipuri de bază de conjunctiv, muscular, nervos și țesutul epitelial. țesut de plantă este împărțită în următoarele trei sisteme de țesuturi: epiderma, tesutul la sol, și țesutul vascular.
Probele de tesut pot fi preparate din părți animale sau vegetale, de exemplu oase, mușchi, frunze, etc.

fluide corporale

Sânge, ser, plasmă, lichid cefalo-rahidian, salivă și lichid sinovial sunt fluide ale corpului, care oferă o mare sursă de informații relevante pentru diagnostic. Prin urmare, un preparat sofisticat de probe de fluide biologice pentru analiză este importantă. Prima dificultate este asociat cu gama dinamica larga a componentelor prezente în fluidele corpului.

Determinarea concentrației proteinei

testul Bradford, testul Lowry și testul (BCA) Acid bicinchoninic sunt testele comune pentru a determina concentrația de proteine. albumină serică bovină (BSA) este una dintre cele standard de proteine ​​cel mai frecvent utilizate.

tampon de liză

tampon Lysis trebuie să fie alese în conformitate cu materialul celular sau țesut (cultura de tesut, plante, bacterii, fungi, etc.), și dacă celulele sunt într-o structură și tipul de structură. O gamă largă de liză soluții tampon pentru extragerea proteinelor, membrane si organite sunt formulate cu unul sau mai mulți detergenți. Detergentul este de obicei selectat prin teste de încercare și eroare sau – daca este disponibil – conform unui protocol de extracție de proteine ​​existente. Detergentul trebuie să fie compatibil cu sursa de țesut și proteinele. În general, mildest detergent care lucreaza pentru un tesut / proteine ​​specifice, este ales pentru a menține funcționalitatea maximă a extractului. Mai mult decât atât, în cazul unei extracție a membranelor și organite, un detergent slab păstrează membrana intactă. detergenți utilizați în mod obișnuit în tampoane de liză sunt în principal neionici sau zwitterionic, de ex CHAPS, deoxicolat, Triton ™ X-100, NP40 și Tween 20.
De exemplu, țesuturi, cum ar fi creier, ficat, intestin, rinichi, splină etc. pot fi pur și simplu tamponat cu RIPA – Cu toate acestea ar trebui să fie incluși inhibitori de protează și DTT (de exemplu, pentru electroforeza în gel).
tampon de liză pentru țesutul muscular scheletic (rece ca gheața): 20 mM Tris (pH 7,8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCI, 1 mM MgCl2, 1% Triton X-100, 10% (g / v) glicerol, 1 mM EDTA , 1 mM ditiotreitol suplimentat cu protează și inhibitor al fosfatazei cocktail
Tabelul de tampoane comune și gama lor de pH. În general, aceste tampoane sunt utilizate în mod normal la concentrații de 20-50 mM.

Tampon interval de pH
Acid citric – Naoh 2,2 de – 6,5 de
Citrat de sodiu – Acid citric 3,0 de – 6,2 de
Acetat de sodiu – acid acetic 3,6 de – 5,6 de
sare de sodiu a acidului cacodilic – acid clorhidric 5 – 7,4 de
MY – Naoh 5,6 de – 6,8 de
dihidrogen fosfat de sodiu – fosfat acid disodic 5,8 de – 8
Imidazol – acid clorhidric 6,2 de – 7,8 de
Perii – Koh 6,6 de – 7,8 de
clorhidrat de trietanolamina – Naoh 6,8 de – 8,8 de
Tris – acid clorhidric 7 – 9
HEPES – Naoh 7,2 de – 8,2 de
Tricine – Naoh 7,6 de – 8,6 de
tetraborat de sodiu – acid boric 7,6 de – 9,2 de
bicină – Naoh 7,7 de – 8,9 de
glicina – Naoh 8,6 de – 10,6 de

Cele mai multe tampoane prezintă un pH-dependență de temperatură. Acest lucru este valabil mai ales pentru tampoane Tris. PKa se schimbă de la 8,06 la 25 ° C până la 8.85 la 0 ° C.
(PH și pKa unui tampon: pH măsoară concentrația ionilor de hidrogen într-o soluție apoasă pKa (= disociere acidă constantă) este o măsură legat, dar mai specific, prin aceea că ea ajută pentru a anticipa modul in care o molecula va acționa într-un anumit. Valoarea pH-ului.)

TRIzol

TRIzol este o soluție chimică utilizată pentru a extrage ARN / ADN / proteină în timpul extracției guanidiniu tiocianat-fenol-cloroform. Utilizarea ultrasunetelor asistate rezultate de extracție TRIzol in ADN-ul ridicat, ARN și randamentele de proteine ​​din aceeași probă și excelează prin aceasta alte metode de extracție.