Liza cu ultrasunete a celulelor bioinginerite în producția industrială

Specii bacteriene bioinginerite, precum E. coli, precum și tipuri de celule de mamifere și vegetale modificate genetic sunt utilizate pe scară largă în biotehnologie pentru exprimarea moleculelor. Pentru a elibera aceste biomolecule sintetizate, este necesară o tehnică fiabilă de dezintegrare a celulelor. Ultrasonicarea de înaltă performanță este o metodă dovedită pentru liza celulară eficientă și fiabilă – ușor scalabilă la capacități mari de procesare. Hielscher Ultrasonics vă oferă echipamente cu ultrasunete de înaltă performanță pentru liza celulară eficace, în vederea producerii unor volume mari de biomolecule de înaltă calitate.

Extracția moleculelor din fabricile celulare

Pentru producerea unei game largi de biomolecule, diverse microorganisme modificate și celule vegetale pot fi utilizate ca fabrici celulare microbiene, inclusiv Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, Cyanobacteria, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Nicotiana benthamiana și alge, printre multe altele. Aceste fabrici celulare pot produce proteine, lipide, substanțe biochimice, polimeri, biocombustibili și oleochimicale, care sunt utilizate ca alimente sau ca materie primă pentru aplicații industriale. Celulele utilizate ca fabrici celulare sunt cultivate în bioreactoare închise, unde pot atinge eficiență și specificitate ridicate și cerințe energetice scăzute.
Pentru a izola moleculele-țintă din culturile de celule bioinginerite, celulele trebuie dezintegrate astfel încât materialul intracelular să fie eliberat. Dezintegratoarele celulare cu ultrasunete sunt bine consacrate ca tehnică extrem de fiabilă și eficientă pentru dezintegrarea celulelor și eliberarea compușilor.

Fabricile celulare microbiene sunt celule modificate metabolic, utilizate pentru sinteza diverșilor compuși valoroși. Dezintegrarea celulelor cu ultrasunete este o metodă eficientă și fiabilă pentru eliberarea compușilor valoroși din interiorul celulei.
studiu și grafic: ©Villaverde, 2010.

Avantajele dezintegratoarelor celulare cu ultrasunete

Fiind o tehnologie netermică, blândă, dar extrem de eficientă, dezintegratoarele cu ultrasunete sunt utilizate în laborator și în industrie pentru liza celulelor și pentru producerea de extracte de înaltă calitate, utilizate de ex. pentru izolarea moleculelor din fabricile celulare.

Ultrasunete de putere pentru dezintegrarea eficientă a fabricilor celulare microbiene

Mecanismul și efectele dezintegratoarelor celulare cu ultrasunete:
Dezintegrarea celulelor cu ultrasunete utilizează puterea undelor ultrasonice. Omogenizatorul cu ultrasunete / dezintegratorul celular este echipat cu o sondă (numită și sonotrodă) realizată din aliaj de titan, care oscilează la o frecvență înaltă de aprox. 20 kHz. Aceasta înseamnă că sonda ultrasonică cuplează 20.000 de vibrații pe secundă în lichidul sonicat. Undele ultrasonice cuplate în lichid se caracterizează prin cicluri alternante de presiune înaltă / presiune joasă. În timpul unui ciclu de presiune joasă, lichidul se dilată și apar bule minuscule de vid. Aceste bule foarte mici cresc pe parcursul mai multor cicluri alternante de presiune până când nu mai pot absorbi energie suplimentară. În acest punct, bulele de cavitație implodează violent și creează local un mediu extraordinar de dens energetic. Acest fenomen este cunoscut sub numele de cavitație acustică și se caracterizează prin temperaturi local foarte ridicate, presiuni foarte ridicate și forțe de forfecare. Aceste tensiuni de forfecare rup eficient pereții celulari și intensifică transferul de masă dintre interiorul celulei și solventul înconjurător. Ca tehnică pur mecanică, forțele de forfecare generate ultrasonic sunt utilizate pe scară largă și reprezintă procedura recomandată pentru dezintegrarea celulelor bacteriene, precum și pentru izolarea proteinelor. Ca metodă simplă și rapidă de dezintegrare a celulelor, sonicarea este ideală pentru izolarea în volume mici, medii și mari. Ultrasonicatoarele digitale Hielscher sunt echipate cu un meniu clar de setări pentru controlul precis al sonicării. Toate datele de sonicare sunt stocate automat pe un card SD încorporat și sunt ușor accesibile. Opțiunile sofisticate de disipare a căldurii, precum răcirea externă, sonicarea în mod pulsat etc., în timpul procesului de dezintegrare cu ultrasunete asigură menținerea temperaturii ideale de proces și, prin urmare, integritatea compușilor termosensibili extrași.

Cercetările subliniază punctele forte ale dezintegrării celulelor și extracției cu ultrasunete

Prof. Chemat et al. (2017) rezumă în studiul lor că „extracția asistată de ultrasunete este o alternativă ecologică și viabilă din punct de vedere economic la tehnicile convenționale pentru alimente și produse naturale. Principalele beneficii sunt reducerea timpului de extracție și procesare, a cantității de energie și solvenți utilizați, a operațiunilor unitare și a cantității de CO₂ emise.”
Gabig-Ciminska et al. (2014) au utilizat în studiul lor un omogenizator de înaltă presiune și un dezintegrator celular cu ultrasunete pentru liza sporilor în vederea eliberării ADN-ului. Comparând ambele metode de dezintegrare a celulelor, echipa de cercetare concluzionează, în privința lizei celulare pentru ADN-ul sporilor: „analiza a fost efectuată utilizând lizate celulare obținute prin omogenizarea la înaltă presiune. Ulterior, ne-am dat seama că dezintegrarea celulelor cu ultrasunete are avantaje remarcabile în acest scop. Este destul de rapidă și poate fi aplicată pentru volume mici de probă.” (Gabig-Ciminska et al., 2014)

Biomolecule din fabrici celulare pentru producția alimentară

Fabricile celulare microbiene reprezintă o metodologie de producție viabilă și eficientă, care utilizează organisme microbiene pentru a produce randamente ridicate de metaboliți nativi și non-nativi prin bioinginerie metabolică a microorganismelor microbiene, precum bacterii, drojdii, fungi etc. Enzimele în vrac sunt produse, de exemplu, folosind microorganisme precum Aspergillus oryzae, fungi și bacterii. Aceste enzime în vrac sunt utilizate pentru producția de alimente și băuturi, precum și în agricultură, bioenergie și îngrijirea locuinței.
Anumite bacterii, precum Acetobacter xylinum și Gluconacetobacter xylinus, produc celuloză în timpul procesului de fermentație, în care nanofibrele sunt sintetizate printr-un proces de tip bottom-up. Celuloza bacteriană (cunoscută și sub numele de celuloză microbiană) este chimic echivalentă cu celuloza vegetală, dar are un grad ridicat de cristalinitate și o puritate ridicată (fără lignină, hemiceluloză, pectină și alte componente biogene), precum și o structură unică de rețea reticulată tridimensională (3D) țesută din nanofibre de celuloză. (cf. Zhong, 2020) Comparativ cu celuloza de origine vegetală, celuloza bacteriană este mai sustenabilă, iar celuloza produsă este pură, nefiind necesare etape complexe de purificare. Ultrasonicarea și extracția cu solvenți folosind NaOH sau SDS (dodecil sulfat de sodiu) sunt foarte eficiente pentru izolarea celulozei bacteriene din celulele bacteriene.

Biomolecule din fabrici celulare pentru producția farmaceutică și de vaccinuri

Unul dintre cele mai proeminente produse farmaceutice obținute din fabrici celulare este insulina umană. Pentru producția de insulină prin bioinginerie se utilizează predominant E. coli și Saccharomyces cerevisiae. Deoarece moleculele de dimensiuni nanometrice biosintetizate oferă o biocompatibilitate ridicată, nanoparticulele biologice precum feritina sunt avantajoase pentru numeroase aplicații de biofabricație. În plus, producția în microorganisme modificate metabolic este adesea semnificativ mai eficace în ceea ce privește randamentele obținute. De exemplu, producția de acid artemisinic, resveratrol și licopen a crescut de zece ori până la de câteva sute de ori și este deja stabilită sau în curs de dezvoltare la scară industrială. (cf. Liu et al.; Microb. Cell Fact. 2017)
De exemplu, biomoleculele nanometrice pe bază de proteine cu proprietăți de autoasamblare, precum feritina și particulele asemănătoare virusurilor, sunt deosebit de interesante pentru dezvoltarea vaccinurilor, deoarece imită atât dimensiunea, cât și structura agenților patogeni și se pretează conjugării de suprafață a antigenelor pentru a favoriza interacțiunea cu celulele imune. Astfel de molecule sunt exprimate în așa-numitele fabrici celulare (de ex., tulpini modificate de E. coli), care produc o anumită moleculă-țintă.

Protocol de liză cu ultrasunete a E. coli BL21 pentru eliberarea feritinei

Feritina este o proteină a cărei funcție principală este stocarea fierului. Feritina prezintă capacități promițătoare ca nanoparticule autoasamblante în vaccinuri, unde este utilizată ca vehicul de livrare a vaccinului (de ex. proteinele spike ale SARS-Cov-2). Cercetarea științifică a lui Sun et. al. (2016) arată că feritina recombinantă poate fi eliberată sub formă solubilă din Escherichia coli la concentrații scăzute de NaCl (≤50 mmol/L). Pentru a exprima feritina în E. coli BL21 și a elibera feritina, a fost aplicat cu succes următorul protocol. Plasmidul recombinant pET-28a/feritină a fost transformat în tulpina E coli BL21 (DE3). Celulele E coli BL21 (DE3) cu feritină au fost cultivate în mediu de creștere LB cu 0,5% kanamicină la 37°C și induse la o OD600 de 0,6 cu 0,4% izopropil-β-D-tiogalactopiranozidă timp de 3 ore la 37°C. Cultura finală a fost apoi recoltată prin centrifugare la 8000g timp de 10 minute la 4°C, iar peletul a fost colectat. Apoi, peletul a fost resuspendat în mediu LB (1% NaCl, 1% Typone, 0,5% extract de drojdie)/tampon de liză (20 mmol/L Tris, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7,6) și, respectiv, în diferite concentrații de soluție de NaCl (0, 50, 100, 170 și 300 mmol/L). Pentru liza celulelor bacteriene, sonicarea a fost aplicată în mod pulsat: de ex., folosind ultrasonicatorul UP400St la amplitudine de 100%, cu un ciclu de funcționare de 5 secunde pornit, 10 secunde oprit, timp de 40 de cicluri) și apoi s-a centrifugat la 10 000g timp de 15 minute la 4°C. Supernatantul și precipitatul au fost analizate prin electroforeză în gel de poliacrilamidă cu dodecil sulfat de sodiu (SDS-PAGE). Toate gelurile colorate cu dodecil sulfat de sodiu au fost scanate cu un scaner de înaltă rezoluție. Imaginile gelurilor au fost analizate cu software-ul Magic Chemi 1D. Pentru o claritate optimă, benzile proteice au fost detectate prin ajustarea parametrilor. Datele pentru benzi au fost generate din triplicate tehnice. (cf. Sun et al., 2016)

Dezintegratoare celulare cu ultrasunete pentru liza industrială a fabricilor celulare

Liza și extracția cu ultrasunete reprezintă o metodă fiabilă și comodă de eliberare a metaboliților din fabricile celulare, contribuind astfel la o producție eficace a moleculelor-țintă. Dezintegratoarele celulare cu ultrasunete sunt disponibile de la dimensiuni de laborator până la dimensiuni industriale, iar procesele pot fi scalate complet liniar.
Hielscher Ultrasonics este partenerul dumneavoastră competent pentru dezintegratoare cu ultrasunete de înaltă performanță și are o experiență îndelungată în domeniul implementării sistemelor cu ultrasunete în medii de banc de laborator și industriale.
În ceea ce privește hardware-ul și software-ul sofisticate, sistemele de dezintegrare a celulelor Hielscher Ultrasonics îndeplinesc toate cerințele pentru un control optim al procesului, o operare ușoară și ușurință în utilizare. Clienții și utilizatorii ultrasonicatoarelor Hielscher apreciază avantajul că dezintegratoarele celulare și extractoarele cu ultrasunete Hielscher permit monitorizarea și controlul precis al procesului – prin intermediul afișajului digital tactil și al controlului de la distanță prin browser. Toate datele importante de sonicare (de ex. energia netă, energia totală, amplitudinea, durata, temperatura, presiunea) sunt stocate automat ca fișier CSV pe un card SD integrat. Acest lucru ajută la obținerea unor rezultate reproductibile și repetabile și facilitează standardizarea proceselor, precum și respectarea Bunelor Practici de Fabricație (cGMP).
Desigur, procesoarele cu ultrasunete Hielscher sunt construite pentru funcționare 24/7 la sarcină maximă și, prin urmare, pot fi operate în mod fiabil în medii de producție industrială. Datorită robusteții ridicate și întreținerii reduse, timpul de nefuncționare al echipamentelor cu ultrasunete este cu adevărat redus. Funcțiile CIP (clean-in-place, curățare în poziție) și SIP (sterilize-in-place, sterilizare în poziție) reduc la minimum curățarea laborioasă, mai ales deoarece toate piesele care vin în contact cu lichidul sunt suprafețe metalice netede (fără orificii sau duze ascunse).

Tabelul de mai jos vă oferă o indicație privind capacitatea aproximativă de procesare a ultrasonicatoarelor noastre: