Hielscher ultrasunete tehnologie

Cu ultrasunete Lysis de E. Coli

  • E. coli bacterii sunt cele mai frecvent utilizate bacterii in microbiologie si biotehnologie.
  • perturbatorii celule ultrasonice furniza rezultate fiabile și reproductibile pentru liza E. coli.
  • cavitație și forfecare forțe intense încă precis controlabile duce la perturbarea completă și randamente de extracție ridicate (de exemplu, proteine, ADN).

Cell Disruption prin cavitație

bacteria Escherichia coli sunt în mod fiabil lizează folosind omogenizatoare de țesut cu ultrasunete.Ultrasonice omogenizatoare tip sondă funcționează cu aprox. 20.000 cicluri pe secundă (la 20kHz) și provoca cavitație în lichide sau supsensions. cavitatie zone microscopice acustice ale presiunilor de vid asemănător și la temperaturi ridicate care rupe celulele în afară. Cu toate ca temperaturile pot ajunge la câteva mii de grade Celsius, volumele de cavitatie sunt atat de mici incat nu se incalzesc in mod semnificativ procesul. Ultrasunetele generate de cavitație acustice și forțe de forfecare perfora sau rupe membrana celulelor de E. coli – în funcție de setarea dispozitivului de omogenizator cu ultrasunete.

Avantajele ultrasunete Lysis

  • un control precis al lizei (intensitate, amplitudine, temperatura)
  • Adaptare optimă la eșantioane specifice
  • controlul temperaturii
  • pentru probele foarte mici la foarte mari (pl la litri)
  • tratament mecanic pur
  • liniară scară de la laborator la producție
Aparatul cu ultrasunete VialTweeter permite pentru pregătirea probei simultană a până la 10 flacoane în condiții același proces. (Click pentru a mari!)

VialTweeter pentru liză cu ultrasunete

Cerere de informatie





In timp ce liza chimică și enzymtic poate fi problematică – deoarece liză chimică poate altera structurile de proteine ​​și de a introduce probleme de purificare și de liză enzimatică necesită timpi de incubare lung și nu este reproductibilă – perturbarea cu ultrasunete este o celulă rapidă metodă sofisticată perturbare.
Liza cu ultrasunete se bazează pe forțele mecanice numai. Nu sunt adăugate substanțe chimice, Sonicare sparge peretele celular de forțele de forfecare. Liza chimică poate modifica structura proteinelor și introduce probleme de purificare. perturbare enzimatice necesită perioade lungi de incubație și nu este reproductibilă.

Recomandări generale

UP400St ultrasonicator cu reactor cu curgereSonicare este cea mai populara tehnica pentru lizeze cantități foarte mici, mijlocii și mari de suspensii de celule – de la pico litri până la 100L / h (folosind o celulă de flux cu ultrasunete). Celulele sunt lizate prin forfecare lichid și cavitație. ADN-ul este, de asemenea, în timpul forfecat sonicare, deci nu este necesar să se adauge deoxiribonucleazei la suspensia de celule.
Controlul temperaturii:
Prin prerăcire eșantionului și păstrarea probei în timpul sonicare pe gheață, proba degradarea termică a probei poate fi ușor prevenite.
În mod ideal, probele trebuie păstrate la rece ca gheața în timpul Lizei, dar pentru majoritatea probelor este suficientă dacă temperatura nu se ridică deasupra temperaturii culturii sau a sursei de țesut. Prin urmare, este recomandat, pentru a menține suspendarea pe gheață și pentru a sonicate cu mai multe impulsuri scurt Ultrasonics de 5-10 sec și pauze de 10-30 sec. În timpul pauzele, căldura se poate disipa pentru a restabili o temperatură scăzută. Pentru probele celulare mai mari, sunt disponibile diferite reactoare cu celule de debit cu jachete de răcire.

Protocoalele pentru prepararea E.Coli Lizatele

Analiza Expresia și purificarea proteinei recombinante

E. coli Peletul a fost sonicat cu un sistem ultrasonic UP100H (Hielscher). În acest scop, pelet de celule a fost resuspendat în tampon de liză rece (50 mM Tris-HCI pH = 7,5, 100 mM NaCI, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) și se răcește pe gheață, timp de 10 min. Apoi, suspensia de celule a fost sonicat cu 10 explozii scurte de 10 s, urmat de un interval de 30 s pentru răcire. In final, resturile de celule au fost îndepărtate prin ultracentrifugare la 4 ° C timp de 15 min la 14000 rpm. Pentru confirmarea expresiei RPR, supernatantul a fost rulat pe gel de poliacrilamidă 12% și analizate prin SDS-PAGE și Western blotting. Purificarea RPR a fost realizat folosind Ni2 +rășină -NTA (Invitrogen, SUA) în conformitate cu ghidul producătorului. În această etapă, a fost utilizată metoda de purificare nativă. Puritatea proteinei purificate a fost evaluată folosind electroforeză pe gel de poliacrilamidă 12% și ulterior o colorație albastră Coomassie. concentrația de proteină purificată a fost măsurată prin Micro BCA de analiză a proteinei kit (PIERCE, USA). (Azarnezhad și colab. 2016)

Cu ultrasunete UP100H disruptor de celule (100W) pentru liza, sfărâmării celulelor și forfecare ADN.

omogenizator cu ultrasunete UP100H 100W

Creștere celulară, Reticularea și E. Prepararea extractelor celulare coli

Pentru SeqA și ARN-polimerazei ChIP-Chip E. coli MG1655 sau MG1655 ΔseqA a fost crescută la 37 ° C la o valoare OD600 de de aproximativ 0,15 în 50 ml LB (+ 0,2% glucoză) înainte de adăugarea a 27 ui de formaldehidă (37%) pe ml mediu (concentrație finală 1%). Reticularea a fost efectuată la agitare lentă (100 rpm) la temperatura camerei timp de 20 min urmată de stingerea cu 10 ml de glicină 2,5 M (concentrație finală 0,5 M). Pentru experimentele de șoc termic, E. coli MG1655 a fost crescut în 65 ml de mediu LB la 30 ° C la un OD600 de de aproximativ 0,3. Ulterior, 30 ml de cultură a fost transferat într-un balon de pre încălzit la 43 ° C, iar restul menținut la 30 ° C. Reticularea și stingere a fost așa cum este descris mai sus, cu excepția faptului că celulele au fost menținute la 30 sau 43 ° C, timp de 5 min, înainte de agitare lentă în continuare, la temperatura camerei. Celulele au fost colectate prin centrifugare și se spală de două ori cu TBS rece (pH7,5). După resuspendare în 1 ml tampon de liză (10 mM Tris (pH 8,0), 20% zaharoză, 50 mM NaCI, 10 mM EDTA, 10 mg / ml lisozimă) și incubare la 37 ° C timp de 30 minute, urmată de adăugarea a 4 ml IP tampon, celulele au fost sonicate pe gheață cu 12 ori 30 sec și 30 pauze sec la un UP400St procesor cu ultrasunete (Hielscher Ultrasonics GmbH) cu o putere de 100%. După centrifugare timp de 10 minute la 9000 g, 800 Alicotele pl de supernatant au fost depozitate la -20 ° C. (Waldminghaus 2010)

Supraproducția și purificarea enzimelor.

Pentru supraproducția de decahistidine (His10) proteine ​​-tagged, E. coli BL21 (DE3) a fost transformată cu pET19b constructe. O preculturăeste peste noapte a fost recoltată prin centrifugare, iar 1% a fost utilizată pentru a inocula o cultură de expresie. Celulele care transportă pET19mgtB au fost crescute la 22 ° C până la o densitate optică la 600 nm (OD600 de) De 0,7. Cultura a fost transferată la 17 ° C și indusă de 100 uM IPTG. După 16 h, cultura a fost recoltată prin centrifugare la 7500 x g la 4 ° C. Celulele au fost resuspendate în 50 mM soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) cu NaCI 0,3 M la pH 7,4, și se dislocă prin ultrasonare cu un micro-S2 vârful sonotrode la cele UP200St ultrasonicator (Hielscher, Teltow, Germania), la un ciclu de 0,5 și o amplitudine de 75%.
Supraproducția de decahistidine-etichetat GtfC a fost indusă la 37 ° C, la o valoare OD600 de de 0,6 cu 100 uM IPTG. Celulele au fost apoi incubate timp de 4 h, recoltate și lizate așa cum sa arătat mai sus pentru MgtB.
extractele celulare brute au fost centrifugate la 15.000 x g și 4 ° C pentru a sedimenta resturile celulare. Extractele limpezite au fost încărcate pe coloane brute 1 ml HisTrap FF folosind un sistem ÄKTAprime Plus (GE Healthcare). Enzimele au fost purificate în conformitate cu protocolul producătorului pentru eluție gradient de proteine ​​marcate His. soluții de proteină eluate au fost dializate de două ori față de 1000 de volume de 50 mM PBS, pH 7,4, cu NaCI 0,3 M la 4 ° C. Purificarea a fost analizată cu 12% SDS-PAGE. Concentrația de proteină a fost determinată prin metoda Bradford, folosind-ROTI Quant (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germania). (Rabausch și colab. 2013)

Extracția de proteine ​​din E. coli bacterii
O proteină momeală de interes (în acest caz, MTV1 Arabidopsis thaliana) este fuzionată la o etichetă GST și exprimată în BL21 Escherichia coli (E. coli) celule.
1. Ia o peletă de GST-MTV1 și GST (corespunzând la 50 ml cultură bacteriană) și resuspenda fiecare în tampon de extracție la rece 2,5 ml gheață.
2. Folosiți un ultrasonicator UP100H (Echipat cu MS3 microvârf-sonotrode pentru volume mici (2-5mL)) pentru a perturba celulele bacteriene pana cand sunt lizată, care este indicat prin opacitate redusă și vâscozitatea crescută. Acest lucru trebuie realizat pe gheață, și se recomandă să se sonichează la intervale (de exemplu, 10 sec sonicizare urmat de 10 sec pe gheață și așa mai departe). Îngrijirea trebuie să fie luate pentru a nu se supune ultrasunetelor cu o intensitate prea mare. Dacă spumare sau se detectează formarea unui precipitat alb, intensitatea trebuie să fie coborât.
3. Se transferă soluția lizată bacterii la 1,5 tuburi microcentrifuga ml și se centrifughează la 4 ° C, 16000 x g timp de 20 min.

Proteinele modificate alicina în E. coli

VialTweeter este un ultrasonicator confortabil pentru omogenizare mică probăDeterminarea Cuprins sulfhidril de 5,5'-ditiobis (acid 2-nitrobenzoic) (DTNB) Compoziție
O cultură peste noapte E. coli MG1655 a fost utilizată pentru a inocula MOPS mediu minimal (1: 100). Cultura a crescut aerobioză până când sa ajuns la un A600 de 0,4. Cultura a fost împărțită în trei culturi de 15 ml pentru tratamentul stresului. O cultură netratată a servit ca martor negativ. 0,79 mM alicina (128 pg ml-1 de) Sau 1 mM diamidă a fost adăugat la una dintre cele două culturi rămase fiecare. Culturile au fost incubate timp de 15 min. 5 ml din fiecare cultură au fost recoltate prin centrifugare (8525 x g, 4 ° C, 10 min). Celulele au fost spălate de două ori cu 1 ml de PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCI, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2Po4, PH 7,4, depozitat anaerob înainte de utilizare) și centrifugate (13.000 x g, 4 ° C, 10 min). Celulele au fost resuspendate în tampon de liză (PBS cu HCI 6 mM guanidiniu, pH 7,4) înainte de întreruperi la 4 ° C, prin ultrasonare (VialTweeter ultrasonicator, Hielscher GmbH, Germania) (3 x 1 min). Rămășițele celulare prin centrifugare (13.000 x g, 4 ° C, 15 min). Supernatantul a fost transferat într-un 3,5 ml QS-macro cuvetă (10 mm), cu o bară de agitare magnetică și se amestecă cu 1 ml de tampon de liză. Stingerea probelor a fost monitorizată la 412 nm cu un spectrofotometru Jasco V-650 echipat cu suportul de celulă cu temperatură controlată, PSC-718 (Jasco) la temperatura camerei. S-au adăugat 100 pl dintr-o soluție 3 mM ditiobis (acid 2-nitrobenzoic). Extincția a fost monitorizat până când a ajuns la saturație. Calcularea concentrației tiol a fost realizată folosind gruparea e coeficient de extincție412 de = 13.700 M-1 de Cm-1 de pentru tio-2-nitrobenzoic (TNB). Concentrațiile celulare tiol au fost calculate pe baza unui volum de celule de E. coli de 6,7 x 10-15 litru și o densitate celulară de A600 de = 0,5 (echivalent cu 1 x 108 celule ml-1 de cultură). (Muller și colab. 2016)

In Vivo Glutation Determinarea

E. coli MG1655 a fost crescută în MOPS mediu minimal într-un volum total de 200 ml până la un A600 de de 0,5 a fost atins. Cultura a fost împărțită în culturi de 50 ml pentru tratamentul stresului. După 15 minute de incubare cu 0,79 mM alicină, 1 mM diamidă sau dimetilsulfoxid (control), celulele au fost recoltate la 4,000g la 4 ° C timp de 10 min. Celulele au fost spălate de două ori cu tampon KPE înainte de resuspendare de pelete din 700μl tampon KPE. Pentru deproteinizare, 300l de 10% (g / v) de acid sulfosalicilic au fost adăugate înainte de perturbarea celulelor prin ultrasonare (3 x 1 min; VialTweeter ultrasonicator). Supernatantele au fost colectate după centrifugare (30 min, 13,000g, 4 ° C). Concentrațiile de acid sulfosalicilic au scăzut până la 1%, prin adăugarea a 3 volume de tampon KPE. Au fost efectuate măsurători ale glutation totală și GSSG așa cum este descris mai sus. Concentrațiile de glutation celulare au fost calculate pe baza unui volum de celule de E. coli de 6,7×10-15 litru și o densitate celulară de A600 de 0.5 (echivalent cu 1×108 celule ml-1 de cultură). Concentrațiile de GSH au fost calculate prin scăderea 2 [GSSG] din glutation totală. (Muller și colab. 2016)

disruptor cu ultrasunete pentru liza celulelor și extracția materialului biologic (Click pentru a mari!)

Tip sondă ultrasonicator UP400St

Exprimarea mAspAT umane în E. coli

Cu ultrasunete disruptor de celule UP400St (400W) pentru extracția materiei intracelulare (de exemplu proteine, organite, ADN, ARN etc.)Singura colonie de E. coli BL21 (DE3) care adăpostește vectorul de expresie în 30 ml de Luria-Bertani (LB) mediu conținând 100 pg / ml ampicilină și apoi cultivate la 37 ° C până când densitatea optică (DO600 de) A ajuns la 0,6. Celulele au fost recoltate prin centrifugare la 4000 x g timp de 10 min și resuspendate în mediu LB proaspăt 3L conținând 100 pg / ml ampicilină.
Ulterior, expresia proteinei a fost indusă cu 1 mM izopropil β-ᴅ-1-tiogalactopiranozidă (IPTG) timp de 20 de ore la 16 ° C. Celulele au fost recoltate prin centrifugare la 8000 x g timp de 15 minute și se spală cu tampon A (20 mM NaH2PO4, NaCI 0,5 M, pH 7,4). Celulele 45g aproximat (greutate umedă) au fost obținute de la 3 L de cultura. După centrifugare, peletele de celule a fost resuspendat în 40 ml (pentru 1 L de cultură) rece ca gheața de extracție tampon A, și lizat prin ultrasonare la temperatura rece ca gheața folosind un UP400St Instrument (Dr. Hielscher GmbH, Germania). Liza celulară a fost centrifugat la 12000 rpm timp de 15 min pentru a separa solubil (supernatant) și fracțiunile precipitate (de peleți). (Jiang și colab. 2015)

Tabelul de mai jos vă oferă o indicație a capacității de procesare aproximativă a ultrasonicators noastre:

volum lot Debit Aparate recomandate
0.5 1,5ml N / A. VialTweeter
1 la 500mL 10 până la 200 ml / min UP100H
10 la 2000ml 20 până la 400ml / min Uf200 ः t. UP400St
0.1 la 20L 0.2 4L / min UIP2000hdT
10 100L 2 până la 10L / min UIP4000
N / A. 10 la 100L / min UIP16000
N / A. mai mare grup de UIP16000

Contacteaza-ne! / Intreaba-ne!

Va rugam sa folositi formularul de mai jos, în cazul în care doriți să solicite informații suplimentare cu privire la omogenizare cu ultrasunete. Vom fi bucuroși să vă oferim un sistem de ultrasunete îndeplinesc cerințele dumneavoastră.









Vă rugăm să rețineți Politica de confidentialitate.


Literatura / Referințe



Ce trebuie să știți

E coli

Escherichia coli (E. coli) este un gram-negativ, anaerob facultativ, în formă de tijă, coliform bacterie din Escherichia genul care se găsește de obicei în intestinul inferior al organismelor cu sânge cald (endoterme). Există un mare număr de tulpini de E. coli (sau subtipuri), cu diverse caracteristici. Cele mai multe tulpini de E. coli sunt inofensive pentru om, de ex tulpinile B și K-12, care sunt utilizate în mod obișnuit pentru aplicații de cercetare în laboratoare. Cu toate acestea, unele tulpini sunt dăunătoare și pot provoca boli grave.
E. coli joacă un rol important în inginerie biologică modernă și microbiologie industrială, deoarece bacteriile este ușor de manipulat. aplicatii de laborator comune care implică adesea utilizarea de E. coli, de exemplu pentru a crea acidul dezoxiribonucleic recombinant (ADN) sau pentru a acționa ca un organism model.
E. coli este o gazdă foarte versatil pentru producerea de proteine ​​heterologe și sisteme de expresie de proteine ​​multiple sunt disponibile pentru producerea proteinelor recombinante în E. coli. Folosind plasmide care permit exprimarea la nivel ridicat de proteine, genele pot fi introduse în bacterii, ceea ce permite de a produce astfel de proteine ​​în cantități mari în procesele de fermentație industriale.
Sunt folosite ca E. coli un fabrici de celule pentru a produce insulina. Alte aplicații includ utilizarea de celule de E. coli modificate pentru a dezvolta și produce vaccinuri și enzime imobilizate, pentru a produce biocombustibili, precum și pentru bioremediere.
Tulpina K-12 este o formă mutantă de E. coli, care supra-exprimă enzima fosfatază alcalină (ALP). Aceasta mutatie se produce din cauza unui defect al genei care în mod constant codurile pentru enzima. Dacă o genă produce un produs fără nici o inhibiție aceasta este cunoscută ca o activitate constitutivă. Această formă mutantă specifică este folosit pentru izolarea și purificarea enzimei ALP.

Cu ultrasunete DNA Forfecare

forțe de forfecare ultrasonice sunt o metodă frecvent utilizată pentru a separa de celula si rupe spiralele ADN în bucăți. cavitația acustică rupe pereții celulelor și membranele pentru a extrage ADN-ul din celule și generează fragmente de aproximativ 600 – 800 bp în lungime, care este ideal pentru analiză.
Click aici pentru a afla mai multe despre omogenizatoare cu ultrasunete pentru fragmentarea ADN-ului!