Producția biosintetică a oligozaharidelor din laptele uman

Biosinteza oligozaharidelor din laptele uman (HMO) prin fermentație sau reacții enzimatice este un proces complex, consumator de resurse și adesea cu randament scăzut. Ultrasonicarea crește transferul de masă între substrat și fabricile celulare și stimulează creșterea și metabolismul celular. Astfel, sonicarea intensifică procesele de fermentație și biochimice, ducând la o producție accelerată și mai eficientă de HMO.

Oligozaharidele din laptele uman

Oligozaharidele din laptele uman (HMO), cunoscute și ca glicani din laptele uman, sunt molecule de zahăr care fac parte din grupul oligozaharidelor. Exemple importante de HMO includ 2’-fucozillactoza (2′-FL), lacto-N-neotetraoza (LNnT), 3’-galactozillactoza (3′-GL) și difucozillactoza (DFL).
Deși laptele matern uman este compus din peste 150 de structuri HMO diferite, doar 2′-fucozillactoza (2′-FL) și lacto-N-neotetraoza (LNnT) sunt produse în prezent la nivel comercial și utilizate ca aditivi nutriționali în formulele de lapte pentru sugari.
Oligozaharidele din laptele uman (HMO) sunt cunoscute pentru importanța lor în nutriția bebelușilor. Oligozaharidele din laptele uman sunt un tip unic de nutrienți, care acționează ca prebiotice, antimicrobiene antiadezive și imunomodulatori în intestinul sugarului și contribuie substanțial la dezvoltarea creierului. HMO se găsesc exclusiv în laptele matern uman; alte tipuri de lapte de mamifere (de ex. de vacă, capră, oaie, cămilă etc.) nu conțin aceste forme specifice de oligozaharide.
Oligozaharidele din laptele uman sunt a treia cea mai abundentă componentă solidă din laptele uman, care poate fi prezentă fie sub formă dizolvată, fie emulsionată, fie suspendată în apă. Lactoza și acizii grași sunt cele mai abundente substanțe solide din laptele uman. HMO sunt prezente într-o concentrație de 0,35–0,88 uncii (9,9–24,9 g)/ L. Sunt cunoscute aproximativ 200 de oligozaharide din laptele uman diferite din punct de vedere structural. Oligozaharida dominantă la 80% dintre toate femeile este 2′-fucozillactoza, care este prezentă în laptele matern uman într-o concentrație de aproximativ 2,5 g/ L.
Deoarece HMO nu sunt digerate, ele nu contribuie caloric la nutriție. Fiind carbohidrați nedigerabili, acestea funcționează ca prebiotice și sunt fermentate selectiv de microflora intestinală dezirabilă, în special de bifidobacterii.

Biosinteza oligozaharidelor din laptele uman

Fabricile celulare și sistemele enzimatice / chemo-enzimatice sunt tehnologiile actuale utilizate pentru sinteza HMO. Pentru producția de HMO la scară industrială, fermentația fabricilor celulare microbiene, sinteza biochimică și diferite reacții enzimatice sunt căi fezabile de bioproducție a HMO. Din motive economice, biosinteza prin fabrici celulare microbiene este în prezent singura tehnică utilizată la nivel de producție industrială a HMO.

Fermentația HMO cu ajutorul fabricilor celulare microbiene

E.coli, Saccharomyces cerevisiae și Lactococcus lactis sunt fabrici celulare utilizate frecvent pentru bioproducția de molecule biologice precum HMO. Fermentația este un proces biochimic care utilizează microorganisme pentru a converti un substrat în molecule biologice țintă. Fabricile celulare microbiene utilizează zaharuri simple ca substrat, pe care le convertesc în HMO. Deoarece zaharurile simple (de ex. lactoza) sunt un substrat abundent și ieftin, acest lucru menține procesul de biosinteză eficient din punct de vedere al costurilor.
Creșterea și rata de bioconversie sunt influențate în principal de transferul de masă al nutrienților (substratului) către microorganisme. Rata transferului de masă este un factor principal care afectează sinteza produsului în timpul fermentației. Este bine cunoscut faptul că ultrasonicarea favorizează transferul de masă.
În timpul fermentației, condițiile din bioreactor trebuie monitorizate și reglate constant, astfel încât celulele să poată crește cât mai rapid posibil pentru a produce apoi biomoleculele țintă (de ex. oligozaharide precum HMO; insulină; proteine recombinante). Teoretic, formarea produsului începe imediat ce cultura celulară începe să crească. Totuși, în special în cazul celulelor modificate genetic, cum ar fi microorganismele obținute prin inginerie genetică, aceasta este de obicei indusă mai târziu prin adăugarea unei substanțe chimice în substrat, care reglează ascendent expresia biomoleculei țintă. Bioreactoarele cu ultrasunete (sono-bioreactoare) pot fi controlate precis și permit stimularea specifică a microbilor. Acest lucru duce la o biosinteză accelerată și la randamente mai mari.
Liza și extracția cu ultrasunete: fermentația HMO complexe poate fi limitată de titruri scăzute de fermentație și de produsele care rămân intracelular. Liza și extracția cu ultrasunete sunt utilizate pentru a elibera materialul intracelular înainte de purificare și de procesele din aval.

Fermentația favorizată de ultrasunete

Rata de creștere a microbilor precum Escherichia coli, E.coli modificată genetic, Saccharomyces cerevisiae și Lactococcus lactis poate fi accelerată prin creșterea ratei transferului de masă și a permeabilității peretelui celular, prin aplicarea unei ultrasonicări controlate de joasă frecvență. Ca tehnică de procesare blândă, nontermică, ultrasonicarea aplică forțe pur mecanice în bulionul de fermentație.
Cavitația acustică: principiul de funcționare al sonicării se bazează pe cavitația acustică. Sonda ultrasonică (sonotroda) cuplează unde ultrasonice de joasă frecvență în mediu. Undele ultrasonice se propagă prin lichid, creând cicluri alternante de presiune înaltă (compresie) / presiune joasă (rarefiere). Prin comprimarea și întinderea lichidului în cicluri alternante, apar bule minuscule de vid. Aceste mici bule de vid cresc pe parcursul mai multor cicluri până când ating o dimensiune la care nu mai pot absorbi energie suplimentară. În acest punct de creștere maximă, bula de vid implodează violent și generează local condiții extreme, cunoscute ca fenomenul de cavitație. În „punctul fierbinte” cavitațional pot fi observate diferențe mari de presiune și temperatură și forțe intense de forfecare, cu jeturi de lichid de până la 280m/sec. Prin aceste efecte cavitaționale se obțin un transfer de masă temeinic și sonoporarea (perforarea pereților celulari și a membranelor celulare). Nutrienții substratului sunt transportați către și în interiorul celulelor întregi vii, astfel încât fabricile celulare sunt hrănite optim, iar ratele de creștere și de conversie sunt accelerate. Bioreactoarele cu ultrasunete reprezintă o strategie simplă, dar foarte eficientă de procesare a biomasei într-un proces de biosinteză de tip one-pot.
Este bine cunoscut faptul că o sonicare blândă, controlată precis, intensifică procesele de fermentație.
Sonicarea îmbunătățește „productivitatea multor bioprocese care implică celule vii prin intensificarea absorbției substratului, producție sau creștere îmbunătățită prin creșterea porozității celulare și, potențial, eliberarea îmbunătățită a componentelor celulare.” (Naveena et al. 2015)
Aflați mai multe despre fermentația asistată de ultrasunete!

Naveena et al. (2015) au constatat că intensificarea cu ultrasunete oferă mai multe avantaje în bioprocesare, inclusiv costuri de operare scăzute comparativ cu alte opțiuni de tratament de intensificare, simplitatea operării și cerințe modeste de putere.

Reactoare de fermentație cu ultrasunete de înaltă performanță

Procesele de fermentație implică microorganisme vii, cum ar fi bacteriile sau drojdiile, care funcționează ca fabrici celulare. Deși sonicarea este aplicată pentru a favoriza transferul de masă și a crește rata de creștere și de conversie a microorganismelor, este esențial ca intensitatea ultrasonică să fie controlată precis pentru a evita distrugerea fabricilor celulare.
Hielscher Ultrasonics este specializată în proiectarea, fabricarea și distribuția de ultrasonicatoare de înaltă performanță, care pot fi controlate și monitorizate precis pentru a asigura randamente superioare de fermentație.

Controlul procesului nu este doar esențial pentru randamente ridicate și o calitate superioară, ci permite și repetarea și reproducerea rezultatelor. Mai ales când vine vorba de stimularea fabricilor celulare, adaptarea specifică celulelor a parametrilor de sonicare este esențială pentru a obține randamente ridicate și pentru a preveni degradarea celulelor. Prin urmare, toate modelele digitale de ultrasonicatoare Hielscher sunt echipate cu software inteligent, care vă permite să ajustați, să monitorizați și să revizuiți parametrii de sonicare. Parametrii procesului ultrasonic, cum ar fi amplitudinea, temperatura, presiunea, durata sonicării, ciclurile de funcționare și aportul de energie, sunt esențiali pentru a favoriza producția de HMO prin fermentație.
Software-ul inteligent al ultrasonicatoarelor Hielscher înregistrează automat toți parametrii importanți ai procesului pe cardul SD integrat. Înregistrarea automată a datelor procesului de sonicare reprezintă fundamentul standardizării procesului și al reproductibilității / repetabilității, care sunt necesare pentru Bunele Practici de Fabricație (GMP).

Reactoare cu ultrasunete pentru fermentație

Hielscher oferă sonde ultrasonice de diverse dimensiuni, lungimi și geometrii, care pot fi utilizate atât pentru tratamente în șarjă, cât și pentru tratamente în flux continuu. Reactoarele cu ultrasunete, cunoscute și ca sono-bioreactoare, sunt disponibile pentru orice volum, acoperind bioprocesarea cu ultrasunete de la probe mici de laborator până la nivel pilot și de producție complet comercială.
Este bine cunoscut faptul că poziția sonotrodei ultrasonice în vasul de reacție influențează distribuția cavitației și a micro-curenților în mediu. Sonotroda și reactorul cu ultrasunete trebuie alese în funcție de volumul de procesare al bulionului celular. Deși sonicarea poate fi efectuată atât în șarjă, cât și în regim continuu, pentru volume mari de producție se recomandă utilizarea unei instalații cu flux continuu. La trecerea printr-o celulă de flux ultrasonică, întregul mediu celular primește exact aceeași expunere la sonicare, asigurând cel mai eficient tratament. Gama largă de sonde ultrasonice și reactoare cu celulă de flux de la Hielscher Ultrasonics permite asamblarea configurației ideale pentru bioprocesarea cu ultrasunete.

Hielscher Ultrasonics – de la laborator la pilot și la producție

Hielscher Ultrasonics acoperă întregul spectru de echipamente cu ultrasunete, oferind omogenizatoare cu ultrasunete compacte, ținute în mână, pentru prepararea probelor, sisteme de banc și pilot, precum și unități industriale cu ultrasunete puternice, care procesează cu ușurință încărcături de camion pe oră. Fiind versatile și flexibile în ceea ce privește opțiunile de instalare și montare, ultrasonicatoarele Hielscher pot fi integrate cu ușurință în toate tipurile de reactoare în șarjă, sisteme fed-batch sau configurații cu flux continuu.
Diverse accesorii, precum și piese personalizate permit adaptarea ideală a configurației dumneavoastră cu ultrasunete la cerințele procesului dumneavoastră.
Construite pentru funcționare 24/7 la sarcină maximă și în regim intens, în condiții solicitante, procesoarele cu ultrasunete Hielscher sunt fiabile și necesită doar o întreținere redusă.
Tabelul de mai jos vă oferă o indicație privind capacitatea de procesare aproximativă a ultrasonicatoarelor noastre: