Cu ultrasunete Lysis de E. Coli

  • E. coli bacterii sunt cele mai frecvent utilizate bacterii in microbiologie si biotehnologie.
  • perturbatorii celule ultrasonice furniza rezultate fiabile și reproductibile pentru liza E. coli.
  • cavitație și forfecare forțe intense încă precis controlabile duce la perturbarea completă și randamente de extracție ridicate (de exemplu, proteine, ADN).

De ce este perturbarea celulelor cu ultrasunete de E. coli metoda preferată?

Omogenizatoare cu ultrasunete sau ultrasonicators de tip sondă oferă mai multe avantaje pentru Liza E. coli ca ultrasunete intense perturbă eficient pereții celulelor și membranele. Ultrasonicators de tip sondă sunt utilizate pe scară largă pentru E. coli liză din următoarele motive:

  • Întreruperea eficientă a pereților celulari: E. coli are un perete celular semi-rigid compus din peptidoglicani, care poate fi dificil de rupt folosind metode tradiționale de liză. Un ultrasonicator de tip sondă generează unde ultrasonice intense care creează bule de cavitație în lichidul din jurul celulelor. Când aceste bule se prăbușesc, ele generează jeturi de lichid de mare viteză și unde de șoc care duc la întreruperea mecanică a pereților celulari, eliberând în mod eficient conținutul celular, cum ar fi biomoleculele.
  • Penetrare îmbunătățită: Undele ultrasonice generate de sondă / sonotrode pot pătrunde adânc în probă, ajungând la un număr mai mare de celule E. coli și tratându-le uniform. Acest lucru ajută la asigurarea faptului că liza este mai uniformă pe tot parcursul probei, ceea ce duce la o eficiență mai mare a întreruperilor celulare.
  • Timp redus de procesare: Energia livrată de ultrasonicator de tip sondă este foarte concentrată și localizată, ceea ce duce la liza celulară rapidă și eficientă. În comparație cu alte metode cum ar fi bătaia șirag de mărgele sau liza enzimatică, Sonicare poate realiza E. coli liza în câteva minute sau chiar secunde. În timp ce multe tehnici alternative, cum ar fi înghețarea-dezghețarea necesită mai multe runde de tratament, liza cu ultrasunete deschide celulele într-un singur pas de proces.
  • Controlul temperaturii: Ultrasonicators de ultimă generație sunt echipate cu senzori de temperatură și software inteligent, care permite setarea unei temperaturi maxime a procesului. Ultrasonicator se întrerupe automat atunci când limita de temperatură este atinsă și începe procesul de sonicare atunci când se atinge un punct de temperatură setat. Răcirea probelor într-o baie de gheață este o metodă simplă de a menține temperatura probei scăzută și de a preveni degradarea probei indusă de căldură.
  • Scalabilitate: Ultrasonicators de tip sondă sunt disponibile în diferite dimensiuni, de la dispozitive portabile la modele industriale la scară largă. Acest lucru le face potrivite pentru prelucrarea volumelor mici în laborator sau pentru extinderea pentru aplicații mai mari de bioprocesare, de exemplu producția de vaccinuri sau bio-sinteza moleculelor.
  • Versatilitate: Ultrasonicators pot fi utilizate pentru diverse aplicații dincolo de liza celulară, cum ar fi forfecarea ADN-ului, extracția proteinelor, omogenizarea țesuturilor, dispersia nanoparticulelor și emulsionarea. Prin urmare, investiția într-un ultrasonicator de tip sondă oferă versatilitate în cercetare sau setări industriale.
  • Ultrasonicators de tip sondă, cum ar fi UP200St sunt omogenizatoare de țesut fiabile și concasoare de celule, prin urmare, utilizate pe scară largă pentru pregătirea probei în genetică, de exemplu, pentru Liza E.coli

    Extracția proteinelor din celulele E.coli se realizează eficient cu sondă cu ultrasunete UP200St

    Ultrasonicator de tip sondă oferă multe avantaje pentru Liza E. coli. Controlul fiabil și precis asupra parametrilor de proces cu ultrasunete permit optimizarea parametrilor de funcționare, cum ar fi puterea, durata și manipularea probelor pentru a obține rezultatele dorite.
     

    Cerere de informatie





     

    Acest tutorial explică ce tip de sonicator este cel mai bun pentru sarcinile de pregătire a probei, cum ar fi liza, întreruperea celulelor, izolarea proteinelor, fragmentarea ADN-ului și ARN în laboratoare, analiză și cercetare. Alegeți tipul sonicator ideal pentru aplicația dvs., volumul eșantionului, numărul eșantionului și debitul. Hielscher Ultrasonics are omogenizatorul cu ultrasunete ideal pentru tine!

    Cum să găsiți sonicatorul perfect pentru întreruperea celulelor și extracția proteinelor în știință și analiză

    Miniatură video

    Fragmentarea ADN-ului cu ultrasunete este frecvent utilizat ca pas de pregătire a probei în secvențierea de generație următoare (NGS)

    Analize electroforetice ale ADN-ului genomic de E. coli EDL933 supuse la 0 – 15 min ultrasonication. L indică scara ADN.
    (studiu și imagine: ©Basselet et al. 2008)

    Întreruperea celulelor folosind cavitație cu ultrasunete

    Omogenizatoare de tip sondă cu ultrasunete funcționează cu aproximativ 20.000 de cicluri pe secundă (la 20kHz) și provoacă cavitație în lichide sau suspensii. Cavitație acustică: zone microscopice cu presiuni asemănătoare vidului și temperaturi ridicate care sfâșie celulele. Deși temperaturile pot ajunge la câteva mii de grade Celsius, volumele de cavitație sunt atât de mici încât nu încălzesc semnificativ procesul. Cavitația acustică generată cu ultrasunete și forțele de forfecare perforează sau rup membrana celulară a celulelor bacteriene, cum ar fi E. coli. Hielscher ultrasonicators permite controlul precis asupra parametrilor procesului, ar fi intensitatea cu ultrasunete, amplitudinea, intrarea de energie, și temperatura. Astfel, procesul de liză cu ultrasunete poate fi ajustat optim la tipul de celulă, cultura celulară, și scopul procesului.
     

    Avantajele ultrasunete Lysis

    • un control precis al lizei (intensitate, amplitudine, temperatura)
    • rezultate fiabile, reproductibile
    • Adaptare optimă la eșantioane specifice
    • controlul temperaturii
    • pentru probele foarte mici la foarte mari (pl la litri)
    • Tratament pur mecanic
    • operare ușor de utilizat și în condiții de siguranță
    • liniară scară de la laborator la producție
    Aparatul cu ultrasunete VialTweeter permite pentru pregătirea probei simultană a până la 10 flacoane în condiții același proces. (Click pentru a mari!)

    VialTweeter pentru liză cu ultrasunete

    Cerere de informatie





    Omogenizator cu ultrasunete vs alte tehnici de liză

    În timp ce liza chimică și enzimatică poate fi problematică – deoarece liză chimică poate altera structurile de proteine ​​și de a introduce probleme de purificare și de liză enzimatică necesită timpi de incubare lung și nu este reproductibilă – perturbarea cu ultrasunete este o celulă rapidă metodă sofisticată perturbare.
    Liza cu ultrasunete se bazează numai pe forțele mecanice. Nu se adaugă substanțe chimice, sonicare sparge peretele celular prin forțe de forfecare. Liza chimică poate modifica structura proteinelor și poate introduce probleme de purificare. Întreruperea enzimatică necesită timpi lungi de incubație și nu este reproductibilă. Perturbarea celulelor cu ultrasunete a celulelor bacteriilor E.coli este rapidă, simplă, fiabilă și reproductibilă. Acesta este motivul pentru ultrasonicators Hielscher sunt utilizate în laboratoare biologice și biochimice din întreaga lume pentru prepararea probelor, pre-analitice, diagonstice in vitro și teste multiple.

    Recomandări generale pentru liza cu ultrasunete

    Sonicare este cea mai populara tehnica pentru lizeze cantități foarte mici, mijlocii și mari de suspensii de celule – de la pico litri până la 100L / h (folosind o celulă de flux cu ultrasunete). Celulele sunt lizate prin forfecare lichid și cavitație. ADN-ul este, de asemenea, în timpul forfecat sonicare, deci nu este necesar să se adauge deoxiribonucleazei la suspensia de celule.
     

    Controlul temperaturii în timpul liza E.coli cu ultrasunete
    Perturbator de celule cu ultrasunete UP100H (100W) pentru întreruperea celulelor și extracția compușilor plantelor.Prin prerăcire eșantionului și păstrarea probei în timpul sonicare pe gheață, proba degradarea termică a probei poate fi ușor prevenite.
    În mod ideal, probele ar trebui păstrate reci ca gheața în timpul lizei, dar pentru majoritatea probelor este suficient ca temperatura să nu crească peste temperatura culturii sau a sursei de țesuturi. Prin urmare, se recomandă, pentru a menține suspensia pe gheață și pentru a sonicate cu mai multe impulsuri scurte cu ultrasunete de 5-10 sec și pauze de 10-30 sec. În timpul pauzelor, căldura se poate disipa pentru a restabili o temperatură scăzută. Pentru probe de celule mai mari, sunt disponibile diferite reactoare cu celule de flux cu mantale de răcire.
    Citiți aici sfaturi detaliate și recomandări pentru o liză cu ultrasunete de succes!

    Protocoale pentru prepararea cu ultrasunete a E. Coli lizates

    Cercetătorii folosesc hielscher omogenizatoare cu ultrasunete pentru întreruperea celulelor E.coli. Mai jos puteți găsi diverse protocoale testate și dovedite pentru Liza E.coli folosind omogenizatoare cu ultrasunete Hielscher pentru diverse aplicații legate de E. coli.
     

    Acest clip video arată hielscher omogenizator cu ultrasunete UP100H, un ultrasonicator utilizat pe scară largă pentru pregătirea probei în laboratoare.

    Omogenizator cu ultrasunete UP100H

    Miniatură video

    Creșterea celulelor, reticularea și pregătirea extractelor de celule E. coli folosind Ultrasonics

    Pentru SeqA și ARN-polimerazei ChIP-Chip E. coli MG1655 sau MG1655 ΔseqA a fost crescută la 37 ° C la o valoare OD600 de de aproximativ 0,15 în 50 ml LB (+ 0,2% glucoză) înainte de adăugarea a 27 ui de formaldehidă (37%) pe ml mediu (concentrație finală 1%). Reticularea a fost efectuată la agitare lentă (100 rpm) la temperatura camerei timp de 20 min urmată de stingerea cu 10 ml de glicină 2,5 M (concentrație finală 0,5 M). Pentru experimentele de șoc termic, E. coli MG1655 a fost crescut în 65 ml de mediu LB la 30 ° C la un OD600 de de aproximativ 0,3. Ulterior, 30 ml de cultură au fost transferați într-un balon preîncălzit la 43°C, iar restul au fost păstrați la 30°C. Reticularea și stingerea au fost așa cum este descris mai sus, cu excepția faptului că celulele au fost ținute la 30 sau 43 ° C timp de 5 minute înainte de a se agita și mai mult la temperatura camerei. Celulele au fost colectate prin centrifugare și spălate de două ori cu TBS rece (pH7.5). După resuspensie în 1 ml tampon de liză (10 mM Tris (pH 8.0), 20% zaharoză, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg / ml lizozimă) și incubare la 37 ° C timp de 30 min, urmată de adăugarea de 4 ml tampon IP, celulele au fost sonicate pe gheață cu pauze de 12 ori 30 sec și 30 sec folosind procesorul cu ultrasunete Hielscher UP400St la setarea de putere 100%. După centrifugare timp de 10 minute la 9000 g, 800 μl alicote de supernatant au fost depozitate la -20 °C. (Waldminghaus 2010)
     

    Supraproducția și purificarea enzimelor cu o sondă cu ultrasunete

    Ultrasonicator UP100H este un omogenizator de laborator adesea folosit pentru pregătirea probei de plăci de cultură celulară.Pentru supraproducția proteinelor marcate cu decahistidină (His10), E. coli BL21(DE3) a fost transformată cu construcții pET19b. O precultură peste noapte a fost recoltată prin centrifugare, iar 1% a fost folosită pentru a inocula o cultură de expresie. Celulele purtătoare de pET19mgtB au fost cultivate la 22 °C până la o densitate optică la 600 nm (OD600) de 0,7. Cultura a fost transferată la 17 °C și indusă de 100 μM IPTG. După 16 ore, cultura a fost recoltată prin centrifugare la 7.500 × g la 4°C. Celulele au fost resuspended în 50 mM fosfat-tamponat soluție salină (PBS) cu 0.3 M NaCl la pH 7.4 și perturbate de ultrasonication cu un sonotrode micro-vârful S2 la ultrasonicator Hielscher UP200St la un ciclu de 0,5 și o amplitudine de 75%.
    Supraproducția de decahistidine-etichetat GtfC a fost indusă la 37 ° C, la o valoare OD600 de de 0,6 cu 100 uM IPTG. Celulele au fost apoi incubate timp de 4 h, recoltate și lizate așa cum sa arătat mai sus pentru MgtB.
    Extractele de celule brute au fost centrifugate la 15.000 × g și 4 °C pentru a sedimenta resturile celulare. Extractele clarificate au fost încărcate pe coloane HisTrap FF Crude de 1 ml folosind un sistem ÄKTAprime Plus. Enzimele au fost purificate în conformitate cu protocolul producătorului pentru eluția gradientului proteinelor marcate his-tagged. Soluțiile proteice eluate au fost dializate de două ori față de 1.000 de volume de 50 mM PBS, pH 7,4, cu 0,3 M NaCl la 4°C. Purificarea a fost analizată de 12% SDS-PAGE. Concentrația de proteine a fost determinată prin metoda Bradford folosind Roti-Quant. (Rabausch et al. 2013)
     

    Extracția cu ultrasunete a proteinelor din bacteriile E. coli
    O proteină momeală de interes (în acest caz, MTV1 Arabidopsis thaliana) este fuzionată la o etichetă GST și exprimată în BL21 Escherichia coli (E. coli) celule.

    1. Luați o peletă de GST-MTV1 și GST (corespunzătoare culturii bacteriene de 50 ml) și resuspendați fiecare în 2,5 ml de tampon de extracție rece cu gheață.
    2. Utilizați un ultrasonicator UP100H (echipat cu MS3 microtip-sonotrode pentru volume mici de aproximativ 2-5 ml) pentru a perturba celulele bacteriene până când acestea sunt lizate, ceea ce este indicat de opacitate redusă și vâscozitate crescută. Acest lucru trebuie efectuat pe gheață și se recomandă sonicarea în intervale (de exemplu, sonicarea de 10 sec urmată de o pauză de 10 sec pe gheață și așa mai departe). Trebuie avut grijă să nu sonicați cu intensitate prea mare. Dacă se detectează spumarea sau formarea unui precipitat alb, intensitatea trebuie redusă.
    3. Se transferă soluția de bacterii lizate în tuburi de microcentrifugă de 1,5 ml și se centrifughează la 4°C, 16.000 x g timp de 20 de minute.

     

    Sondele cu ultrasunete folosesc forțele de cavitație acustică pentru a perturba celulele și pentru a extrage molecule și ADN din E.coli.

    Ultrasonicators de tip sondă, cum ar fi UP400St să utilizeze principiul de lucru al cavitației acustice pentru liza eficientă a E.coli.

    Analiza expresiei și purificarea proteinei recombinante folosind Sonicare

    Peletul E. coli a fost sonicat cu hielscher ultrasonicator UP100H. În acest scop, peletul celular a fost resuspendat în tampon de liză răcit (50 mM Tris-HCl pH =7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) și răcit pe gheață timp de 10 min. Apoi, suspensia celulară a fost sonicată cu 10 explozii scurte de 10 s, urmate de un interval de 30 s pentru răcire. În cele din urmă, resturile celulare au fost îndepărtate prin ultracentrifugare la 4 °C timp de 15 minute la 14000 rpm. Pentru confirmarea expresiei rPR, supernatantul a fost rulat pe gel poliacrilamidă 12% și analizat de SDS-PAGE și Western blotting. Purificarea rPR s-a făcut folosind rășină Ni2+-NTA (Invitrogen, SUA), conform ghidului producătorului. În această etapă, a fost utilizată metoda de purificare nativă. Puritatea proteinei purificate a fost evaluată cu ajutorul electroforezei pe gelul de poliacrilamidă 12% și colorarea ulterioară a albastrului Coomassie. Concentrația de proteine purificate a fost măsurată prin kitul de testare a proteinelor Micro BCA (PIERCE, SUA). (Azarnezhad et al. 2016)
     

    Acest videoclip arată cufor cu ultrasunete de 200 wați pentru dispersarea, omogenizarea, extragerea sau degazarea probelor de laborator.

    Cufor cu ultrasunete (200 Watts)

    Miniatură video

    Omogenizatoare cu ultrasunete pentru E. coli Lysis

    Hielscher Ultrasonics proiectează, produce și furnizează omogenizatoare cu ultrasunete de înaltă performanță pentru liza fiabilă și eficientă a bacteriilor E. coli și a altor tipuri de celule, țesuturi și culturi de celule.
    Portofoliul larg de sonde cu ultrasunete, precum și sisteme de sonicare indirectă ne permite să vă oferim omogenizatorul ideal de țesut cu ultrasunete pentru întreruperea celulelor și aplicarea de extracție.

    Proiectare, Productie si Consultanta – Calitate fabricată în Germania

    Hielscher ultrasonicators pot fi controlate de la distanță prin intermediul controlului browser-ului. Parametrii sonicare pot fi monitorizați și ajustați cu precizie la cerințele procesului.Ultrasonicators Hielscher sunt bine-cunoscute pentru cele mai înalte standarde de calitate și design. Software-ul inteligent, meniu intuitiv, setări programabile și protocolare automată a datelor sunt doar câteva caracteristici ale ultrasonicators Hielscher. Robustețea și operarea ușoară permit integrarea fără probleme a ultrasonicators noastre în facilități de cercetare și biotehnologie. Chiar și condiții dure și medii solicitante sunt ușor de manipulat de ultrasonicators Hielscher.

    Hielscher Ultrasonics este o companie certificată ISO și a pus un accent special pe ultrasonicators de înaltă performanță featuring tehnologie de ultimă oră și ușurința în utilizare. Desigur, ultrasonicators Hielscher sunt conforme cu CE și îndeplinesc cerințele ul, CSA și RoHs.

    Tabelul de mai jos vă oferă o indicație a capacității de procesare aproximativă a ultrasonicators noastre:

    volum lot Debit Aparate recomandate
    plăci multi-well / microtiter N / A. UIP400MTP
    CupHorn pentru flacoane sau pahar de laborator N / A. cuphorn cu ultrasunete
    reactor cu ultrasunete micro-flux N / A. GDmini2
    până la 10 flacoane cu 0,5 până la 1,5 ml N / A. VialTweeter
    0.5 1,5ml N / A. VialTweeter
    1 la 500mL 10 până la 200 ml / min UP100H
    10 la 2000ml 20 până la 400ml / min Uf200 ः t. UP400St
    0.1 la 20L 0.2 4L / min UIP2000hdT
    10 100L 2 până la 10L / min UIP4000
    N / A. 10 la 100L / min UIP16000
    N / A. mai mare grup de UIP16000

    Contacteaza-ne! / Intreaba-ne!

    Cere mai multe informații

    Vă rugăm să utilizați formularul de mai jos pentru a solicita informații suplimentare despre omogenizatoare de țesut cu ultrasunete și concasoare de celule, aplicații de liză și prețurile. Vom fi bucuroși să discutăm procesul cu tine și să vă oferim un omogenizator cu ultrasunete care îndeplinește cerințele dvs.!









    Vă rugăm să rețineți Politica de confidentialitate.


    Videoclipul arată sistemul de pregătire a probelor cu ultrasunete UIP400MTP, care permite pregătirea fiabilă a probelor de orice plăci standard multi-bine folosind ultrasunete de mare intensitate. Aplicațiile tipice ale UIP400MTP includ liza celulară, ADN-ul, ARN-ul și forfecarea cromatinei, precum și extracția proteinelor.

    Ultrasonicator UIP400MTP pentru sonicare placă multi-bine

    Miniatură video

    Protocoale suplimentare pentru Liza cu ultrasunete E. coli

    Proteine modificate de alicină în E. coli folosind un flacon cu ultrasuneteTweeter

    VialTweeter la procesorul cu ultrasunete UP200STDeterminarea Cuprins sulfhidril de 5,5'-ditiobis (acid 2-nitrobenzoic) (DTNB) Compoziție
    O cultură E. coli MG1655 peste noapte a fost utilizată pentru a inocula mediu minim MOPS (1:100). Cultura a fost cultivată aerob până când s-a ajuns la un A600 de 0,4. Cultura a fost împărțită în trei culturi de 15 ml pentru tratamentul stresului. O cultură netratată a servit ca un control negativ. 0,79 mM alicină (128 μg ml-1) sau 1 mM diamidă a fost adăugată la una dintre celelalte două culturi fiecare. Culturile au fost incubate timp de 15 min. 5 ml din fiecare cultură au fost recoltate prin centrifugare (8.525 × g, 4°C, 10 min). Celulele au fost spălate de două ori cu 1 ml de PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4, depozitate anaerob înainte de utilizare) și centrifugate (13.000 × g, 4 °C, 10 min). Celulele au fost resuspended în tampon de liză (PBS cu 6 mM guanidinium HCl, pH 7.4) înainte de întreruperea la 4 ° C prin ultrasonication (VialTweeter ultrasonicator, Hielscher GmbH, Germania) (3 × 1 min). Resturile celulare au fost acoperite prin centrifugare (13.000 × g, 4 °C, 15 min). Supernatantul a fost transferat într-o cuvă QS-macro de 3,5 ml (10 mm) cu o bară magnetică de agitare și amestecată cu 1 ml de tampon de liză. Extincția probelor a fost monitorizată la 412 nm cu un spectrofotometru Jasco V-650 echipat cu suportul de celule cu temperatură controlată PSC-718 la temperatura camerei. S-au adăugat 100 μl dintr-o soluție de dithiobis (acid 2-nitrobenzoic) de 3 mM. Extincția a fost monitorizată până când a ajuns la saturație. Calculul concentrației de tiol a fost efectuat utilizând coeficientul de extincție ε412 de = 13.700 M-1 de Cm-1 de pentru tio-2-nitrobenzoic (TNB). Concentrațiile celulare tiol au fost calculate pe baza unui volum de celule de E. coli de 6,7 x 10-15 litru și o densitate celulară de A600 = 0,5 (echivalent cu 1 × 108 celule ml-1 de cultură). (Muller și colab. 2016)
     

    Determinarea glutationului in vivo folosind un concasor de celule cu ultrasunete

    E.coli MG1655 a fost cultivat în mediu minim MOPS într-un volum total de 200ml până când s-a ajuns la un A600 de 0,5. Cultura a fost împărțită în culturi de 50 ml pentru tratamentul stresului. După 15 minute de incubație cu alicină de 0,79 mM, diamidă de 1 mM sau dimetil sulfoxid (control), celulele au fost recoltate la 4.000g la 4 °C timp de 10 minute. Celulele au fost spălate de două ori cu tampon KPE înainte de resuspensia peletelor în 700μl de tampon KPE. Pentru deproteinare, 300l de 10% (w / v) acid sulfosalicilic au fost adăugate înainte de întreruperea celulelor prin ultrasonication (3 x 1 min; VialTweeter ultrasonicator). Supernatantele au fost colectate după centrifugare (30 min, 13,000g, 4 ° C). Concentrațiile de acid sulfosalicilic au scăzut până la 1%, prin adăugarea a 3 volume de tampon KPE. Au fost efectuate măsurători ale glutation totală și GSSG așa cum este descris mai sus. Concentrațiile de glutation celulare au fost calculate pe baza unui volum de celule de E. coli de 6,7×10-15 litru și o densitate celulară de A600 0,5 (echivalentă cu 1×108 celule ml-1 de cultură). Concentrațiile de GSH au fost calculate prin scăderea 2 [GSSG] din glutation totală. (Muller și colab. 2016)

    Expresia omului mAspAT în E. coli folosind un omogenizator cu ultrasunete

    Cu ultrasunete disruptor de celule UP400St (400W) pentru extracția materiei intracelulare (de exemplu proteine, organite, ADN, ARN etc.)Singura colonie de E. coli BL21 (DE3) care adăpostește vectorul de expresie în 30 ml de Luria-Bertani (LB) mediu conținând 100 pg / ml ampicilină și apoi cultivate la 37 ° C până când densitatea optică (DO600 de) A ajuns la 0,6. Celulele au fost recoltate prin centrifugare la 4000 x g timp de 10 min și resuspendate în mediu LB proaspăt 3L conținând 100 pg / ml ampicilină.
    Ulterior, expresia proteinelor a fost indusă cu izopropil 1 mM β-ᴅ-1-tiogalactopyranoside (IPTG) timp de 20 h la 16 ° C. Celulele au fost recoltate prin centrifugare la 8.000 × g timp de 15 minute și spălate cu tampon A (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4). Aproximativ 45g (greutate umedă) celule au fost obținute din cultura 3 L. După centrifugare, peletele celulare au fost resuspendate în 40 ml (pentru cultura 1 L) tampon de extracție rece ca gheața A și lizate prin ultrasonication la temperatură rece ca gheața folosind concasorul de celule cu ultrasunete Hielscher UP400St. Liza celulară a fost centrifugată la 12.000 rpm timp de 15 minute pentru a separa fracțiunile solubile (supernatante) și precipitate (peleți). (Jiang et al. 2015)
     



    Ce trebuie să știți

    E coli

    Escherichia coli (E. coli) este un gram-negativ, anaerob facultativ, în formă de tijă, coliform bacterie din Escherichia genul care se găsește de obicei în intestinul inferior al organismelor cu sânge cald (endoterme). Există un mare număr de tulpini de E. coli (sau subtipuri), cu diverse caracteristici. Cele mai multe tulpini de E. coli sunt inofensive pentru om, de ex tulpinile B și K-12, care sunt utilizate în mod obișnuit pentru aplicații de cercetare în laboratoare. Cu toate acestea, unele tulpini sunt dăunătoare și pot provoca boli grave.
    E. coli joacă un rol important în inginerie biologică modernă și microbiologie industrială, deoarece bacteriile este ușor de manipulat. aplicatii de laborator comune care implică adesea utilizarea de E. coli, de exemplu pentru a crea acidul dezoxiribonucleic recombinant (ADN) sau pentru a acționa ca un organism model.
    E. coli este o gazdă foarte versatil pentru producerea de proteine ​​heterologe și sisteme de expresie de proteine ​​multiple sunt disponibile pentru producerea proteinelor recombinante în E. coli. Folosind plasmide care permit exprimarea la nivel ridicat de proteine, genele pot fi introduse în bacterii, ceea ce permite de a produce astfel de proteine ​​în cantități mari în procesele de fermentație industriale.
    E. coli sunt folosite ca fabrici de celule pentru a produce insulină. Alte aplicații includ utilizarea celulelor modificate de E. coli pentru a dezvolta și produce vaccinuri și enzime imobilizate, pentru a produce biocombustibili, precum și pentru bioremediere.
    Tulpina K-12 este o formă mutantă de E. coli, care supra-exprimă enzima fosfatază alcalină (ALP). Aceasta mutatie se produce din cauza unui defect al genei care în mod constant codurile pentru enzima. Dacă o genă produce un produs fără nici o inhibiție aceasta este cunoscută ca o activitate constitutivă. Această formă mutantă specifică este folosit pentru izolarea și purificarea enzimei ALP.
    Bacteriile E. coli sunt, de asemenea, utilizate pe scară largă ca fabrici de celule. Microbii proiectați (de exemplu, bacteriile) și celulele plantelor pot fi utilizați ca așa-numite fabrici de celule. Aceste celule modificate genetic produc molecule, substanțe chimice, polimeri, proteine și alte substanțe, care sunt utilizate, de exemplu, în industria farmaceutică, alimentară și chimică. Pentru a elibera moleculele produse în interiorul unor astfel de celule bioinginerate, liza cu ultrasunete este o metodă comună de a perturba pereții celulari și de a transfera substanțele țintă în lichidul înconjurător. Citiți mai multe despre liza celulelor bioinginerate!

    Cu ultrasunete DNA Forfecare

    Forțele de forfecare cu ultrasunete sunt o metodă frecvent utilizată pentru a elibera molecule, organite și proteine din interiorul celulei, precum și pentru a rupe firele de ADN în bucăți. Cavitația acustică sparge pereții celulari și membranele pentru a extrage ADN-ul din celule și a genera fragmente de aproximativ 600 – 800 bp în lungime, care este ideal pentru analiză.
    Click aici pentru a afla mai multe despre omogenizatoare cu ultrasunete pentru fragmentarea ADN-ului!

    Literatură / Referințe


    Ultrasonics de înaltă performanță! Gama de produse Hielscher acoperă întregul spectru de la ultrasonicator de laborator compact peste banc-top unități la sisteme cu ultrasunete complet industriale.

    Hielscher Ultrasonics produce omogenizatoare cu ultrasunete de înaltă performanță de la laborator la dimensiunea industrială.


    Vom fi bucuroși să discutăm despre procesul dvs.

    Să intrăm în contact.