Liza cu ultrasunete pentru Western Blotting

• Western blot este o procedură analitică pentru detectarea proteinelor specifice într-o probă de omogenat tisular sau extract de celule.
• Pentru a rula un Western blot sau pentru a măsura activitatea enzimatică, multe teste necesită acces la materialele (de exemplu, proteine, ADN, fragmente subcelulare) prinse în celulă.
• Sonicare este o metodă fiabilă și ușor de manevrat pentru întreruperea controlată a celulelor și liza.

Perturbarea celulelor cu ultrasunete

Extracția proteinelor din țesuturi și celule cultivate este primul pas pentru multe tehnici biologice, biochimice și analitice (PAGE, Western blotting, ELISA, spectrometrie de masă etc.) sau purificarea proteinelor. Pentru a obține un randament ridicat de proteine, materialul celular și țesutul trebuie să fie perturbate / lizate eficient. Indiferent dacă celula vegetală sau țesutul animal, sonicare este metoda de a pregăti lizatul celular ușor și rapid.

Avantajele sonicare

• Repede & Eficient
• Operare ușoară
• randament ridicat de proteine
• reproductibil/ repetabil
• controlat cu precizie
• Scalabile

Protocol de imunoprecipitare pentru Western Immunoblotting

A. Reactivi

Pentru prepararea soluțiilor, utilizați apă purificată, cum ar fi Milli-Q.

• 1X soluție salină tamponată cu fosfat (PBS)
• Tampon de liză celulară 1X: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM pirofosfat de sodiu, 1 mM β-glicerofosfat, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml leupeptină
  Important: Adăugați 1 mM PMSF imediat înainte de utilizare.
• 15 μl proteină A + 15 μl proteină G este suficientă pentru PI, dar poate depinde de anticorpul primar și de volumul probei. De asemenea, puteți utiliza proteine preamestecate A/G agaroză (de exemplu, proteina A pentru tragerea în jos a IgG de iepure și proteina G pentru tragerea în jos a IgG de șoarece)
• Tampon de probă SDS 3X: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 la 25 ° C), 6% g / v SDS, 30% glicerol, 150 mM DTT, 0,03% g / v albastru de bromofol

B. Prepararea lizatelor celulare

• Recoltați celulele. Pentru recoltarea celulelor în condiții de nedenaturare, se îndepărtează mediile și se clătesc celulele o dată cu PBS rece ca gheața.
• Se îndepărtează PBS și se adaugă 0,5 ml tampon de liză celulară 1X rece ca gheața pe fiecare placă (10 cm) și se incubează plăcile pe gheață timp de 5 minute.
• Se răzuiesc celulele de pe plăci și se transferă în tuburile microcentrifugelor. Păstrați pe gheață.
• Sonicate de două ori timp de 10 secunde în tampon de imunoprecipitare rece ca gheața (tampon IP: 50 mM Tris-HCl [pH 7.4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% NP-40 și amestecul inhibitor de protează). Pentru sonicare, VialTweeter sau o sondă ultrasonicator, ar fi UP100H sau UP200Ht sunt cele mai potrivite.
• Se centrifughează lizatele la 15 000 g timp de 10 minute la 4°C.
• Se transferă supernatantul într-un tub nou. (Dacă este necesar, lizatul poate fi păstrat la –80°C.)
• Se adaugă anticorpul primar la supernatant. Supernatantul cu anticorpul primar se incubează timp de 1 oră la 4°C sub agitare ușoară. Anticorpul primar este de obicei adăugat într-o cantitate de 10 ori mai concentrată decât cea utilizată pentru western blotting. (Puteți începe cu 1μg per 100μL.)
• Supernatantul este apoi incubat în continuare cu amestecul de cantități egale de proteină A-agaroză (Invitrogen) și proteină G agaroză timp de încă 1 oră.
• Spălați peletele de agaroză de trei ori cu tampon IP. După aceea, extrageți proteinele legate cu tamponul de încărcare SDS-PAGE încălzind la 95 ° C timp de 5 minute.

C. Imunoprecipitarea

• Se iau 200 μl lizat celular și se adaugă anticorp primar. Se incubează prin balansare ușoară peste noapte, la 4°C.
• Adăugați fie granule de agaroză proteină A, fie G (20 μl de suspensie de mărgele 50%). Se incubează prin balansare ușoară timp de 1-3 ore la 4°C.
• Microcentrifugă timp de 30 de secunde la 4°C. Spălați peletele de cinci ori cu 500 μl de tampon de liză celulară 1X. Păstrați pe gheață în timpul spălărilor.
• Omogenizați granulele cu 20 μl soluție tampon SDS 3X. Vortex, apoi microcentrifugă timp de 30 de secunde.
• Se încălzește proba la 95-100 °C timp de 2-5 minute și se microcentrifughează timp de 1 minut la 14.000 X g.
• Se încarcă proba (15-30 μl) pe gel SDS-PAGE (12-15%).
• Analizați eșantionul prin Western blotting.

Analiza Western Blot cu Sonicator UP50H

Urmând protocolul folosind sonicatorul de tip sondă UP50H a fost utilizat în studiul lui Kriebisch et al. (2011):
Proteina totală a fost izolată din celulele MC3T3-E1 tratate cu 1,25(OH)₂D₃ (10⁻⁸ M) sau vehicul. Celulele au fost lizate cu un tampon care conține 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher științific); 0,1% dodecil sulfat de sodiu (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) și 0,5% deoxicolat de sodiu (Merck). Lizatul celular a fost sonicat pentru 2 × 10 s la ciclul 1 și amplitudinea 80 cu UP50H Procesor cu ultrasunete (Hielscher, Tehnologia cu ultrasunete, Teltow, Germania). Ulterior, materialul a fost centrifugat timp de 10 minute la 14.000 rpm, iar supernatantul a fost folosit pentru Western blotting. Douăzeci și cinci μg de proteine au fost fierte în tampon de probă și agent reducător (Invitrogen) și ulterior separate de SDS-PAGE folosind geluri de poliacrilamidă 4-12% (Invitrogen) și transferate într-o membrană nitroceluloză (GE health care). Membrana a fost blocată timp de 1 oră cu TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl) conținând 1% cazeină (Sigma-Aldrich) și 1% Tris (1 M). După blocare, membrana a fost incubată cu ușoară agitare peste noapte la 4°C cu anticorpul primar (CBS 1/500 antiuman de iepure, dezvoltat în laboratorul Prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, SUA). Incubarea cu un anticorp secundar conjugat cu peroxidază de hrean (HPR) (Dako) a fost efectuată timp de 1 oră la temperatura camerei. Toate petele au fost dezvoltate prin chemoluminescență îmbunătățită (Perkin Elmer).
 

Click aici pentru a citi mai multe despre cele mai bune practici pentru liza celulelor cu ultrasunete și extracție, pregătirea lizatului și recomandări pentru îmbunătățirea procesului!
 
Tabelul de mai jos vă oferă o indicație a capacității aproximative de procesare a ultrasonicators noastre de dimensiuni de laborator:

Literatură / Referințe