Extracția cu ultrasunete a proteinelor din țesuturi și culturi celulare

• Extracția proteinelor este o etapă esențială de pregătire a probelor în proteomică.
• Proteinele pot fi extrase din țesuturi vegetale și animale, din drojdii și din microorganisme.
• Sonicarea este o metodă fiabilă și eficientă de extracție a proteinelor, care oferă randamente ridicate de proteine într-un timp scurt de extracție.

Extracția proteinelor din țesuturi și celule

Extracția proteinelor din țesuturi și din celule de cultură este o etapă esențială de pregătire a probelor, efectuată în cadrul multor tehnici biochimice și analitice, cum ar fi ELISA, PAGE, Western blotting, spectrometria de masă sau purificarea proteinelor. Dezintegrarea celulelor, liza și extracția cu ultrasunete reprezintă o tehnică netermică, controlabilă cu precizie, care asigură randamente ridicate de proteine.

Instrucțiuni generale pentru liza și extracția proteinelor cu ultrasunete

• Controlul temperaturii: Pentru a asigura un randament ridicat de proteine fără denaturare termică, temperatura trebuie controlată în timpul extracției. Omogenizatoarele cu ultrasunete de ultimă generație de la Hielscher – numite și dezintegratoare cu ultrasunete sau ultrasonificatoare – pot fi controlate cu precizie. Acestea sunt prevăzute cu un senzor de temperatură conectabil. În opțiunile de setare ale omogenizatorului cu ultrasunete se poate seta o temperatură maximă. Când această temperatură maximă este atinsă, ultrasonicatorul se oprește automat până când proba s-a răcit.
• Tampon: Alegerea unui tampon adecvat și a volumului corect de tampon variază de la un țesut la altul și trebuie stabilită prin teste de tip încercare și eroare.
• Izolare / purificare: Lizatele proteice pot conține un exces de biomolecule, cum ar fi ADN sau carbohidrați, care pot fi îndepărtate prin precipitarea proteinelor (deoxicolat-acid tricloracetic) sau prin schimbul de tampon.

Chittapalo și Noomhorm (2009) au raportat în studiul lor că randamentul de proteine a crescut prin utilizarea sonicării și că procesul de omogenizare și liză a țesuturilor cu ultrasunete poate îmbunătăți semnificativ procesele de extracție existente – deschizând noi oportunități comerciale de extracție.
 

Extracția proteinelor din țesut animal

Pentru pregătirea țesutului întreg (de ex. rinichi, inimă, plămân, mușchi etc.), țesutul trebuie disecat în bucăți foarte mici cu instrumente curate, de preferință pe gheață, și cât mai rapid posibil pentru a preveni degradarea de către proteaze (de ex. tampon de liză precum RIPA sau tampon de liză hipotonic care conține un cocktail de inhibitori de proteaze și fosfataze). După disecare, proba este imersată în azot lichid pentru congelare rapidă. Proba poate fi depozitată la -80°C pentru utilizare ulterioară sau păstrată pe gheață pentru omogenizare imediată. Imediat înainte de extracția cu ultrasunete, tamponul de liză rece ca gheața (cu inhibitorii de proteaze DTT, leupeptină și aprotinină) se adaugă rapid în tubul cu probă (se recomandă aprox. ~600 μL de tampon la ~10 mg de țesut). Se recomandă aprox. 20–60mg de țesut per tub de probă.
Omogenizarea, liza și extracția cu ultrasunete se efectuează cu un omogenizator cu ultrasunete, cum ar fi UP100H sau UP200Ht, echipat cu o sonotrodă cu microvârf. Durata sonicării este de 60–90 sec., într-un mod ciclic cu ultrasunete de 15 sec. de sonicare și 10 sec. de pauză. Proba trebuie menținută în gheață tot timpul.
După omogenizarea / extracția cu ultrasunete, lizatul se centrifughează la 27.000g timp de aprox. 20 min. Apoi se colectează supernatantul, astfel încât concentrația de proteine să poată fi determinată printr-un test proteic, cum ar fi testul proteic Pierce BCA.

Extracția proteinelor din serul sanguin

Pentru un amestec omogen al serului și al tamponului fosfat, proba este mai întâi vortexată înainte de liza celulară cu ultrasunete. Pentru liza cu ultrasunete, proba este sonicată cu un omogenizator de laborator cu ultrasunete, cum ar fi UP100H, timp de 8 cicluri la 20% amplitudine, în cicluri de câte 5 secunde de funcționare și 15 secunde de pauză. Extracția proteinelor se realizează prin sonicare în cicluri (mod pulsat) și prin plasarea probei pe gheață, astfel încât să se evite supraîncălzirea și degradarea termică a probei. Deoarece serul conține o cantitate mare de proteine cu greutate moleculară mare (cum ar fi albumina, α1-antitripsina, transferina, haptoglobulina, imunoglobulina G și imunoglobulina A), care interferează cu separarea proteinelor cu greutate moleculară mică în timpul IEF, se recomandă depleția acestora din ser cu ajutorul unei coloane de depleție.

Extracția proteinelor din țesut vegetal

Țesutul vegetal proaspăt și moale, de ex. mușchiul de pământ etc., poate fi dezintegrat cu ușurință prin simpla plasare a materialului de probă mărunțit în tampon de liză pentru sonicare. Țesuturile vegetale dure, lignificate, cum ar fi semințele, acele de brad etc., trebuie măcinate uscate. Unele materiale vegetale dure, lemnoase, trebuie congelate și măcinate în azot lichid înainte de a fi extrase prin sonicare. Pentru suspensiile de culturi de celule vegetale, un tratament cu ultrasunete între 30 și 150 de secunde într-un tampon de liză este de cele mai multe ori suficient. Materialele mai dure, cum ar fi semințele de dovleac, necesită o sonicare mai intensă, după cum este descris mai jos.
 

Protocol pentru extracția cu ultrasunete a albuminei din semințe de dovleac

Pentru extracția cu ultrasunete a albuminei din pulberea fin măcinată de semințe de dovleac, 10 g de pulbere degresată de semințe de dovleac și 100 mL de apă deionizată ca solvent se adaugă într-un pahar Berzelius de 250mL. Extracția proteinelor constă în două etape: mai întâi, proba este sonicată cu un ultrasonicator cu sondă UP400St (400W, 24kHz) echipat cu sonotroda S24d7. Paharul Berzelius este plasat într-o baie de apă rece în timpul omogenizării cu ultrasunete. Senzorul de temperatură conectabil și setările de control al temperaturii ale ultrasonicatorului UP400St asigură menținerea permanentă a temperaturii probei sub 30°C. Prin controlul precis al temperaturii în timpul sonicării se evită denaturarea albuminei. În al doilea rând, extracția a fost efectuată cu un mixer la o viteză de 200 rpm și la 30°C. Ulterior, paharul este transferat într-un agitator termostatat. Globulina este îndepărtată prin dializă cu apă distilată. După îndepărtarea globulinei, extractul proteic poate fi eșantionat pentru determinarea profilului albuminei și este apoi ajustat la pI=3,0 folosind 0,1 M HCl pentru coagularea albuminei. Faza solidă este separată prin centrifugare la 5000g, 20°C și redizolvată în apă deionizată. Coagularea albuminei se efectuează de două ori pentru a crește proporția de proteine din concentratul de albumină.

Extracția alcalină cu ultrasunete a proteinelor pentru prepararea concentratului proteic din tărâțe de orez arată că tratamentul cu ultrasunete conduce la un randament mai mare de proteine într-un timp de extracție semnificativ mai scurt – comparativ cu metodele convenționale de extracție.

Protocol de pregătire a probelor pentru enzima iNOS funcțională

Pentru a obține enzima iNOS complet funcțională (de ex. pentru screeningul medicamentelor), se recomandă următorul protocol: suspensia celulară trebuie plasată pe gheață și este sonicată cu un UP100H la o amplitudine de 10µm, în mod ciclic de 5 sec. de sonicare și 25 sec. de pauză pe gheață. Procedura trebuie repetată de aprox. 3 ori. Timpul de pauză dintre ciclurile de sonicare reduce creșterea temperaturii și, prin urmare, va reduce riscul de denaturare.

Solubilizarea proteinelor cu ultrasunete

Sonicarea poate accelera procesul de solubilizare a proteinelor, care de obicei necesită câteva ore. Pentru a nu supraîncălzi proba și pentru a preveni degradarea și modificările proteinelor în soluțiile care conțin uree, impulsurile ultrasonice nu ar trebui să dureze mai mult de câteva secunde.

Echipamente cu ultrasunete pentru extracția proteinelor

Hielscher Ultrasonics oferă o gamă largă de omogenizatoare cu ultrasunete pentru dezintegrarea celulelor, țesuturilor, bacteriilor, microorganismelor, drojdiilor și sporilor.
Ultrasonicatoarele de laborator Hielscher sunt puternice și ușor de utilizat. Construite pentru funcționare 24/7, ele sunt concepute ca dispozitive de laborator și de banc robuste și eficiente. Pentru toate dispozitivele, energia furnizată și amplitudinea pot fi controlate cu precizie. Gama largă de accesorii oferă opțiuni suplimentare de configurare. Ultrasonicatoarele digitale, cum ar fi VialTweeter, UP200Ht, UP200St și UP400St, au un control integrat al temperaturii și un card SD încorporat pentru înregistrarea automată a datelor.
Pentru sonicarea indirectă, fără contaminare încrucișată și simultană a mai multor probe, oferim VialTweeter sau CupHorn cu ultrasunete.
Tabelul de mai jos vă oferă o prezentare generală a ultrasonicatoarelor noastre pentru pregătirea probelor, dezintegrarea celulelor și extracție. Faceți clic pe tipul de dispozitiv pentru a obține mai multe informații despre fiecare omogenizator cu ultrasunete. Personalul nostru tehnic bine pregătit și cu experiență îndelungată vă va ajuta cu plăcere să alegeți ultrasonicatorul cel mai potrivit pentru pregătirea probelor dumneavoastră!
 

În funcție de aplicația, materialul și volumul probei dumneavoastră, vă vom recomanda configurația cea mai potrivită pentru pregătirea probelor. Contactați-ne astăzi!