Liza cu ultrasunete a celulelor bioinginerești în producția industrială

Speciile de bacterii bioinginerești, cum ar fi E. coli, precum și tipurile de celule de mamifere și plante modificate genetic sunt utilizate pe scară largă în biotehnologie pentru a exprima molecule. Pentru a elibera aceste bio-molecule sintetizate, este necesară o tehnică fiabilă de întrerupere celulară. Ultrasonication de înaltă performanță este o metodă dovedită pentru liza celulară eficientă și fiabilă – ușor scalabil la debite mari. Hielscher Ultrasonics vă oferă echipamente cu ultrasunete de înaltă performanță pentru liza celulară eficientă, în scopul de a produce volume mari de bio-molecule de înaltă calitate.

Extracția moleculelor din fabricile de celule

Pentru producerea unei game largi de biomolecule, diferiți microbi și celule vegetale pot fi utilizate ca fabrici de celule microbiene, inclusiv Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, Cyanobacteria, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Nicotiana benthamiana și alge, printre multe altele. Aceste fabrici de celule pot produce proteine, lipide, biochimice, polimeri, biocombustibili și oleochimice, care sunt utilizate ca alimente sau materii prime pentru aplicații industriale. Celulele utilizate ca fabrici de celule sunt cultivate în bioreactoare închise, unde pot atinge o eficiență ridicată, specificitate și cerințe reduse de energie.
Pentru a izola moleculele țintă de culturile celulare bioinginerizate, celulele trebuie perturbate astfel încât materialul intracelular să fie eliberat. Perturbatorii de celule cu ultrasunete sunt bine stabiliți ca tehnică extrem de fiabilă și eficientă pentru dezintegrarea celulelor și eliberarea compusului.

Fabricile de celule microbiene sunt celule modificate metabolic utilizate pentru sinteza diferiților compuși valoroși. Întreruperea celulelor cu ultrasunete este o metodă eficientă și fiabilă pentru a elibera compușii valoroși din interiorul celulei.
studiu și grafic: ©Villaverde, 2010.

Avantajele disruptoarelor de celule cu ultrasunete

Ca o tehnologie non-termică, ușoară, dar extrem de eficientă, disruptorii cu ultrasunete sunt utilizați în laborator și industrie pentru a liza celulele și pentru a produce extracte de înaltă calitate, de exemplu utilizate pentru izolarea moleculelor din fabricile de celule.

Power-ultrasunete pentru perturbarea eficientă a fabricilor de celule microbiene

Mecanismul și efectele disruptorilor de celule cu ultrasunete:
Întreruperea celulelor cu ultrasunete a folosit puterea undelor cu ultrasunete. Omogenizatorul cu ultrasunete / disruptorul de celule este echipat cu o sondă (aka sonotrode) realizată din aliaj de titan care oscilează la o frecvență ridicată de aproximativ 20 kHz. Aceasta înseamnă că sonda cu ultrasunete cuplează 20.000 de vibrații pe secundă în lichidul sonicat. Undele cu ultrasunete cuplate în lichid sunt caracterizate prin cicluri alternative de înaltă presiune / joasă presiune. În timpul unui ciclu de joasă presiune, lichidul se extinde și apar bule de vid minuscule. Aceste bule foarte mici cresc de-a lungul mai multor cicluri de presiune alternativă până când nu mai pot absorbi energie. În acest moment, bulele de cavitație fac implozie violentă și creează local un mediu extraordinar de dens energetic. Acest fenomen este cunoscut sub numele de cavitație acustică și se caracterizează prin temperaturi locale foarte ridicate, presiuni foarte mari și forțe de forfecare. Aceste solicitări de forfecare sparg eficient pereții celulari și cresc transferul de masă între interiorul celulei și solventul înconjurător. Ca tehnică pur mecanică, forțele de forfecare generate ultrasonically sunt utilizate pe scară largă și procedura recomandată pentru întreruperea celulelor bacteriene, precum și pentru izolarea proteinelor. Ca metodă simplă și rapidă de întrerupere a celulelor, sonicare este ideal pentru izolarea volumelor mici, mijlocii și mari. Hielscher ultrasonicators digitale sunt echipate cu un meniu clar de setări pentru un control precis sonicare. Toate datele sonicare sunt stocate automat pe un built-in SD-card și sunt pur și simplu accesibile. Opțiuni sofisticate de disipare a căldurii, ar fi răcire externă, sonicare în modul puls etc. în timpul procesului de dezintegrare cu ultrasunete asigură menținerea temperaturii ideale a procesului și, prin urmare, intactitatea compușilor sensibili la căldură extrași.

Cercetarea subliniază punctele forte ale întreruperii și extracției celulelor cu ultrasunete

Prof. Chemat et al. (2017) reia în studiul lor că "extracția asistată cu ultrasunete este o alternativă verde și viabilă din punct de vedere economic la tehnicile convenționale pentru alimente și produse naturale. Principalele beneficii sunt reducerea timpului de extracție și procesare, cantitatea de energie și solvenți utilizați, operațiunile unitare și CO₂ emisii."
Gabig-Ciminska et al. (2014) au folosit un omogenizator de înaltă presiune și un dsintegrator de celule cu ultrasunete în studiul lor pentru liza sporilor pentru a elibera ADN. Comparând ambele metode de perturbare celulară, echipa de cercetare concluzionează că, în ceea ce privește liza celulară pentru ADN-ul sporilor, "analiza a fost făcută prin utilizarea lizaților celulari din omogenizarea la presiune înaltă. Ulterior, ne-am dat seama că o întrerupere a celulelor cu ultrasunete are avantaje remarcabile în acest scop. Este destul de rapid și poate fi procesat pentru volume mici de probe." (Gabig-Ciminska și colab., 2014)

Biomolecule din fabricile de celule pentru producția de alimente

Fabricile de celule microbiene sunt o metodologie de producție viabilă și eficientă care utilizează organisme microbiene pentru a produce randamente ridicate de metaboliți nativi și non-nativi prin bioingineria metabolică a microorganismelor microbiene, cum ar fi bacteriile, drojdiile, ciupercile etc. Enzimele în vrac sunt, de exemplu, produse folosind microorganisme precum Aspergillus oryzae, ciuperci și bacterii. Aceste enzime în vrac sunt utilizate pentru producția de alimente și băuturi, precum și în agricultură, bioenergie și îngrijirea gospodăriei.
Anumite bacterii, cum ar fi Acetobacter xylinum și Gluconacetobacter xylinus, produc celuloză în timpul procesului de fermentație, unde nanofibrele sunt sintetizate într-un proces de jos în sus. Celuloza bacteriană (cunoscută și sub denumirea de celuloză microbiană) este echivalentă din punct de vedere chimic cu celuloza vegetală, dar are un grad ridicat de cristalinitate și puritate ridicată (fără lignină, hemiceluloză, pectină și alte componente biogene), precum și o structură unică de rețea tridimensională (3D) țesută cu nanofibre de celuloză. (cf. Zhong, 2020) În comparație cu celuloza derivată din plante, celuloza bacteriană este mai durabilă, iar celuloza produsă este pură, nenecesitând etape complexe de purificare. Ultrasonication și extracția cu solvent folosind NaOH sau SDS (dodecil sulfat de sodiu) sunt foarte eficiente pentru izolarea celulozei bacteriene din celulele bacteriene.

Biomolecule din fabricile de celule pentru producția farmaceutică și de vaccinuri

Unul dintre cele mai proeminente produse farmaceutice derivate din fabricile de celule este insulina umană. Pentru producția de insulină prin bioinginerie, se utilizează predominant E. coli și Saccharomyces cerevisiae. Deoarece moleculele nano-sintetizate oferă o biocompatibilitate ridicată, nanoparticulele biologice, cum ar fi feritina, sunt avantajoase pentru numeroase aplicații de biofabricare. În plus, producția de microbi modificați metabolic este adesea semnificativ mai eficientă în randamentele obținute. De exemplu, producția de acid artemisinic, resveratrol și licopen a crescut de zece ori până la câteva sute de ori și este deja stabilită sau este în curs de dezvoltare la scară industrială. (cf. Liu et al.; Microb. Fapt celular. 2017)
De exemplu, biomoleculele de dimensiuni nano pe bază de proteine, cu proprietăți de auto-asamblare, cum ar fi feritina și particulele asemănătoare virusului, sunt deosebit de interesante pentru dezvoltarea vaccinurilor, deoarece imită atât dimensiunea, cât și structura agenților patogeni și pot fi conjugate la suprafață a antigenelor pentru a promova interacțiunea cu celulele imune. Astfel de molecule sunt exprimate în așa-numitele fabrici de celule (de exemplu, tulpini de E. coli proiectate), care produc o anumită moleculă țintă.

Protocol pentru liza cu ultrasunete și a E. coli BL21 pentru eliberarea feritinei

Feritina este o proteină, a cărei funcție principală este depozitarea fierului. Feritina prezintă capacități promițătoare ca nanoparticule de auto-asamblare în vaccinuri, unde este utilizată ca vehicul de livrare a vaccinului (de exemplu, proteinele spike SARS-Cov-2). Cercetarea științifică a lui Sun et. al. (2016) arată că feritina recombinantă poate fi eliberată ca formă solubilă din Escherichia coli la concentrații scăzute de NaCl (≤50 mmol / l). Pentru a exprima feritina în E. coli BL21 și pentru a elibera fertina, a fost aplicat cu succes următorul protocol. Plasmida recombinantă pET-28a/feritină a fost transformată în tulpina E coli BL21 (DE3). Celulele feritinei E coli BL21 (DE3) au fost cultivate în medii de creștere LB cu 0,5% kanamicină la 37°C și induse la un OD600 de 0,6 cu 0,4% izopropil-β-D-tiogalactopiranozidă timp de 3 ore la 37°C. Cultura finală a fost apoi recoltată prin centrifugare la 8000g timp de 10 minute la 4 ° C, iar granula a fost colectată. Apoi, granula a fost resuspendată în mediu LB (1% NaCl, 1% Typone, 0,5% extract de drojdie) / tampon de liză (20 mmol / L Tris, 50 mmol / L NaCl, 1 mmol / L EDTA, pH 7,6) și diferite concentrații de soluție de NaCl (0, 50, 100, 170 și respectiv 300 mmol / L). Pentru liza celulelor bacteriene, sonicare a fost aplicat în modul puls: de exemplu, folosind Ultrasonicator UP400St la amplitudine 100% cu un ciclu de funcționare de 5 secunde PORNIT, 10 secunde OPRIT, timp de 40 de cicluri) și apoi centrifugat la 10 000 g timp de 15 minute la 4 °C. Supernatantul și precipitatul au fost analizate prin electroforeză în gel de poliacrilamidă de dodecil sulfat de sodiu (SDS-PAGE). Toate gelurile colorate cu dodecil sulfat de sodiu au fost scanate cu scaner de înaltă rezoluție. Imaginile cu gel au fost analizate folosind software-ul Magic Chemi 1D. Pentru o claritate optimă, benzile de proteine au fost detectate prin ajustarea parametrilor. Datele pentru benzi au fost generate din triplicatele tehnice. (cf. Sun et al., 2016)

Perturbatoare de celule cu ultrasunete pentru liza industrială a fabricilor de celule

Liza și extracția cu ultrasunete este o metodă fiabilă și confortabilă de eliberare a metaboliților din fabricile de celule, ajutând astfel o producție eficace de molecule țintă. Perturbatorii de celule cu ultrasunete sunt disponibili de la laborator la dimensiunea industrială și procesele pot fi scalate complet liniar.
Hielscher Ultrasonics este partenerul dvs. competent pentru disruptoare cu ultrasunete de înaltă performanță și are o experiență îndelungată în domeniul implantării sistemelor cu ultrasunete în banc-top și setări industriale.
Când vine vorba de hardware și software sofisticat, Hielscher Ultrasonics sisteme de întrerupere a celulelor îndeplinește toate cerințele pentru un control optim al procesului, operare ușoară și ușurință în utilizare. Clienții și utilizatorul ultrasonicators Hielscher apreciază beneficiul pe care Hielscher disruptori de celule cu ultrasunete și extractoare permit monitorizarea și controlul precis al procesului – prin afișaj tactil digital și telecomandă browser. Toate datele importante sonicare (de exemplu, energia netă, energia totală, amplitudinea, durata, temperatura, presiunea) sunt stocate automat ca fișier CSV pe un card SD integrat. Acest lucru ajută la obținerea unor rezultate reproductibile și repetabile și facilitează standardizarea proceselor, precum și îndeplinirea bunelor practici de fabricație (cGMP).
Desigur, procesoarele cu ultrasunete Hielscher sunt construite pentru funcționarea 24/7 sub sarcină maximă și, prin urmare, pot fi operate în mod fiabil în setările de producție industrială. Datorită robusteții ridicate și a întreținerii reduse, timpul de nefuncționare al echipamentului cu ultrasunete este foarte scăzut. Caracteristicile CIP (clean-in-place) și SIP (sterilize-in-place) minimizează curățarea laborioasă, mai ales că toate piesele umede sunt suprafețe metalice netede (fără orificii sau duze ascunse).

Tabelul de mai jos vă oferă o indicație a capacității aproximative de procesare a ultrasonicators noastre: