Biosynthetic Production of Human Milk Oligosaccharides
Oligozaharide din lapte uman
Oligozaharidele din laptele uman (HMO), cunoscute și sub numele de glicani de lapte uman, sunt molecule de zahăr, care fac parte din grupul oligozaharidelor. Exemple proeminente de HMO includ 2'-fucosyllactoză (2′-FL), lacto-N-neotetraoză (LNnT), 3'-galactosillactoză (3′-GL) și difucosyllactoză (DFL).
În timp ce laptele matern uman estecompus de mai mult de diferite 150 structuri HMO, numai 2′-fucosyllactoză (2′-FL) și lacto-N-neotetraoză (LNnT) sunt produse în prezent la nivel comercial și utilizate ca aditivi nutriționali în formula pentru sugari.
Oligozaharidele din laptele uman (HMO) sunt cunoscute pentru semnificația lor în alimentația copilului. Oligozaharidele din laptele uman sunt un tip unic de nutrienți, care acționează ca prebiotice, antimicrobiene antiadezive și imunomodulatoare în intestinul bebelușului și contribuie substanțial la dezvoltarea creierului. HMO se găsesc exclusiv în laptele matern uman; alte tipuri de lapte de mamifere (de exemplu, vacă, capră, oaie, cămilă etc.) nu au aceste forme specifice de oligozaharide.
Oligozaharidele din laptele uman sunt a treia componentă solidă cea mai abundentă din laptele uman, care poate fi prezentă fie sub formă dizolvată, fie emulsificată sau suspendată în apă. Lactoză și acizi grași sunt solide cele mai abundente găsite în laptele uman. HMO sunt prezente într-o concentrație de 0,35–0,88 uncii (9,9–24,9 g)/ L. Aproximativ 200 de oligozaharide de lapte uman diferite din punct de vedere structural sunt cunoscute. Oligozaharida dominantă la 80% din toate femeile este de 2′-fucosillactoză, care este prezentă în laptele matern uman la o concentrație de aproximativ 2,5 g/ L.
Deoarece HMO-urile nu sunt digerate, ele nu contribuie caloric la nutriție. Fiind carbohidrați indigestibili, aceștia funcționează ca prebiotice și sunt fermentați selectiv de microflora intestinală dorită, în special bifidobacteria.
Beneficiile pentru sănătate ale oligozaharidelor din laptele uman (HMO)
- promovarea dezvoltării sugarilor
- sunt importante pentru dezvoltarea creierului
- are antiinflamatoare și
- efecte antiadezive în tractul gastro-intestinal
- sprijină sistemul imunitar la adulți
La Procesor ultrasonic UIP2000hdT crește transferul de masă și activează fabricile de celule pentru randamente mai mari de molecule biologice biosintetizate, ar fi HMO
Biosinteza oligozaharidelor din lapte uman
Fabricile de celule și sistemele enzimatice / chemo-enzimatice sunt tehnologiile actuale utilizate pentru sinteza HMO- urilor. Pentru producția de HMO la scară industrială, fermentarea fabricilor de celule microbiene, sinteza biochimică și diferitele reacții enzimatice sunt modalități fezabile de bioproducție HMO. Din motive economice, biosintetia prin fabricile de celule microbiene este în prezent singura tehnică utilizată la nivelul producției industriale de HMO.
Fermentarea HMO folosind fabrici de celule microbiene
E.coli, Saccharomyces cerevisiae și Lactococcus lactis sunt fabrici de celule utilizate în mod obișnuit pentru bioproducția de molecule biologice, ar fi HMO. Fermentarea este un proces biochimic folosind microorganisme pentru a converti un substrat în molecule biologice vizate. Fabricile de celule microbiene folosesc zaharuri simple ca substrat, pe care le transformă în HMO-uri. Deoarece zaharurile simple (de exemplu, lactoză) sunt un substrat abundent, ieftin, acest lucru păstrează procesul de biosinteza rentabil.
Rata de creștere și bioconversie sunt influențate în principal de transferul în masă al nutrienților (substratului) către microorganisme. Rata de transfer de masă este un factor principal care afectează sinteza produsului în timpul fermentației. Sonicare este bine cunoscut pentru a promova transferul în masă.
During fermentation, the conditions in the bioreactor must be constantly monitored and regulated so that the cells can grow as quickly as possible in order to then produce the targeted biomolecules (e.g. oligosaccharides such as HMOs; insulin; recombinant proteins). Theoretically, the product formation starts as soon as the cell culture begins to grow. However especially in genetically modified cells such as engineered microorganisms it is usually induced later by adding a chemical substance to the substrate, which upregulates the expression of the targeted biomolecule. Ultrasonic bioreactors (sono-bioreactor) can be precisely controlled and allow for the specific stimulation of microbes. This results in an accelerated biosynthesis and higher yields.
Ultrasonic lysis and extraction: Fermentation of complex HMOs might be limited by low fermentation titers and products remaining intracellular. Ultrasonic lysis and extraction is used to release intracellular material before purification and down-stream processes.
Ultrasonically promovat fermentare
The growth rate of microbes such as Escherichia coli, engineered E.coli, Saccharomyces cerevisiae and Lactococcus lactis can be accelerated by increasing the mass transfer rate and cell wall permeability by applying controlled low-frequency ultrasonication. As a mild, non-thermal processing technique, ultrasonication applies purely mechanical forces into the fermentation broth.
Acoustic Cavitation: The working principle of sonication is based on acoustic cavitation. The ultrasonic probe (sonotrode) couples low-frequency ultrasound d waves into the medium. The ultrasound waves travel through the liquid creating alternating high-pressure (compression) / low-pressure (rarefaction) cycles. By compressing and stretching the liquid in alternating cycles, minute vacuum bubbles arise. These small vacuum bubbles grow over several cycles until they reach a size where they cannot absorb any further energy. At this point of maximum growth, the vacuum bubble implodes violently and generates locally extreme conditions, known as the phenomenon of cavitation. In the cavitational “hot-spot”, high pressure and temperature differentials and intense shear forces with liquid jets of up to 280m/sec can be observed. By these cavitational effects, thorough mass transfer and sonoporation (the perforation of cell walls and cell membranes) is achieved. The nutrients of the substrate are floated to and into the living whole cells, so that the cell factories are optimally nourished and growth as well as conversion rates are accelerated. Ultrasonic bioreactors are a simple, yet highly effective strategy to process biomass in a one-pot biosynthesis process.
O sonicare precis controlată, ușoară este bine-cunoscut pentru a intensifica procesele de fermentare.
Sonicare îmbunătățește "productivitatea de multe bioprocese care implică celule vii prin îmbunătățirea absorbția substratului, creșterea îmbunătățită sau de creștere prin creșterea porozitatea celulelor, și eliberarea potențial îmbunătățită a componentelor celulare." (Naveena et al. 2015)
Read more about ultrasonically-assisted fermentation!
Avantajele de fermentare ultrasonically intensificate
- randament crescut
- Fermentare accelerată
- Stimularea specifică celulelor
- Absorbție îmbunătățită a substratului
- Creșterea porozitate a celulelor
- ușor de operat
- sigur
- Simplu Retro-Fitting
- la scară liniară
- Prelucrare a loturilor sau a iniinei
- rapid RoI
Naveena et al. (2015) a constatat că intensificarea cu ultrasunete oferă mai multe avantaje în timpul bioprocesării, inclusiv costuri de operare scăzute în comparație cu alte opțiuni de tratament de îmbunătățire, simplitatea funcționării și cerințele de putere modeste.
Rezervor cu ultrasonicators 8kW și agitator
Reactoare de fermentație cu ultrasunete de înaltă performanță
Procesele de fermentare implică microorganisme vii, ar fi bacteriile sau drojdie, care funcționează ca fabrici de celule. În timp ce sonicare este aplicat pentru a promova transferul în masă și de a crește creșterea microorganismului și rata de conversie, este esențial să se controleze intensitatea ultrasonică tocmai pentru a evita distrugerea fabricilor de celule.
Hielscher Ultrasonics este specialist în proiectarea, fabricarea și distribuirea ultrasonicators de înaltă performanță, care pot fi controlate cu precizie și monitorizate pentru a asigura randamente superioare de fermentare.
Controlul proceselor nu este esențial doar pentru randamente ridicate și calitate superioară, dar permite repetarea și reproducerea rezultatelor. Mai ales atunci când vine vorba de stimularea fabricilor de celule, adaptarea specifică celulelor a parametrilor sonicare este esențială pentru a obține randamente ridicate și pentru a preveni degradarea celulelor. Prin urmare, toate modelele digitale de ultrasonicators Hielscher sunt echipate cu software inteligent, care vă permite să se adapteze, monitoriza, și revizui parametrii sonicare. Parametrii de proces cu ultrasunete, ar fi amplitudinea, temperatura, presiunea, durata sonicare, cicluri de sarcină, și de intrare de energie sunt esențiale pentru a promova producția de HMO prin fermentare.
Software-ul inteligent al ultrasonicators Hielscher înregistrează automat toți parametrii importanți ai procesului de pe cardul SD integrat. Înregistrarea automată a datelor procesului de sonicare reprezintă fundamentul pentru standardizarea proceselor și reproductibilitatea /repetabilitatea, care sunt necesare pentru bunele practici de fabricație (GMP).
cascatrodeTm într-un reactor cu ultrasunete cu celule de flux
Rectori cu ultrasunete pentru fermentare
Hielscher offers ultrasonic probes of various size, length and geometries, which can be used for batch as well as continuous flow-through treatments. Ultrasonic reactors, also known as sono-bioreactors, are available for any volume covering the ultrasonic bioprocessing from small lab samples to pilot and fully-commercial production level.
Este bine cunoscut faptul că localizarea sonotrodei cu ultrasunete în vasul de reacție influențează distribuția cavitației și micro-streaming-ului în mediu. Sonotrode și reactor cu ultrasunete ar trebui să fie alese în conformitate cu volumul de prelucrare a bulionului de celule. În timp ce sonicare poate fi efectuată în lot, precum și în modul continuu, pentru volume mari de producție se recomandă utilizarea unei instalații cu flux continuu. Trecând printr-o celulă de flux cu ultrasunete, toate mediu celular devine exact aceeași expunere la sonicare asigurând tratamentul cel mai eficient. Hielscher Ultrasonics gamă largă de sonde cu ultrasunete și reactoare cu celule de flux permite să asambleze configurarea ideală de bioprocesare cu ultrasunete.
Hielscher Ultrasonics – De la laborator la pilot la producție
Hielscher Ultrasonics acoperă întregul spectru de echipamente cu ultrasunete care oferă omogenizatoare cu ultrasunete de mână compacte pentru pregătirea probei la banc-top și sisteme pilot, precum și unități puternice cu ultrasunete industriale care procesează cu ușurință camioane pe oră. Fiind versatil și flexibil în opțiunile de instalare și montare, ultrasonicators Hielscher pot fi ușor integrate în toate tipurile de reactoare lot, fed-loturi sau continuu flux-prin configurații.
Diverse accesorii, precum și piese personalizate permit adaptarea ideală a configurației cu ultrasunete la cerințele procesului.
Construit pentru funcționare 24/7 în sarcină completă și grele în condiții solicitante, procesoarele cu ultrasunete Hielscher sunt fiabile și necesită doar întreținere scăzută.
Tabelul de mai jos vă oferă o indicație a capacității de procesare aproximativă a ultrasonicators noastre:
| volum lot | Debit | Aparate recomandate |
|---|---|---|
| 1 la 500mL | 10 până la 200 ml / min | UP100H |
| 10 la 2000ml | 20 până la 400ml / min | Uf200 ः t. UP400St |
| 0.1 la 20L | 0.2 4L / min | UIP2000hdT |
| 10 100L | 2 până la 10L / min | UIP4000hdT |
| N / A. | 10 la 100L / min | UIP16000 |
| N / A. | mai mare | grup de UIP16000 |
Contacteaza-ne! / Intreaba-ne!
Omogenizatoare cu ultrasunete de mare putere de la laborator la Pilot și Industrial scară.
Literatură / Referințe
- Muschiol, Jan; Meyer, Anne S. (2019): A chemo-enzymatic approach for the synthesis of human milk oligosaccharide backbone structures. Zeitschrift für Naturforschung C, Volume 74: Issue 3-4, 2019. 85-89.
- Birgitte Zeuner, David Teze, Jan Muschiol, Anne S. Meyer (2019): Synthesis of Human Milk Oligosaccharides: Protein Engineering Strategies for Improved Enzymatic Transglycosylation. Molecules 24, 2019.
- Yun Hee Choi, Bum Seok Park, Joo‐Hyun Seo, Byung‐Gee Ki (2019): Biosynthesis of the human milk oligosaccharide 3‐fucosyllactose in metabolically engineered Escherichia coli via the salvage pathway through increasing GTP synthesis and β‐galactosidase modification. Biotechnology and Bioengineering Volume 116, Issue 12. December 2019.
- Balakrishnan Naveena, Patricia Armshaw, J. Tony Pembroke (2015): Ultrasonic intensification as a tool for enhanced microbial biofuel yields. Biotechnology of Biofuels 8:140, 2015.
- Shweta Pawar, Virendra K. Rathod (2020): Role of ultrasound in assisted fermentation technologies for process enhancements. Preparative Biochemistry & Biotechnology 50(6), 2020. 1-8.
Ce trebuie să știți
Biosynthesis using Cell Factories
A microbial cell factory is a method of bioengineering, which utilizes microbial cells as a production facility. By genetically engineering microbes, the DNA of microorganisms such as bacteria, yeasts, fungi, mammalian cells, or algae is modified turning microbes into cell factories. Cell factories are used to convert substrates into valuable biological molecules, which are used e.g. in food, pharma, chemistry and fuel production. Different strategies of cell factory-based biosynthesis aim at the production of native metabolites, expression of heterologous biosynthetic pathways, or protein expression.
Cell factories can be used to either synthesize native metabolites, to express heterologous biosynthetic pathways, or to express proteins.
Biosynthesis of native metabolites
Native metabolites are defined as biological molecules, which the cells used as cell factory produce naturally. Cell factories produce these biological molecules either intracellularly or a secreted substance. The latter is preferred since it facilitates the separation and purification of the targeted compounds. Examples for native metabolites are amino and nucleic acids, antibiotics, vitamins, enzymes, bioactive compounds, and proteins produced from anabolic pathways of cell.
Heterologus Biosynthetic Pathways
When trying to produce an interesting compound, one of the most important decisions is the choice of production in the native host, and optimize this host, or transfer of the pathway to another well-known host. If the original host can be adapted to an industrial fermentation process, and there are no health-related risks in doing so (e.g., production of toxic by-products), this can be a preferred strategy (as was the case e.g., for penicillin). However, in many modern cases, the potential of using an industrially preferred cell factory and related platform processes out-weighs the difficulty of transferring the pathway.
Protein Expression
The expression of proteins can be achieved via homologous and heterologous ways. In homologous expression, a gene that is naturally present in an organism is over-expressed. Through this over-expression, a higher yield of a certain biological molecule can be produced. For heterologous expression, a specific gene is transferred into a host cell in that the gene is not present naturally. Using cell engineering and recombinant DNA technology, the gene is inserted into the host’s DNA so that the host cell produces (large) amounts of a protein that it would not produce naturally. Protein expression is done in a variety of hosts from bacteria, e.g. E. coli and Bacillis subtilis, yeasts, e.g., Klyuveromyces lactis, Pichia pastoris, S. cerevisiae, filamentous fungi, e.g. as A. niger, and cells derived from multicellular organisms such as mammals and insects. Innummerous proteins are of great commercial interest, including from bulk enzymes, complex bio-pharmaceuticals, diagnostics and research reagents. (cf. A.M. Davy et al. 2017)