Extracția proteinelor cu ultrasunete din culturi de țesuturi și celule
- Extracția proteinelor este o etapă esențială de pregătire a probei în proteomică.
- Proteinele pot fi extrase din țesuturi vegetale și animale, drojdii și microorganisme.
- Sonicare este o metodă fiabilă, eficientă de extracție a proteinelor, oferind randamente ridicate de proteine într-un timp scurt de extracție.
Extracția proteinelor din țesuturi și celule
Extracția proteinelor din țesuturi și celule cultivate este o etapă esențială de pregătire a probei care se realizează în timpul multor tehnici biochimice și analitice, cum ar fi ELISA, PAGE, Western blotting, spectrometrie de masă sau purificarea proteinelor. Întreruperea celulelor cu ultrasunete, liza și extracția este o tehnică precis controlabilă, non-termică pentru a asigura randamente ridicate de proteine.
Extracția proteinelor din celule cu sondă cu ultrasunete UP200St
- Repede
- randamente ridicate
- Foarte eficient
- Control precis asupra parametrilor
- rezultate reproductibile
- scalabilitate liniară
Instrucțiuni generale pentru liza cu ultrasunete și extracția proteinelor
- Controlul temperaturii: Pentru a asigura un randament ridicat de proteine fără denaturare termică, temperatura în timpul extracției trebuie controlată. Omogenizatoarele cu ultrasunete de ultimă generație de la Hielscher – De asemenea, numit dezintegrator cu ultrasunete sau ultrasonifier – sunt controlabile cu precizie. Acestea vin cu un senzor de temperatură conectabil. În opțiunile de setare ale omogenizatorului cu ultrasunete, poate fi setată o temperatură maximă. Când se atinge această temperatură maximă, ultrasonicator se oprește automat până când proba se răcește.
- Tampon: Alegerea unui tampon adecvat și volumul potrivit de tampon variază de la țesut la țesut și trebuie să fie determinate prin teste de încercare și eroare.
- Izolare? purificare: Lizații proteici pot conține un exces de biomolecule, cum ar fi ADN-ul sau carbohidrații, care pot fi îndepărtați prin precipitarea proteinelor (acid deoxicolat-tricloracetic) sau prin schimb tampon.
Chittapalo și Noomhorm (2009) au raportat în studiul lor că randamentul proteinelor a crescut folosind sonicare și că omogenizarea cu ultrasunete a țesuturilor și procesul de liză poate îmbunătăți semnificativ procesele de extracție existente – facilitarea unor noi oportunități de extracție comercială.
CupHorn cu ultrasunete pentru pregătirea simultană și foarte eficace a probelor multiple în aceleași condiții pentru izolarea proteinelor și fragmentarea ADN-ului.
Extracția proteinelor din țesuturile animale
Pentru prepararea țesutului de dimensiuni întregi (de exemplu, rinichi, inimă, plămân, mușchi etc.), țesutul trebuie disecat în bucăți foarte mici, cu instrumente curate, de preferință pe gheață și cât mai repede posibil pentru a preveni degradarea de către proteaze (de exemplu, tampon de liză, cum ar fi RIPA sau tampon de liză hipotonă care conține cocktail de protează și inhibitor de fosfatază). După disecție, proba este scufundată în azot lichid pentru înghețarea rapidă. Proba poate fi depozitată la -80 ° C pentru utilizare ulterioară sau poate fi păstrată pe gheață pentru omogenizare imediată. Imediat înainte de extracția cu ultrasunete, tampon de liză rece ca gheața (cu inhibitori de protează DTT, leupeptină și aprotinină) este adăugat rapid în eprubetă (per ~ 10 mg de țesut aproximativ ~ 600 μL de tampon sunt recomandate). Aproximativ 20-60 mg de țesut este recomandat per eprubetă.
Omogenizarea cu ultrasunete, liza și extracția se realizează cu un omogenizator cu ultrasunete, ar fi UP100H sau UP200Ht, echipat cu un sonotrod micro-tip. Durata sonicare este de 60-90 sec. la un mod ciclu cu ultrasunete de 15 sec. sonicare și 10 sec. timp de odihnă. Proba trebuie păstrată în gheață tot timpul.
După omogenizarea? extracția cu ultrasunete, lizatul este centrifugat la 27.000g timp de aproximativ 20 min. Ulterior, supernatentul este colectat, astfel încât concentrația de proteine poate fi determinată printr-un test proteic, cum ar fi testul proteinei Pierce BCA.
Extracția proteinelor din serul de sânge
Pentru un amestec omogen de ser și tampon fosfat, proba este vortexed mai întâi înainte de liza celulelor cu ultrasunete. Pentru liza cu ultrasunete, proba este sonicated cu un omogenizator de laborator cu ultrasunete, ar fi UP100H pentru 8 cicluri la 20% amplitudine, pentru cicluri de fiecare 5 secunde pe și 15 secunde oprit. Extracția proteinelor se realizează prin sonicare în cicluri (modul pulsație) și prin plasarea probei pe gheață, astfel încât să se evite supraîncălzirea și degradarea termică a probei. Deoarece serul conține o cantitate mare de proteine cu greutate moleculară mare (cum ar fi albumina, α1-antitripsina, transferina, haptoglobulina, imunoglobulina G și imunoglobulina A), care interferează cu separarea proteinelor cu greutate moleculară mică în timpul IEF, se recomandă epuizarea acestora din ser folosind o coloană de epuizare.
Extracția proteinelor din țesutul vegetal
Proaspete, țesuturi vegetale moi, de exemplu mușchi etc., pot fi ușor perturbate prin simpla plasare a materialului de probă tocat în tampon de liză pentru sonicare. Țesuturile dure, lemnoase ale plantelor, cum ar fi semințele, acele de brad etc., ar trebui să fie uscate la sol. Unele materiale vegetale dure, lemnoase trebuie să fie înghețate și măcinate în azot lichid înainte de a fi extrase prin sonicare. Pentru suspensiile de cultură celulară vegetală, un tratament cu ultrasunete între 30 și 150 secunde într-un tampon de liză este în mare parte suficient. Material mai dur, ar fi semințele de dovleac necesită o sonicare mai intensă, așa cum este descris mai jos.
Protocol pentru extracția cu ultrasunete a albuminei din semințe de dovleac
Pentru extracția cu ultrasunete proteine de albumină din pulbere de semințe de dovleac măcinate fin, 10 g de pulbere de semințe de dovleac degresate și 100 ml de apă deionizată ca solvent se adaugă într-un pahar de sticlă 250mL. Extracția proteinelor constă în două etape: În primul rând, proba este sonicată cu un ultrasonicator de tip sondă UP400St (400W, 24kHz) echipat cu sonotrode S24d7. Paharul de sticlă este plasat într-o baie de apă rece în timpul omogenizării cu ultrasunete. Senzorul de temperatură conectabil și setările de control al temperaturii ultrasonicator UP400St asigură că temperatura probei este întotdeauna menținută sub 30 ° C. Prin controlul precis al temperaturii în timpul sonicare, se evită denaturarea albuminei. În al doilea rând, extracția a fost efectuată cu un mixer la o viteză de 200 rpm și la 30 ° C. Ulterior, paharul este transferat într-un agitator termostatic. Globulina este îndepărtată prin dializă cu apă distilată. După îndepărtarea globulinei, extractul proteic poate fi prelevat pentru determinarea profilului albuminei și este ajustat ulterior la pI = 3,0 folosind HCl 0,1 M pentru coagularea albuminei. Faza solidă este separată prin centrifugare la 5000g, 20°C și redizolvată în apă deionizată. Coagularea albuminei se efectuează de două ori pentru a crește raportul proteic din concentratul de albumină.
Extracția proteinelor alcaline cu ultrasunete pentru prepararea concentratului de proteine din tărâțe de orez arată că tratamentul cu ultrasunete are ca rezultat un randament mai mare de proteine într-un timp de extracție semnificativ mai scurt – comparativ cu metodele convenționale de extracție.
Protocol de pregătire a probei pentru enzima iNOS funcțională
Pentru a obține enzima iNOS complet funcțională (de exemplu, pentru screening-ul de droguri), se recomandă următorul protocol: Suspensia celulară trebuie plasată pe gheață și este sonicată cu un UP100H la amplitudine 10μm la modul ciclu de 5 sec. sonicare și 25 sec. odihnă pe gheață. Procedura trebuie repetată de aproximativ 3 ori. Timpul de odihnă între ciclurile de sonicare reduce creșterea temperaturii și, prin urmare, va reduce riscul de denaturare.
Solubilizarea proteinelor cu ultrasunete
Sonicare poate accelera procesul de solubilizare a proteinelor, care de obicei necesită câteva ore. Pentru a nu supraîncălzi proba și pentru a preveni degradarea proteinelor și modificările în soluțiile care conțin uree, exploziile cu ultrasunete nu trebuie să dureze mai mult de câteva secunde.
Ultrasonicator UP200Ht cu 2mm microtip S26d2 pentru sonicarea probelor mici.
Echipamente cu ultrasunete pentru extracția proteinelor
Hielscher Ultrasonics oferă o gamă largă de omogenizatoare cu ultrasunete pentru dezintegrarea celulelor, țesuturi, bacterii, microorganisme, drojdie, și spori.
Hielscher ultrasonicators de laborator sunt puternice și ușor de operat. Construite pentru funcționare 24/7, acestea sunt proiectate ca dispozitive robuste și eficiente de laborator și banc. Pentru toate dispozitivele, producția de energie și amplitudinea pot fi controlate cu precizie. Gama largă de accesorii deschide opțiuni suplimentare de configurare. Ultrasonicators digitale, ar fi VialTweeter, UP200Ht, UP200St, și UP400St au un control integrat al temperaturii și un card SD încorporat pentru înregistrarea automată a datelor.
Pentru sonicare indirectă, fără contaminare încrucișată și simultană a mai multor probe, oferim VialTweeter sau CupHorn cu ultrasunete.
Tabelul de mai jos vă oferă o imagine de ansamblu asupra ultrasonicators noastre pentru pregătirea probei, întreruperea celulelor și extracție. Faceți clic pe tipul dispozitivului pentru a obține mai multe informații despre fiecare omogenizator cu ultrasunete. Personalul nostru tehnic bine instruit și cu experiență îndelungată va fi bucuros să vă ajute să alegeți cel mai potrivit ultrasonicator pentru pregătirea probei!
| Volumul lotului | Debitul | Dispozitive recomandate |
|---|---|---|
| până la 10 flacoane sau tuburi | n.a. | VialTweeter |
| plăci multiwell? microtitrare | n.a. | UIP400MTP |
| mai multe tuburi? vase | n.a. | Cuphorn |
| 1 până la 500 ml | 10 până la 200 ml/min | UP100H |
| 10 până la 1000 ml | 20 până la 200 ml? min | UP200Ht, UP200St |
| 10 până la 2000 ml | 20 până la 400 ml? min | UP400St |
În funcție de aplicație, material și volumul eșantionului, vă vom recomanda cea mai potrivită configurare pentru pregătirea probei. Contactați-ne astăzi!
Contactează-ne!? Întreabă-ne!
Hielscher ultrasonicators digitale dispun de o telecomandă browser și protocolare automată a datelor pe un card SD integrat.
VialTweeter pentru sonicare indirectă.
Fapte care merită știute
Proteomică
Proteomica este domeniul de cercetare care investighează proteinele și proteomul. Proteinele îndeplinesc o gamă largă de funcții vitale în organisme. Proteomul este întregul set de proteine exprimate de un genom, celulă, țesut sau organism la un anumit moment. Proteomul variază în funcție de timp și de cerințele distincte sau stresul pe care îl suferă o celulă sau un organism. Mai precis, este setul de proteine exprimate într-un anumit tip de celulă sau organism, la un moment dat, în condiții definite. Termenul este un amestec de proteine și genom. Proteomica este studiul proteomului.
proteină
Proteinele sunt biomolecule mari, așa-numitele macromolecule – care sunt compuse din unul sau mai multe lanțuri lungi de reziduuri de aminoacizi. Proteinele sunt prezente în toate organismele de origine vegetală și animală și sunt cruciale pentru majoritatea funcțiilor biologice. Deoarece proteinele conțin o mulțime de informații biologice, ele sunt extrase în scop analitic, de exemplu pentru cercetarea proteomică. Cea mai importantă funcție efectuată de proteine include cataliza reacțiilor metabolice, replicarea ADN-ului, răspunsul la stimuli și transportul moleculelor dintr-o locație în alta. Proteinele diferă una de alta în primul rând prin secvența lor de aminoacizi, care este dictată de secvența nucleotidică a genelor lor și care, de obicei, duce la plierea proteinelor într-o structură tridimensională specifică care determină activitatea sa. Proteinele sunt – pe lângă peptide – una dintre componentele cheie ale alimentelor. Prin urmare, proteomica este un instrument puternic în știința alimentelor pentru a optimiza procesele, siguranța alimentară și evaluarea nutrițională.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction este o procedură preanalitică pentru separarea și preconcepția analiților. În combinație cu ultrasonication, extracția punctului de nori poate fi intensificată, făcând procesul mai eficient, mai rapid și mai ecologic. Cu ultrasonication, extracția punctului de nori este o metodă semnificativ mai eficientă de preparare a analitului. Citiți mai multe despre extracția punctului de nori asistată ultrasonically!Electroforeza în gel
Electroforeza în gel este principala metodă de separare și analiză a macromoleculelor, cum ar fi ADN-ul, ARN-ul și proteinele, precum și fragmentele acestora, pe baza dimensiunii și sarcinii lor. Este utilizat în chimia clinică pentru a separa proteinele după sarcină și? sau dimensiune (agaroză IEF, în esență independentă de dimensiune) și în biochimie, biologie moleculară și proteomică pentru a separa o populație mixtă de fragmente de ADN și ARN după lungime, pentru a estima dimensiunea fragmentelor de ADN și ARN sau pentru a separa proteinele prin sarcină.
culturi celulare
Cultura celulară este procesul de creștere controlată prin care celulele sunt cultivate în condiții controlate. Condițiile de cultură celulară variază pentru fiecare tip de celulă. În general, mediul unei culturi celulare constă dintr-un vas adecvat (de exemplu, vas Petri) cu substrat sau mediu care furnizează substanțele nutritive esențiale (aminoacizi, carbohidrați, vitamine, minerale), factori de creștere, hormoni și gaze (CO2, O2) și reglează mediul fizico-chimic (tampon de pH, presiune osmotică, temperatură). Majoritatea celulelor au nevoie de un substrat de suprafață sau artificial, în timp ce alte culturi celulare pot fi cultivate plutind liber în mediul de cultură (cultură în suspensie, suspensie celulară).
Culturile de masă ale liniilor celulare animale sunt utilizate în producția industrială de vaccinuri virale și alte produse derivate biotehnologic. Celulele stem umane sunt cultivate pentru a extinde numărul de celule și pentru a diferenția celulele în diferite tipuri de celule somatice în scopuri de transplant.
Probe de țesut
Termenul țesut descrie un intermediar celular, unde materialul celular se află la nivel organizațional între celule și un organ complet. În țesut, sunt asamblate celule similare, de aceeași origine, care împreună îndeplinesc o funcție specifică. Prin gruparea funcțională a mai multor țesuturi, se formează structurile complexe ale organelor.
Țesutul este eșantionat pentru cercetare în biologie, histologie? histopatologie, parazitologie, biochimie, imunohistochimie, precum și pentru cultivarea și extragerea ADN-ului. Se poate distinge între animal (subdiviziune: țesut mamifer) și țesut vegetal. Țesuturile animale sunt grupate în patru tipuri de bază de țesut conjunctiv, muscular, nervos și epitelial. Țesutul vegetal este împărțit în următoarele trei sisteme de țesuturi: epiderma, țesutul măcinat și țesutul vascular.
Probele de țesut pot fi preparate din părți animale sau vegetale, de exemplu oase, mușchi, frunze etc.
Fluide corporale
Sângele, serul, plasma, lichidul cefalorahidian, saliva și lichidul sinovial sunt fluide corporale, care oferă o sursă excelentă de informații relevante din punct de vedere diagnostic. Prin urmare, o pregătire sofisticată a probelor de lichid corporal pentru analiză este importantă. Prima dificultate este asociată cu gama dinamică largă de componente prezente în fluidele corporale.
Determinarea concentrației de proteine
Testul Bradford, testul Lowry și testul acidului bicinchoninic (BCA) sunt teste comune pentru determinarea concentrației de proteine. Albumina serică bovină (BSA) este unul dintre cele mai frecvent utilizate standarde proteice.
tampon de liză
Tamponul de liză trebuie ales în funcție de materialul celular sau de țesut (cultură de țesuturi, plante, bacterii, ciuperci etc.) și dacă celulele se află într-o structură și tipul de structură. O gamă largă de soluții tampon de liză pentru extracția proteinelor, membranelor și organitelor sunt formulate cu unul sau mai mulți detergenți. Detergentul este de obicei selectat prin teste de încercare și eroare sau – dacă este disponibil – conform unui protocol existent de extracție a proteinelor. Detergentul trebuie să fie compatibil cu sursa de țesut și cu proteinele. În general, cel mai blând detergent care funcționează pentru un țesut? proteină specific, este ales pentru a menține funcționalitatea maximă a extractului. În plus, în cazul unei extracții de membrane și organite, un detergent ușor păstrează membrana intactă. Detergenții utilizați în mod obișnuit în tampoanele de liză sunt în mare parte neionici sau zwitterionici, de exemplu CHAPS, deoxicolat, Triton™ X-100, NP40 și Tween 20.
De exemplu, țesuturi precum creierul, ficatul, intestinul, rinichii, splina etc. pot fi pur și simplu tamponate cu RIPA – cu toate acestea, trebuie incluși inhibitorii de protează și TDT (de exemplu, pentru electroforeza în gel).
Tampon de liză pentru țesutul muscular scheletic (rece ca gheața): 20 mM Tris (pH 7,8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1% Triton X-100, 10% (g/v) glicerol, 1 mM EDTA, 1 mM ditiotreitol suplimentat cu cocktail inhibitor de protează și fosfatază
Tabelul soluțiilor tampon comune și intervalul lor de pH. În general, aceste soluții tampon sunt utilizate în mod normal la concentrații de 20-50 mM.
| tampon | Interval pH |
|---|---|
| Acid citric – NaOH | 2.2 – 6.5 |
| Citrat de sodiu – Acid citric | 3.0 – 6.2 |
| Acetat de sodiu – acid acetic | 3.6 – 5.6 |
| Sare de sodiu a acidului cacodilic – Hcl | 5.0 – 7.4 |
| MES – NaOH | 5.6 – 6.8 |
| Dihidrogenofosfat de sodiu – hidrogenofosfat disodic | 5.8 – 8.0 |
| imidazol – Hcl | 6.2 – 7.8 |
| PERII – KOH | 6.6 – 7.8 |
| Clorhidrat de trietanolamină – NaOH | 6.8 – 8.8 |
| Tris – Hcl | 7.0 – 9.0 |
| HEPES – NaOH | 7.2 – 8.2 |
| Tricină – NaOH | 7.6 – 8.6 |
| Tetraborat de sodiu – acid boric | 7.6 – 9.2 |
| Bicină – NaOH | 7.7 – 8.9 |
| glicină – NaOH | 8.6 – 10.6 |
Majoritatea tampoanelor prezintă o dependență de pH cu temperatura. Acest lucru este valabil mai ales pentru tampoanele Tris. pKa se modifică de la 8,06 la 25°C la 8,85 la 0°C.
(pH-ul și pKa unui tampon: pH-ul măsoară concentrația ionilor de hidrogen într-o soluție apoasă. pKa (= constanta de disociere acidă) este o măsură înrudită, dar mai specifică, prin faptul că ajută la prezicerea modului în care o moleculă va acționa la o anumită valoare a pH-ului.)
TRIzol
TRIzol este o soluție chimică utilizată pentru extragerea ARN/ADN/proteine în timpul extracției cu tiocianat-fenol-cloroform de guanidiniu. Utilizarea extracției TRIzol asistată ultrasonically are ca rezultat un ADN ridicat, ARN și randamente de proteine din aceeași probă și excelează astfel alte metode de extracție.
Literatură/Referințe
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.