Liza cu ultrasunete a E. coli
- Bacteriile E. coli sunt cele mai frecvent utilizate bacterii în microbiologie și biotehnologie.
- Perturbatorii de celule cu ultrasunete oferă rezultate fiabile și reproductibile pentru liza E. coli.
- Forțele de cavitație și forfecare intense, dar precis controlabile, au ca rezultat o perturbare completă și randamente ridicate de extracție (de exemplu, proteine, ADN).
De ce este perturbarea celulelor cu ultrasunete de E. coli metoda preferată?
Omogenizatoare cu ultrasunete sau ultrasonicators tip sondă oferă mai multe avantaje pentru liza E. coli, deoarece ultrasunetele intense perturbă eficient pereții celulari și membranele. Sonda de tip ultrasonicators sunt utilizate pe scară largă pentru liza E. coli din următoarele motive:
Extracția proteinelor din celulele E. coli se realizează eficient cu sondă cu ultrasunete UP200St
Sonda de tip ultrasonicator oferă multe avantaje pentru liza E. coli. Controlul fiabil și precis asupra parametrilor procesului cu ultrasunete permite optimizarea parametrilor de funcționare, ar fi puterea, durata și manipularea probei pentru a obține rezultatele dorite.
Analize electroforetice ale ADN-ului genomic de E. coli EDL933 supuse la 0 – 15 min ultrasonication. L indică scara ADN.
(studiu și imagine: ©Basselet et al. 2008)
Perturbarea celulelor folosind cavitație cu ultrasunete
Omogenizatoare de tip sondă cu ultrasunete funcționează cu aproximativ 20.000 de cicluri pe secundă (la 20kHz) și provoacă cavitație în lichide sau suspensii. Cavitație acustică: zone microscopice cu presiuni asemănătoare vidului și temperaturi ridicate care sfâșie celulele. Deși temperaturile pot ajunge la câteva mii de grade Celsius, volumele de cavitație sunt atât de mici încât nu încălzesc semnificativ procesul. Cavitația acustică generată cu ultrasunete și forțele de forfecare perforează sau rup membrana celulară a celulelor bacteriene, cum ar fi E. coli. Hielscher ultrasonicators permite controlul precis asupra parametrilor procesului, ar fi intensitatea cu ultrasunete, amplitudinea, intrarea de energie, și temperatura. Astfel, procesul de liză cu ultrasunete poate fi ajustat optim la tipul de celulă, cultura celulară, și scopul procesului.
- control precis al lizei (intensitate, amplitudine, temperatură)
- rezultate fiabile, reproductibile
- adaptare optimă la probe specifice
- controlul temperaturii
- pentru eșantioane foarte mici până la foarte mari (μL până la litri)
- Tratament pur mecanic
- operare ușoară și sigură
- Scalare liniară de la laborator la producție
VialTweeter pentru liza cu ultrasunete
Omogenizator cu ultrasunete vs alte tehnici de liză
În timp ce liza chimică și enzimatică poate fi problematică – Deoarece liza chimică poate modifica structurile proteice și poate introduce probleme de purificare și liza enzimatică necesită timpi lungi de incubație și nu este reproductibilă – Perturbarea cu ultrasunete este o metodă sofisticată, rapidă de întrerupere a celulelor.
Liza cu ultrasunete se bazează numai pe forțele mecanice. Nu se adaugă substanțe chimice, sonicare sparge peretele celular prin forțe de forfecare. Liza chimică poate modifica structura proteinelor și poate introduce probleme de purificare. Perturbarea enzimatică necesită timpi lungi de incubație și nu este reproductibilă. Întreruperea celulelor cu ultrasunete a celulelor bacteriene E. coli este rapidă, simplă, fiabilă și reproductibilă. Acesta este motivul pentru ultrasonicators Hielscher sunt utilizate în laboratoarele biologice și biochimice din întreaga lume pentru pregătirea probei, pre-ananalitice, diagonstică in vitro și teste multiple.
Recomandări generale pentru liza cu ultrasunete
Sonicare este cea mai populară tehnică pentru liza cantități foarte mici, medii și mari de suspensii celulare – de la pico litri până la 100L / oră (folosind o celulă de flux cu ultrasunete). Celulele sunt lizate prin forfecare lichidă și cavitație. ADN-ul este, de asemenea, forfecat în timpul sonicare, deci nu este necesar să se adauge DNase la suspensia celulară.
Controlul temperaturii în timpul lizei cu ultrasunete E. coli
Prin pre-răcirea probei și păstrarea probei în timpul sonicare pe gheață, degradarea termică a probei poate fi ușor prevenită.
În mod ideal, probele ar trebui păstrate reci ca gheața în timpul lizei, dar pentru majoritatea probelor este suficient ca temperatura să nu crească peste temperatura culturii sau a sursei de țesut. Prin urmare, se recomandă, pentru a menține suspensia pe gheață și pentru a sonicate cu mai multe impulsuri scurte cu ultrasunete de 5-10 sec și pauze de 10-30 sec. În timpul pauzelor, căldura se poate disipa pentru a restabili o temperatură scăzută. Pentru probe de celule mai mari, sunt disponibile diferite reactoare cu celule de flux cu mantale de răcire.
Citiți aici sfaturi detaliate și recomandări pentru o liză cu ultrasunete de succes!
Protocoale pentru prepararea cu ultrasunete a E. coli lizați
Cercetătorii folosesc omogenizatoare cu ultrasunete Hielscher pentru perturbarea celulelor E.coli. Mai jos puteți găsi diverse protocoale testate și dovedite pentru liza E. coli folosind omogenizatoare cu ultrasunete Hielscher pentru diverse aplicații legate de E. coli.
Creșterea celulelor, reticulare și pregătirea extractelor de celule E. coli folosind ultrasunete
Pentru SeqA și ARN polimerază ChIP-Chip E. coli MG1655 sau MG1655 ΔseqA a fost crescut la 37 ° C la o DO600 de aproximativ 0,15 în 50 ml LB (+ 0,2% glucoză) înainte de adăugarea a 27 μl formaldehidă (37%) pe ml mediu (concentrație finală 1%). Reticularea a fost efectuată la agitare lentă (100 rpm) la temperatura camerei timp de 20 de minute, urmată de stingerea cu 10 ml de glicină 2,5 M (concentrație finală 0,5 M). Pentru experimentele cu șoc termic, E. coli MG1655 a fost cultivat în 65 ml mediu LB la 30 ° C la o DO600 de aproximativ 0,3. Ulterior, 30 ml de cultură au fost transferați într-un balon preîncălzit la 43 °C, iar restul păstrat la 30 °C. Reticularea și stingerea au fost cele descrise mai sus, cu excepția faptului că celulele au fost ținute la 30 sau 43 °C timp de 5 minute înainte de agitarea lentă la temperatura camerei. Celulele au fost colectate prin centrifugare și spălate de două ori cu TBS rece (pH7,5). După resuspensia în 1 ml tampon de liză (10 mM Tris (pH 8.0), 20% zaharoză, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg / ml lizozimă) și incubare la 37 ° C timp de 30 min urmată de adăugarea de 4 ml tampon IP, celulele au fost sonicated pe gheață cu 12 ori 30 sec și 30 sec pauze folosind procesorul cu ultrasunete Hielscher UP400St la setarea puterii 100%. După centrifugare timp de 10 minute la 9000 g, se păstrează 800 μl de părți alicote ale supernatantului la -20°C. (Waldminghaus 2010)
Supraproducția și purificarea enzimelor cu o sondă cu ultrasunete
Pentru supraproducția proteinelor marcate cu decahistidină (His10), E. coli BL21 (DE3) a fost transformată cu construcții pET19b. O precultură peste noapte a fost recoltată prin centrifugare, iar 1% a fost utilizată pentru a inocula o cultură de expresie. Celulele purtătoare de pET19mgtB au fost crescute la 22 ° C până la o densitate optică la 600 nm (OD600) de 0,7. Cultura a fost transferată la 17°C și indusă de 100 μM IPTG. După 16 ore, cultura a fost recoltată prin centrifugare la 7.500 × g la 4°C. Celulele au fost resuspendate în 50 mM soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) cu 0,3 M NaCl la pH 7,4 și perturbate de ultrasonication cu un sonotrod micro-tip S2 la ultrasonicator Hielscher UP200St la un ciclu de 0,5 și o amplitudine de 75%.
Supraproducția de GtfC marcat cu decahistidină a fost indusă la 37°C la o DO600 de 0,6 cu IPTG de 100 μM. Celulele au fost apoi incubate timp de 4 ore, recoltate și lizate așa cum s-a menționat mai sus pentru MgtB.
Extractele de celule brute au fost centrifugate la 15.000 × g și 4 ° C pentru a sedimenta resturile celulare. Extractele limpezite au fost încărcate pe coloane HisTrap FF Crude de 1 ml folosind un sistem ÄKTAprime Plus. Enzimele au fost purificate în conformitate cu protocolul producătorului pentru eluția gradientului proteinelor etichetate de His. Soluțiile proteice eluate au fost dializate de două ori împotriva a 1.000 de volume de PBS de 50 mM, pH 7,4, cu 0,3 M NaCl la 4°C. Purificarea a fost analizată de 12% SDS-PAGE. Concentrația de proteine a fost determinată prin metoda Bradford folosind Roti-Quant. (Rabausch și colab. 2013)
Extracția cu ultrasunete a proteinelor din bacteriile E. coli
O proteină momeală de interes (în acest caz, MTV1 de Arabidopsis thaliana) este fuzionată cu o etichetă GST și exprimată în celule BL21 Escherichia coli (E. coli).
- Se ia o granulă de GST-MTV1 și GST (corespunzătoare la 50 ml cultură bacteriană) și se omogenizează fiecare în 2,5 ml soluție tampon de extracție la rece cu gheață.
- Utilizați un ultrasonicator UP100H (echipat cu MS3 microtip-sonotrode pentru volume mici de aproximativ 2-5ml) pentru a perturba celulele bacteriene până când acestea sunt lizate, ceea ce este indicat de opacitate redusă și vâscozitate crescută. Acest lucru trebuie să fie efectuate pe gheață, și se recomandă să sonicate în intervale (de exemplu, 10 sec sonicare urmată de 10 sec pauză pe gheață și așa mai departe). Trebuie avut grijă să nu sonicate cu intensitate prea mare. Dacă se detectează spumarea sau formarea unui precipitat alb, intensitatea trebuie redusă.
- Se transferă soluția de bacterii lizate în tuburi de microcentrifugă de 1,5 ml și se centrifughează la 4°C, 16.000 x g timp de 20 de minute.
Ultrasonicators de tip sondă, ar fi UP400St utilizarea principiului de lucru al cavitației acustice pentru liza eficientă a E. coli.
Analiza expresiei și purificarea proteinei recombinante folosind sonicare
Peleta E. coli a fost sonicated cu ultrasonicator Hielscher UP100H. În acest scop, peletele celulare au fost resuspendate într-un tampon de liză răcit (50 mM Tris-HCl pH = 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) și răcite pe gheață timp de 10 minute. Apoi, suspensia celulară a fost sonicated cu 10 explozii scurte de 10 s urmate de interval de 30 s pentru răcire. În cele din urmă, resturile celulare au fost îndepărtate prin ultracentrifugare la 4 ° C timp de 15 minute la 14000 rpm. Pentru confirmarea expresiei rPR, supernatantul a fost rulat pe gel de poliacrilamidă 12% și analizat prin SDS-PAGE și Western blotting. Purificarea rPR s-a făcut folosind rășină Ni2+-NTA (Invitrogen, SUA) conform ghidului producătorului. În această etapă, a fost utilizată metoda de purificare nativă. Puritatea proteinei purificate a fost evaluată prin electroforeză pe gelul de poliacrilamidă 12% și colorarea ulterioară cu albastru de Coomassie. Concentrația de proteine purificate a fost măsurată cu ajutorul kitului de testare a proteinelor Micro BCA (PIERCE, SUA). (Azarnezhad și colab., 2016)
Omogenizatoare cu ultrasunete pentru liza E. coli
Hielscher Ultrasonics proiectează, produce și furnizează omogenizatoare cu ultrasunete de înaltă performanță pentru liza fiabilă și eficientă a bacteriilor E. coli și a altor tipuri de celule, țesuturi și culturi celulare.
Portofoliul larg de sonde cu ultrasunete, precum și sisteme indirecte de sonicare ne permite să vă oferim omogenizatorul de țesut cu ultrasunete ideal pentru întreruperea celulelor și aplicația de extracție.
Proiectare, fabricație și consultanță – Calitate Made in Germany
Hielscher ultrasonicators sunt bine-cunoscute pentru cele mai înalte standarde de calitate și design. Software-ul inteligent, meniul intuitiv, setările programabile și protocolarea automată a datelor sunt doar câteva caracteristici ale ultrasonicators Hielscher. Robustețea și funcționarea ușoară permit integrarea fără probleme a ultrasonicators noastre în facilități de cercetare și biotehnologie. Chiar și condițiile dure și mediile solicitante sunt ușor de manipulat de ultrasonicators Hielscher.
Hielscher Ultrasonics este o companie certificată ISO și pune un accent deosebit pe ultrasonicators de înaltă performanță cu tehnologie de ultimă oră și ușurință în utilizare. Desigur, ultrasonicators Hielscher sunt conforme CE și îndeplinesc cerințele UL, CSA și RoHs.
Tabelul de mai jos vă oferă o indicație a capacității aproximative de procesare a ultrasonicators noastre:
| Volumul lotului | Debitul | Dispozitive recomandate |
|---|---|---|
| plăci multi-godeu / microtitrare | n.a. | UIP400MTP |
| CupHorn pentru flacoane sau pahar | n.a. | CupHorn cu ultrasunete |
| reactor cu ultrasunete micro-flux | n.a. | GDmini2 |
| până la 10 flacoane a câte 0,5 până la 1,5 ml | n.a. | VialTweeter |
| 00,5 până la 1,5 ml | n.a. | VialTweeter |
| 1 până la 500 ml | 10 până la 200 ml/min | UP100H |
| 10 până la 2000 ml | 20 până la 400 ml / min | UP200Ht, UP400St |
| 0.1 până la 20L | 00.2 până la 4L / min | UIP2000hdT |
| 10 până la 100L | 2 până la 10L / min | UIP4000 |
| n.a. | 10 până la 100L / min | UIP16000 |
| n.a. | mai mare | grup de UIP16000 |
Contactează-ne! / Întreabă-ne!
Protocoale suplimentare pentru liza cu ultrasunete E. coli
Proteine modificate cu alicină în E. coli folosind un VialTweeter cu ultrasunete
Determinarea conținutului de sulfhidril prin testul 5,5′-ditiois (acid 2-nitrobenzoic) (DTNB)
O cultură nocturnă de E. coli MG1655 a fost utilizată pentru a inocula mediul minim MOPS (1:100). Cultura a fost cultivată aerob până când s-a ajuns la un A600 de 0,4. Cultura a fost împărțită în trei culturi de 15 ml pentru tratamentul stresului. O cultură netratată a servit ca un control negativ. 0,79 mM alicină (128 μg ml-1) sau 1 mM diamidă a fost adăugată la una dintre cele două culturi rămase fiecare. Culturile au fost incubate timp de 15 min. 5 ml din fiecare cultură au fost recoltați prin centrifugare (8.525 × g, 4°C, 10 min). Celulele au fost spălate de două ori cu 1 ml de PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4, depozitate anaerob înainte de utilizare) și centrifugate (13.000 × g, 4°C, 10 min). Celulele au fost resuspendate în tampon de liză (PBS cu 6 mM guanidinium HCl, pH 7,4) înainte de întreruperea la 4 ° C prin ultrasonication (VialTweeter ultrasonicator, Hielscher GmbH, Germania) (3 × 1 min). Resturile celulare au fost peletizate prin centrifugare (13.000 × g, 4 °C, 15 min). Supernatantul a fost transferat într-o cuvă QS-macro de 3,5 ml (10 mm) cu o bară magnetică de agitare și amestecat cu 1 ml tampon de liză. Extincția probelor a fost monitorizată la 412 nm cu un spectrofotometru Jasco V-650 echipat cu suportul pentru celule cu temperatură controlată PSC-718 la temperatura camerei. S-au adăugat 100μl dintr-o soluție 3 mM de ditiois (acid 2-nitrobenzoic). Extincția a fost monitorizată până când a ajuns la saturație. Calculul concentrației de tiol a fost efectuat utilizând coeficientul de extincție ε412 = 13.700 M-1 centimetru-1 pentru acidul tio-2-nitrobenzoic (TNB). Concentrațiile celulare de tiol au fost calculate pe baza unui volum de celule E. coli de 6,7 × 10-15 litru și o densitate celulară de A600 = 0,5 (echivalent cu 1 × 108 celule ml-1 cultură). (Müller și colab. 2016)
Determinarea glutationului in vivo folosind un concasor de celule cu ultrasunete
E. coli MG1655 a fost cultivat în mediu minim MOPS într-un volum total de 200 ml până când s-a ajuns la un A600 de 0,5. Cultura a fost împărțită în culturi de 50 ml pentru tratamentul stresului. După 15 minute de incubare cu 0,79 mM alicină, 1 mM diamidă sau dimetilsulfoxid (control), celulele au fost recoltate la 4.000 g la 4 ° C timp de 10 minute. Celulele au fost spălate de două ori cu tampon KPE înainte de resuspensia peleților în 700μl de tampon KPE. Pentru deproteinare, 300l de 10% (w / v) acid sulfosalicilic au fost adăugate înainte de întreruperea celulelor prin ultrasonication (3 x 1 min; VialTweeter ultrasonicator). Supernatanții au fost colectați după centrifugare (30 min, 13.000g, 4°C). Concentrațiile de acid sulfosalicilic au scăzut la 1% prin adăugarea a 3 volume de tampon KPE. Măsurătorile glutationului total și GSSG au fost efectuate conform descrierii de mai sus. Concentrațiile celulare de glutation au fost calculate pe baza unui volum de celule E. coli de 6,7×10-15 litru și o densitate celulară de A600 0,5 (echivalent cu 1×108 celule ml-1 cultură). Concentrațiile de GSH au fost calculate prin scăderea a 2[GSSG] din glutationul total. (Müller și colab. 2016)
Expresia mAspAT uman în E. coli folosind un omogenizator cu ultrasunete
Singura colonie de E. coli BL21 (DE3) care conține vectorul de expresie în 30 ml de mediu Luria-Bertani (LB) conținând 100μg/ml ampicilină și apoi cultivată la 37 °C până la densitatea optică (DO600) a ajuns la 0,6. Celulele au fost recoltate prin centrifugare la 4.000 × g timp de 10 minute și resuspendate în mediu proaspăt LB 3L conținând 100μg / ml ampicilină.
Ulterior, expresia proteinelor a fost indusă cu izopropil 1 mM β-ᴅ-1-tiogalactopiranozidă (IPTG) timp de 20 h la 16ºC. Celulele au fost recoltate prin centrifugare la 8.000 × g timp de 15 min și spălate cu tampon A (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4). Aproximativ 45g (greutate umedă) celule au fost obținute din cultura de 3 L. După centrifugare, peletele celulare au fost resuspendate în 40 ml (pentru cultura 1 L) tampon de extracție rece ca gheața A și lizate prin ultrasonication la temperatura rece ca gheața folosind concasorul de celule cu ultrasunete Hielscher UP400St. Liza celulară a fost centrifugată la 12.000 rpm timp de 15 minute pentru a separa fracțiunile solubile (supernatante) și precipitate (pelete). (Jiang și colab. 2015)
Fapte care merită știute
E.coli
Escherichia coli (E. coli) este o bacterie coliformă gram-negativă, facultativ anaerobă, în formă de tijă, din genul Escherichia, care se găsește în mod obișnuit în intestinul inferior al organismelor cu sânge cald (endoterme). Există un număr mare de tulpini (sau subtipuri) de E. coli cu caracteristici diverse. Majoritatea tulpinilor de E. coli sunt inofensive pentru oameni, de exemplu tulpinile B și K-12 care sunt utilizate în mod obișnuit pentru aplicații de cercetare în laboratoare. Cu toate acestea, unele tulpini sunt dăunătoare și pot provoca boli grave.
E. coli joacă un rol important în ingineria biologică modernă și microbiologia industrială, deoarece bacteriile sunt ușor de manipulat. Aplicații comune de laborator care implică adesea utilizarea E. coli, de exemplu pentru a crea acid dezoxiribonucleic recombinant (ADN) sau pentru a acționa ca organism model.
E. coli este o gazdă foarte versatilă pentru producerea de proteine heterologe, iar sistemele multiple de expresie a proteinelor sunt disponibile pentru a produce proteine recombinante în E. coli. Folosind plasmide care permit exprimarea la nivel înalt a proteinelor, genele pot fi introduse în bacterii, ceea ce permite producerea unor astfel de proteine în cantități mari în procesele de fermentare industrială.
E. coli sunt folosite ca fabrici de celule pentru a produce insulină. Alte aplicații includ utilizarea celulelor modificate de E. coli pentru a dezvolta și produce vaccinuri și enzime imobilizate, pentru a produce biocombustibili, precum și pentru bioremediere.
Tulpina K-12 este o formă mutantă de E. coli care supra-exprimă enzima fosfatază alcalină (ALP). Această mutație apare din cauza unui defect al genei care codifică în mod constant enzima. Dacă o genă produce un produs fără inhibiție, aceasta este cunoscută sub numele de activitate constitutivă. Această formă mutantă specifică este utilizată pentru izolarea și purificarea enzimei ALP.
Bacteriile E. coli sunt, de asemenea, utilizate pe scară largă ca fabrici de celule. Microbii proiectați (de exemplu, bacteriile) și celulele vegetale pot fi folosite ca așa-numite fabrici de celule. Aceste celule modificate genetic produc molecule, substanțe chimice, polimeri, proteine și alte substanțe, care sunt utilizate, de exemplu, în industria farmaceutică, alimentară și chimică. Pentru a elibera moleculele produse în interiorul unor astfel de celule bioengineered, liza cu ultrasunete este o metodă comună de a perturba pereții celulari și de a transfera substanțele țintă în lichidul înconjurător. Citiți mai multe despre liza celulelor bioinginerizate!
Forfecare ADN cu ultrasunete
Forțele de forfecare cu ultrasunete sunt o metodă frecvent utilizată pentru a elibera molecule, organite și proteine din interiorul celulei, precum și pentru a rupe firele de ADN în bucăți. Cavitația acustică sparge pereții celulari și membranele pentru a extrage ADN-ul din celule și a genera fragmente de aproximativ 600 – 800 bp în lungime, care este ideal pentru analiză.
Click aici pentru a afla mai multe despre omogenizatoare cu ultrasunete pentru fragmentarea ADN-ului!
Literatură / Referințe
- Azarnezhad A., Sharifi Z., Seyedabadi R., Hosseini A., Johari B., Sobhani Fard M. (2016): Cloning and Expression of Soluble Recombinant HIV-1 CRF35 Protease-HP Thioredoxin Fusion Protein. Avicenna J Med Biotechnol. 8(4), 2016. 175–181.
- Jiang X., Wang J., Chang H.; Zhou Y. (2016): Recombinant expression, purification and crystallographic studies of the mature form of human mitochondrial aspartate aminotransferase. BioScience Trends 2016.
- Müller A., Eller J., Albrecht F., Prochnow P., Kuhlmann K., Bandow J.E., Slusarenko A.J., Leichert L.I.O. (2016): Allicin Induces Thiol Stress in Bacteria through S-Allylmercapto Modification of Protein Cysteines. Journal of Biological Chemistry Vol. 291, No. 22, 2016. 11477–11490.
- Rabausch U., Juergensen J., Ilmberger N., Böhnke S., Fischer S., Schubach B., Schulte M., Streit W. R. (2013): Functional Screening of Metagenome and Genome Libraries for Detection of Novel Flavonoid-Modifying Enzymes. Applied and Environmental Microbiology 79(15), 2013. 4551–4563.
- Sauer M. (2014): MTV1 Pull-down Assay in Arabidopsis. bio-protocol Vol 4, Iss 12, Jun 20, 2014.
- Waldminghaus T., Skarstad K. (2010): ChIP on Chip: surprising results are often artifacts. BMC Genomics 11, 2010. 414.
Hielscher Ultrasonics produce omogenizatoare cu ultrasunete de înaltă performanță de la Laborator spre dimensiunea industrială.