Liza cu ultrasunete a E. Coli

Bacteriile E. coli sunt cele mai frecvent utilizate bacterii în microbiologie și biotehnologie.
Dezintegratoarele celulare cu ultrasunete oferă rezultate fiabile și reproductibile pentru liza E. coli.
Forțele de cavitație și de forfecare intense, dar precis controlabile, au ca rezultat dezintegrarea completă și randamente ridicate de extracție (de ex. proteine, ADN).

De ce este dezintegrarea celulelor de E. coli cu ultrasunete metoda preferată?

Omogenizatoarele cu ultrasunete sau ultrasonicatoarele cu sondă oferă mai multe avantaje pentru liza E. coli, deoarece ultrasunetele intense dezintegrează eficient pereții și membranele celulare. Ultrasonicatoarele cu sondă sunt utilizate pe scară largă pentru liza E. coli din următoarele motive:

Dezintegrarea eficientă a pereților celulari: E. coli are un perete celular semirigid compus din peptidoglican, care poate fi dificil de rupt prin metodele tradiționale de liză. Un ultrasonicator cu sondă generează unde ultrasonice intense care creează bule de cavitație în lichidul din jurul celulelor. Când aceste bule implodează, ele generează jeturi de lichid de mare viteză și unde de șoc care duc la dezintegrarea mecanică a pereților celulari, eliberând eficient conținutul celular, cum ar fi biomoleculele.

Penetrare îmbunătățită: Undele ultrasonice generate de sondă / sonotrodă pot pătrunde adânc în probă, ajungând la un număr mai mare de celule de E. coli și tratându-le uniform. Acest lucru contribuie la asigurarea unei lize mai uniforme în întreaga probă, rezultând o eficiență mai mare a dezintegrării celulelor.

Timp de procesare redus: Energia furnizată de ultrasonicatorul cu sondă este foarte concentrată și localizată, ceea ce duce la o liză celulară rapidă și eficientă. Comparativ cu alte metode, precum agitarea cu bile (bead beating) sau liza enzimatică, sonicarea poate realiza liza E. coli în câteva minute sau chiar secunde. În timp ce multe tehnici alternative, cum ar fi congelarea-decongelarea, necesită mai multe runde de tratament, liza cu ultrasunete deschide celulele într-o singură etapă de proces.

Controlul temperaturii: Ultrasonicatoarele de ultimă generație sunt echipate cu senzori de temperatură și software inteligent, care permite setarea unei temperaturi maxime de proces. Ultrasonicatorul intră automat în pauză când este atinsă limita de temperatură și pornește procesul de sonicare când este atins un punct de temperatură setat. Răcirea probelor într-o baie de gheață este o metodă simplă de a menține temperatura probei scăzută și de a preveni degradarea probei indusă de căldură.

Scalabilitate: Ultrasonicatoarele cu sondă sunt disponibile în diverse dimensiuni, de la dispozitive ținute în mână până la modele industriale de mari dimensiuni. Acest lucru le face potrivite pentru procesarea volumelor mici în laborator sau pentru extinderea la scară pentru aplicații de bioprocesare mai mari, de ex. producția de vaccinuri sau biosinteza moleculelor.

Versatilitate: Ultrasonicatoarele pot fi utilizate pentru diverse aplicații dincolo de liza celulară, cum ar fi forfecarea ADN-ului, extracția proteinelor, omogenizarea țesuturilor, dispersarea nanoparticulelor și emulsificarea. Prin urmare, investiția într-un ultrasonicator cu sondă oferă versatilitate în mediile de cercetare sau industriale.

Ultrasonicatoarele cu sondă, precum UP200St, sunt omogenizatoare de țesuturi și dispozitive de dezintegrare celulară fiabile, fiind de aceea utilizate pe scară largă pentru pregătirea probelor în genetică, de ex. pentru liza E.coli

Extracția proteinelor din celulele de E.coli se realizează eficient cu sonicatorul cu sondă UP200St

Ultrasonicatorul cu sondă oferă numeroase avantaje pentru liza E. coli. Controlul fiabil și precis al parametrilor procesului ultrasonic permite optimizarea parametrilor de operare, cum ar fi puterea, durata și manipularea probei, pentru a obține rezultatele dorite.

Acest tutorial explică ce tip de sonicator este cel mai potrivit pentru operațiunile de pregătire a probelor, precum liza, dezintegrarea celulară, izolarea proteinelor și fragmentarea ADN-ului și ARN-ului în laboratoare, analiză și cercetare. Alegeți tipul de sonicator ideal pentru aplicația dumneavoastră, volumul probelor, numărul de probe și capacitatea de procesare. Hielscher Ultrasonics are omogenizatorul ultrasonic ideal pentru dumneavoastră!

Fragmentarea ADN-ului cu ultrasunete este utilizată frecvent ca etapă de pregătire a probelor în secvențierea de nouă generație (NGS)

Analize electroforetice ale ADN-ului genomic de E. coli EDL933 supus ultrasonicării timp de 0 – 15 min. L indică scara ADN (DNA Ladder).
(studiu și imagine: ©Basselet et al. 2008)

Dezintegrarea celulelor prin cavitație ultrasonică

Omogenizatoarele cu ultrasunete de tip sondă funcționează la aprox. 20.000 de cicluri pe secundă (la 20kHz) și provoacă cavitație în lichide sau suspensii. Cavitația acustică creează zone microscopice cu presiuni asemănătoare vidului și temperaturi ridicate, care rup celulele. Deși temperaturile pot atinge câteva mii de grade Celsius, volumele de cavitație sunt atât de mici încât nu încălzesc procesul în mod semnificativ. Cavitația acustică și forțele de forfecare generate de ultrasunete perforează sau rup membrana celulară a celulelor bacteriene, cum ar fi E.coli. Ultrasonicatoarele Hielscher permit controlul precis al parametrilor de proces, precum intensitatea ultrasonică, amplitudinea, aportul de energie și temperatura. Astfel, procesul de liză cu ultrasunete poate fi ajustat optim în funcție de tipul de celule, cultura celulară și obiectivul procesului.

Avantajele lizei cu ultrasunete

control precis al lizei (intensitate, amplitudine, temperatură)
rezultate fiabile, reproductibile
adaptare optimă la probe specifice
controlul temperaturii
pentru probe de la foarte mici la foarte mari (µL până la litri)
tratament pur mecanic
operare sigură, ușor de utilizat
extindere liniară la scară, de la laborator la producție

Dispozitivul cu ultrasunete VialTweeter permite pregătirea simultană a probelor din până la 10 flacoane în aceleași condiții de proces. (Faceți clic pentru a mări!)

VialTweeter pentru liza cu ultrasunete

Omogenizatorul cu ultrasunete comparativ cu alte tehnici de liză

Deși liza chimică și cea enzimatică pot fi problematice – deoarece liza chimică poate modifica structurile proteice și poate introduce probleme de purificare, iar liza enzimatică necesită timpi lungi de incubare și nu este reproductibilă – dezintegrarea cu ultrasunete este o metodă sofisticată și rapidă de dezintegrare a celulelor.
Liza cu ultrasunete se bazează exclusiv pe forțe mecanice. Nu se adaugă substanțe chimice; sonicarea rupe peretele celular prin forțe de forfecare. Liza chimică poate modifica structura proteinelor și poate introduce probleme de purificare. Dezintegrarea enzimatică necesită timpi lungi de incubare și nu este reproductibilă. Dezintegrarea cu ultrasunete a celulelor bacteriene de E.coli este rapidă, simplă, fiabilă și reproductibilă. De aceea, ultrasonicatoarele Hielscher sunt utilizate în laboratoare biologice și biochimice din întreaga lume pentru pregătirea probelor, etapa preanalitică, diagnosticul in vitro și numeroase teste.

Recomandări generale pentru liza cu ultrasunete

Sonicarea este cea mai populară tehnică pentru liza cantităților foarte mici, medii și mari de suspensii celulare – de la picolitri până la 100L/hr (folosind o celulă de flux ultrasonică). Celulele sunt lizate prin forfecarea lichidului și cavitație. ADN-ul este, de asemenea, forfecat în timpul sonicării, astfel încât nu este necesar să se adauge DNază în suspensia celulară.

Controlul temperaturii în timpul lizei E.coli cu ultrasunete
Prin prerăcirea probei și menținerea acesteia pe gheață în timpul sonicării, degradarea termică a probei poate fi prevenită cu ușurință.
Ideal, probele ar trebui menținute la temperatura gheții în timpul lizei, dar pentru majoritatea probelor este suficient ca temperatura să nu crească peste temperatura culturii sau a țesutului sursă. Prin urmare, se recomandă menținerea suspensiei pe gheață și sonicarea cu mai multe impulsuri ultrasonice scurte de 5–10 sec și pauze de 10–30 sec. În timpul pauzelor, căldura se poate disipa, astfel încât să se restabilească o temperatură scăzută. Pentru probe celulare mai mari, sunt disponibile diverse reactoare cu celulă de flux cu mantale de răcire.
Citiți aici sfaturi și recomandări detaliate pentru o liză cu ultrasunete reușită!

Protocoale pentru prepararea cu ultrasunete a lizatelor de E. Coli

Cercetătorii utilizează omogenizatoare cu ultrasunete Hielscher pentru dezintegrarea celulelor de E.coli. Mai jos găsiți diverse protocoale testate și verificate pentru liza E.coli cu ajutorul omogenizatoarelor cu ultrasunete Hielscher, pentru diverse aplicații legate de E. coli.

Creșterea celulelor, reticularea și prepararea extractelor celulare de E. coli cu ajutorul ultrasunetelor

Pentru ChIP-Chip pentru SeqA și ARN-polimerază, E. coli MG1655 sau MG1655 ΔseqA a fost cultivată la 37°C până la o OD₆₀₀ de aproximativ 0,15 în 50 ml LB (+ 0,2% glucoză), înainte de adăugarea a 27 μl de formaldehidă (37%) per ml de mediu (concentrație finală 1%). Reticularea a fost efectuată sub agitare lentă (100 rpm) la temperatura camerei timp de 20 min, urmată de stingerea reacției (quenching) cu 10 ml de glicină 2,5 M (concentrație finală 0,5 M). Pentru experimentele de șoc termic, E. coli MG1655 a fost cultivată în 65 ml mediu LB la 30°C până la o OD₆₀₀ de aproximativ 0,3. Ulterior, 30 ml de cultură au fost transferați într-un balon preîncălzit la 43°C, iar restul a fost menținut la 30°C. Reticularea și stingerea reacției au fost efectuate conform descrierii de mai sus, cu excepția faptului că celulele au fost menținute la 30 sau 43°C timp de 5 min înainte de agitarea lentă ulterioară la temperatura camerei. Celulele au fost colectate prin centrifugare și spălate de două ori cu TBS rece (pH7.5). După resuspendarea în 1 ml de tampon de liză (10 mM Tris (pH 8,0), 20% zaharoză, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg/ml lizozim) și incubarea la 37°C timp de 30 min, urmată de adăugarea a 4 ml de tampon IP, celulele au fost sonicate pe gheață de 12 ori câte 30 sec, cu pauze de 30 sec, folosind procesorul cu ultrasunete Hielscher UP400St la o setare a puterii de 100%. După centrifugare timp de 10 min la 9000 g, alicote de 800 μl din supernatant au fost depozitate la -20°C. (Waldminghaus 2010)

Supraproducția și purificarea enzimelor cu un sonicator cu sondă

Pentru supraproducția proteinelor marcate cu decahistidină (His10), E. coli BL21(DE3) a fost transformată cu construcții pET19b. O precultură peste noapte a fost recoltată prin centrifugare, iar 1% a fost utilizat pentru inocularea unei culturi de expresie. Celulele purtătoare de pET19mgtB au fost cultivate la 22°C până la o densitate optică la 600 nm (OD600) de 0,7. Cultura a fost transferată la 17°C și indusă cu 100 μM IPTG. După 16 h, cultura a fost recoltată prin centrifugare la 7.500 × g la 4°C. Celulele au fost resuspendate în soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) 50 mM cu 0,3 M NaCl la pH 7,4 și dezintegrate prin ultrasonicare cu o sonotrodă cu microvârf S2 la ultrasonicatorul Hielscher UP200St, la un ciclu de 0,5 și o amplitudine de 75%.
Supraproducția GtfC marcat cu decahistidină a fost indusă la 37°C la o OD₆₀₀ de 0,6 cu 100 μM IPTG. Celulele au fost apoi incubate timp de 4 h, recoltate și lizate conform celor menționate mai sus pentru MgtB.
Extractele celulare brute au fost centrifugate la 15.000 × g și 4°C pentru sedimentarea resturilor celulare. Extractele clarificate au fost încărcate pe coloane HisTrap FF Crude de 1 ml folosind un sistem ÄKTAprime Plus. Enzimele au fost purificate conform protocolului producătorului pentru eluția în gradient a proteinelor marcate cu His. Soluțiile proteice eluate au fost dializate de două ori față de 1.000 de volume de PBS 50 mM, pH 7,4, cu 0,3 M NaCl la 4°C. Purificarea a fost analizată prin SDS-PAGE 12%. Concentrația proteinei a fost determinată prin metoda Bradford folosind Roti-Quant. (Rabausch et al. 2013)

Extracția cu ultrasunete a proteinelor din bacteriile E. coli
O proteină-momeală de interes (în acest caz, MTV1 din Arabidopsis thaliana) este fuzionată cu o etichetă GST și exprimată în celule BL21 de Escherichia coli (E. coli).

Luați câte un pelet de GST-MTV1 și de GST (corespunzător unei culturi bacteriene de 50 ml) și resuspendați fiecare pelet în 2,5 mL de tampon de extracție rece ca gheața.
Utilizați un ultrasonicator UP100H (echipat cu sonotrodă cu microvârf MS3 pentru volume mici de aprox. 2–5mL) pentru a dezintegra celulele bacteriene până când acestea sunt lizate, lucru indicat de opacitatea redusă și vâscozitatea crescută. Această operațiune trebuie efectuată pe gheață și se recomandă sonicarea în intervale (de ex. 10 sec de sonicare urmate de 10 sec de pauză pe gheață și așa mai departe). Trebuie avut grijă ca sonicarea să nu se efectueze cu o intensitate prea mare. Dacă se detectează formarea de spumă sau a unui precipitat alb, intensitatea trebuie redusă.
Transferați soluția de bacterii lizate în tuburi de microcentrifugă de 1,5 mL și centrifugați la 4°C, 16.000 x g timp de 20 min.

Sonicatoarele cu sondă utilizează forțele cavitației acustice pentru a dezintegra celulele și pentru a extrage molecule și ADN din E.coli.

Ultrasonicatoarele cu sondă, precum UP400St, utilizează principiul de funcționare al cavitației acustice pentru liza eficientă a E.coli.

Analiza expresiei și purificarea proteinei recombinante prin sonicare

Peletul de E. coli a fost sonicat cu ultrasonicatorul Hielscher UP100H. În acest scop, peletul celular a fost resuspendat în tampon de liză răcit (50 mM Tris-HCl pH=7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) și răcit pe gheață timp de 10 min. Apoi, suspensia celulară a fost sonicată cu 10 impulsuri scurte de 10 s, urmate de un interval de 30 s pentru răcire. În final, resturile celulare au fost îndepărtate prin ultracentrifugare la 4°C timp de 15 min la 14.000 rpm. Pentru confirmarea expresiei rPR, supernatantul a fost rulat pe gel de poliacrilamidă 12% și analizat prin SDS-PAGE și Western blotting. Purificarea rPR a fost realizată folosind rășină Ni2+-NTA (Invitrogen, USA) conform ghidului producătorului. În această etapă a fost utilizată metoda de purificare nativă. Puritatea proteinei purificate a fost evaluată prin electroforeză pe gelul de poliacrilamidă 12% și colorare ulterioară cu albastru Coomassie. Concentrația proteinei purificate a fost măsurată cu kitul de testare a proteinelor Micro BCA (PIERCE, USA). (Azarnezhad et al. 2016)

Acest videoclip prezintă sonotroda ultrasonică de tip cupă de 200 wați pentru dispersarea, omogenizarea, extracția sau degazarea probelor de laborator.

Omogenizatoare cu ultrasunete pentru liza E. coli

Hielscher Ultrasonics proiectează, fabrică și furnizează omogenizatoare cu ultrasunete de înaltă performanță pentru liza fiabilă și eficientă a bacteriilor E. coli și a altor tipuri de celule, țesuturi și culturi celulare.
Portofoliul larg de sonicatoare cu sondă, precum și de sisteme de sonicare indirectă, ne permite să vă oferim omogenizatorul de țesuturi cu ultrasunete ideal pentru aplicația dumneavoastră de dezintegrare a celulelor și de extracție.

Proiectare, fabricație și consultanță – calitate Made in Germany

Ultrasonicatoarele Hielscher sunt bine cunoscute pentru cele mai înalte standarde de calitate și design. Software-ul inteligent, meniul intuitiv, setările programabile și înregistrarea automată a datelor sunt doar câteva dintre caracteristicile ultrasonicatoarelor Hielscher. Robustețea și operarea ușoară permit integrarea fără probleme a ultrasonicatoarelor noastre în unitățile de cercetare și biotehnologie. Chiar și condițiile dificile și mediile solicitante sunt gestionate cu ușurință de ultrasonicatoarele Hielscher.

Hielscher Ultrasonics este o companie certificată ISO și pune un accent deosebit pe ultrasonicatoare de înaltă performanță, dotate cu tehnologie de ultimă generație și ușor de utilizat. Desigur, ultrasonicatoarele Hielscher sunt conforme CE și îndeplinesc cerințele UL, CSA și RoHs.

Tabelul de mai jos vă oferă o indicație privind capacitatea aproximativă de procesare a ultrasonicatoarelor noastre:

Volum lot	Debit	Dispozitive recomandate
plăci multi-well / de microtitrare	n.a.	UIP400MTP
CupHorn pentru flacoane sau pahar de laborator	n.a.	CupHorn ultrasonic
microreactor ultrasonic cu flux	n.a.	GDmini2
până la 10 flacoane de 0,5 până la 1,5mL	n.a.	VialTweeter
0,5 până la 1,5mL	n.a.	VialTweeter
1 până la 500mL	10 până la 200mL/min	UP100H
10 până la 2000mL	20 până la 400mL/min	UP200Ht, UP400St
0,1 până la 20L	0,2 până la 4L/min	UIP2000hdT
10 până la 100L	2 până la 10L/min	UIP4000
n.a.	10 până la 100L/min	UIP16000
n.a.	mai mare	cluster de UIP16000

Contactați-ne! / Întrebați-ne!

Videoclipul prezintă sistemul ultrasonic de pregătire a probelor UIP400MTP, care permite pregătirea fiabilă a probelor în orice placă standard cu godeuri multiple, folosind ultrasunete de înaltă intensitate. Aplicațiile tipice ale UIP400MTP includ liza celulară, fragmentarea ADN-ului, ARN-ului și cromatinei, precum și extracția proteinelor.

Protocoale suplimentare pentru liza E. coli cu ultrasunete

Proteine modificate de alicină în E. coli cu ajutorul unui VialTweeter ultrasonic

Determinarea conținutului de grupări sulfhidril prin testul cu acid 5,5′-ditiobis(2-nitrobenzoic) (DTNB)
O cultură peste noapte de E. coli MG1655 a fost utilizată pentru inocularea mediului minimal MOPS (1:100). Cultura a fost crescută aerob până la atingerea unei A600 de 0,4. Cultura a fost împărțită în trei culturi de 15 ml pentru tratamentul de stres. O cultură netratată a servit drept control negativ. În fiecare dintre celelalte două culturi s-a adăugat, respectiv, 0,79 mM alicină (128 μg ml-1) sau 1 mM diamidă. Culturile au fost incubate timp de 15 min. Câte 5 ml din fiecare cultură au fost recoltați prin centrifugare (8.525 × g, 4°C, 10 min). Celulele au fost spălate de două ori cu 1 ml de PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4, păstrat anaerob înainte de utilizare) și centrifugate (13.000 × g, 4°C, 10 min). Celulele au fost resuspendate în tampon de liză (PBS cu 6 mM HCl de guanidiniu, pH 7,4) înainte de dezintegrarea la 4°C prin ultrasonicare (VialTweeter ultrasonicator, Hielscher GmbH, Germania) (3 × 1 min). Resturile celulare au fost sedimentate prin centrifugare (13.000 × g, 4 °C, 15 min). Supernatantul a fost transferat într-o cuvă QS-macro de 3,5 ml (10 mm) cu o bară de agitare magnetică și amestecat cu 1 ml de tampon de liză. Extincția probelor a fost monitorizată la 412 nm cu un spectrofotometru Jasco V-650 echipat cu suportul de cuvă cu control al temperaturii PSC-718, la temperatura camerei. S-au adăugat 100μl dintr-o soluție de acid ditiobis(2-nitrobenzoic) 3 mM. Extincția a fost monitorizată până la atingerea saturației. Calculul concentrației de tioli a fost efectuat folosind coeficientul de extincție ϵ₄₁₂ = 13.700 M^-1 cm^-1 pentru acidul tio-2-nitrobenzoic (TNB). Concentrațiile celulare de tioli au fost calculate pe baza unui volum al celulelor de E. coli de 6,7 × 10^-15 litri și a unei densități celulare de A600 = 0,5 (echivalent cu 1 × 10⁸ celule ml^-1 cultură). (Müller et al. 2016)

Determinarea in vivo a glutationului cu ajutorul unui dispozitiv de dezintegrare celulară cu ultrasunete

E.coli MG1655 a fost cultivată în mediu minimal MOPS într-un volum total de 200ml până la atingerea unei A600 de 0,5. Cultura a fost împărțită în culturi de 50 ml pentru tratamentul de stres. După 15 min de incubare cu 0,79 mM alicină, 1 mM diamidă sau dimetil sulfoxid (control), celulele au fost recoltate la 4.000g la 4°C timp de 10 min. Celulele au fost spălate de două ori cu tampon KPE înainte de resuspendarea peletelor în 700µl de tampon KPE. Pentru deproteinizare, s-au adăugat 300l de acid sulfosalicilic 10% (w/v) înainte de dezintegrarea celulelor prin ultrasonicare (3 x 1 min; VialTweeter ultrasonicator). Supernatantele au fost colectate după centrifugare (30 min, 13.000g, 4°C). Concentrațiile de acid sulfosalicilic au fost reduse la 1% prin adăugarea a 3 volume de tampon KPE. Măsurătorile glutationului total și ale GSSG au fost efectuate conform descrierii de mai sus. Concentrațiile celulare de glutation au fost calculate pe baza unui volum al celulelor de E. coli de 6,7×10^-15 litri și a unei densități celulare de A600 0,5 (echivalent cu 1×10⁸ celule ml^-1 cultură). Concentrațiile de GSH au fost calculate prin scăderea a 2[GSSG] din glutationul total. (Müller et al. 2016)

Expresia mAspAT uman în E. coli cu ajutorul unui omogenizator cu ultrasunete

Colonia unică de E. coli BL21 (DE3) care conține vectorul de expresie a fost introdusă în 30 mL de mediu Luria-Bertani (LB) conținând 100μg/mL ampicilină și apoi cultivată la 37ºC până când densitatea optică (OD₆₀₀) a atins 0,6. Celulele au fost recoltate prin centrifugare la 4.000 × g timp de 10 min și resuspendate în 3L de mediu LB proaspăt conținând 100μg/mL ampicilină.
Ulterior, expresia proteinei a fost indusă cu 1 mM izopropil β-ᴅ-1-tiogalactopiranozidă (IPTG) timp de 20 h la 16ºC. Celulele au fost recoltate prin centrifugare la 8.000 × g timp de 15 min și spălate cu tamponul A (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4). Din 3 L de cultură s-au obținut aproximativ 45g de celule (masă umedă). După centrifugare, peletele celulare au fost resuspendate în 40 mL (pentru 1 L de cultură) de tampon de extracție A rece ca gheața și lizate prin ultrasonicare la temperatura gheții folosind dispozitivul de dezintegrare celulară cu ultrasunete Hielscher UP400St. Lizatul celular a fost centrifugat la 12.000 rpm timp de 15 min pentru separarea fracțiilor solubile (supernatant) și precipitate (pelet). (Jiang et al. 2015)

Subiecte conexe

Informații utile

E.coli

Escherichia coli (E. coli) este o bacterie coliformă gram-negativă, facultativ anaerobă, în formă de bastonaș, din genul Escherichia, care se găsește frecvent în intestinul inferior al organismelor cu sânge cald (endoterme). Există un număr mare de tulpini (sau subtipuri) de E. coli cu caracteristici diverse. Majoritatea tulpinilor de E. coli sunt inofensive pentru oameni, de ex. tulpinile B și K-12, care sunt utilizate frecvent în aplicații de cercetare în laboratoare. Cu toate acestea, unele tulpini sunt dăunătoare și pot provoca boli grave.
E. coli joacă un rol important în ingineria biologică modernă și în microbiologia industrială, deoarece bacteria este ușor de manipulat. Aplicațiile de laborator obișnuite implică adesea utilizarea E. coli, de ex. pentru a crea acid dezoxiribonucleic (ADN) recombinant sau pentru a servi drept organism model.
E. coli este o gazdă foarte versatilă pentru producția de proteine heterologe, iar pentru producerea proteinelor recombinante în E. coli sunt disponibile numeroase sisteme de expresie proteică. Cu ajutorul plasmidelor care permit expresia proteică la nivel ridicat, pot fi introduse gene în bacterii, ceea ce permite producerea acestor proteine în cantități mari în procese industriale de fermentație.
E.coli sunt utilizate ca fabrici celulare pentru producerea insulinei. Alte aplicații includ utilizarea celulelor de E. coli modificate pentru dezvoltarea și producerea de vaccinuri și enzime imobilizate, pentru producerea de biocombustibili, precum și pentru bioremediere.
Tulpina K-12 este o formă mutantă de E. coli care supraexprimă enzima fosfatază alcalină (ALP). Această mutație apare din cauza unui defect al genei care codifică în mod constant enzima. Dacă o genă produce un produs fără nicio inhibiție, acest lucru este cunoscut ca activitate constitutivă. Această formă mutantă specifică este utilizată pentru izolarea și purificarea enzimei ALP.
Bacteriile E. coli sunt, de asemenea, utilizate pe scară largă ca fabrici celulare. Microbii modificați prin inginerie (de ex. bacterii) și celulele vegetale pot fi utilizați ca așa-numite fabrici celulare. Aceste celule modificate genetic produc molecule, substanțe chimice, polimeri, proteine și alte substanțe, care sunt utilizate, de exemplu, în industria farmaceutică, alimentară și chimică. Pentru a elibera moleculele produse în interiorul acestor celule modificate prin bioinginerie, liza cu ultrasunete este o metodă obișnuită de a dezintegra pereții celulari și de a transfera substanțele țintă în lichidul înconjurător. Citiți mai multe despre liza celulelor modificate prin bioinginerie!

Forfecarea ADN-ului cu ultrasunete

Forțele de forfecare ultrasonice sunt o metodă utilizată frecvent pentru eliberarea moleculelor, organitelor și proteinelor din interiorul celulei, precum și pentru fragmentarea catenelor de ADN. Cavitația acustică rupe pereții și membranele celulare pentru a extrage ADN-ul din celule și generează fragmente cu o lungime de aproximativ 600 – 800 bp, ceea ce este ideal pentru analiză.
Faceți clic aici pentru a afla mai multe despre omogenizatoarele cu ultrasunete pentru fragmentarea ADN-ului!

Literatură / Referințe

Azarnezhad A., Sharifi Z., Seyedabadi R., Hosseini A., Johari B., Sobhani Fard M. (2016): Cloning and Expression of Soluble Recombinant HIV-1 CRF35 Protease-HP Thioredoxin Fusion Protein. Avicenna J Med Biotechnol. 8(4), 2016. 175–181.
Jiang X., Wang J., Chang H.; Zhou Y. (2016): Recombinant expression, purification and crystallographic studies of the mature form of human mitochondrial aspartate aminotransferase. BioScience Trends 2016.
Müller A., Eller J., Albrecht F., Prochnow P., Kuhlmann K., Bandow J.E., Slusarenko A.J., Leichert L.I.O. (2016): Allicin Induces Thiol Stress in Bacteria through S-Allylmercapto Modification of Protein Cysteines. Journal of Biological Chemistry Vol. 291, No. 22, 2016. 11477–11490.
Rabausch U., Juergensen J., Ilmberger N., Böhnke S., Fischer S., Schubach B., Schulte M., Streit W. R. (2013): Functional Screening of Metagenome and Genome Libraries for Detection of Novel Flavonoid-Modifying Enzymes. Applied and Environmental Microbiology 79(15), 2013. 4551–4563.
Sauer M. (2014): MTV1 Pull-down Assay in Arabidopsis. bio-protocol Vol 4, Iss 12, Jun 20, 2014.
Waldminghaus T., Skarstad K. (2010): ChIP on Chip: surprising results are often artifacts. BMC Genomics 11, 2010. 414.

Ultrasunete de înaltă performanță! Gama de produse Hielscher acoperă întregul spectru, de la ultrasonicatorul compact de laborator și unitățile de banc până la sistemele cu ultrasunete complet industriale.

Hielscher Ultrasonics fabrică omogenizatoare cu ultrasunete de înaltă performanță, de la scară de laborator până la scară industrială.