Hielscher ultrasunete tehnologie

Cu ultrasunete liză pentru Western blotting

  • Western blot este o procedură analitică pentru detectarea proteinelor specifice într-o probă de țesut sau omogenat extract celular.
  • Pentru a executa o analiză Western blot sau pentru a măsura activitatea enzimei, multe analize necesită acces la materialele (de exemplu proteine, ADN, fragmente subcelulare) prinse în celulă.
  • Sonicare este o metodă sigură și ușor de manevrat pentru sfărâmării celulelor controlate și liza.

Cu ultrasunete Cell Disruption

extracția proteinei din țesuturi și celule de cultură este primul pas pentru multe tehnici biologice, biochimice și analitice (PAGE, Western blotting, ELISA, spectrometrie de masă, etc.) sau de purificare a proteinelor. Pentru a obține un randament ridicat de proteine, materialul celular si tesutul trebuie sa fie perturbat eficient / lizată. Fie că celula de plantă sau țesut animal, sonicare este metoda de a pregăti ușor lizat mobil și rapid.

Avantajele ultrasunetelor

  • Rapid & eficient
  • operație ușoară
  • randament ridicat de proteine
  • reproductibil / repetabile
  • precis controlate
  • scalabil

Protocolul Imunoprecipitarea Pentru imunoblottingul Western

A. Reactivi

Pentru prepararea soluțiilor, folosiți apă purificată, cum ar fi Milli-Q.

  • 1X fosfat salin (PBS)
  • 1X Cell Lysis Buffer: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCI, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 pirofosfatul mM de sodiu, 1 mM β-glicerofosfat, 1 mM Na3VO4, 1 pg / ml leupeptină
    Important: Adăugați mM PMSF 1 imediat înainte de utilizare.
  • 15 pl proteină A + 15 pl de proteină G este suficientă pentru IP, dar poate depinde de volumul de anticorpi și de probă primară. Puteți utiliza, de asemenea, pre-amestecat proteina A / G agaroză (de exemplu proteină A pentru IgG de iepure trage în jos și proteine ​​G pentru IgG de șoarece trage în jos)
  • 3X SDS tampon de probă: 187,5 mM Tris-HCI (pH 6,8 la 25 ° C), 6% g ​​/ v SDS, 30% glicerol, 150 mM DTT, 0,03% g / v albastru bromofenol
Hielscher's VialTweeter is is´deal for the lysis of multiple samples

VialTweeter pentru prep proba cu ultrasunete

Contacteaza-ne! / Intreaba-ne!





Vă rugăm să rețineți Politica de confidentialitate.


Sonicarea este un pas important în timpul preparării probei

UP200St cu micro-sfat pentru sonicare eșantion

B. Prepararea Cell Lizatele

  • Recolta celulele. Pentru a recolta celule în condiții nedenaturat, eliminați media și clătiți celulele o dată cu PBS rece ca gheața.
  • Eliminare PBS și se adaugă 1X tampon de liză celulară 0,5 ml gheață-rece pentru fiecare placă (10 cm) și se incubează plăcile pe gheață timp de 5 minute.
  • Scrape celulele de pe plăci și se transferă în tuburi de microcentrifugare. Păstrați pe gheață.
  • Sonichează timp de două ori timp de 10 secunde în tampon immunoprecipitation rece ca gheața (tampon IP: 50 mM Tris-HCI [pH 7,4], 150 mM NaCI, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 și combinația de inhibitor de protează). Pentru sonicare, VialTweeter sau o ultrasonicator sondă, cum ar fi UP100H sau Uf200 ः t sunt cele mai potrivite.
  • Se centrifughează lizatele la 15000 g timp de 10 minute la 4 ° C.
  • Se transferă supernatantul într-un tub nou. (Dacă este necesar, lizat poate fi depozitat la -80 ° C.)
  • Adăugați anticorpul primar la supernatant. Supernatantul cu anticorpul primar este incubat timp de 1 oră la temperatura de 4 ° C sub agitare ușoară. Anticorpul primar este în mod tipic adăugat într-o cantitate de 10 ori mai concentrată decât este utilizat pentru Western blotting. (Puteți începe cu 1 pg per 100 pl.)
  • Supernatantul este apoi incubat suplimentar cu amestecul de cantități egale de proteină A-agaroză (Invitrogen) și Proteina G agaroză pentru încă 1 oră.
  • Se spală granulele de agaroză de trei ori cu tampon IP. După aceea, se extrage proteinele legate cu tampon de încărcare SDS-PAGE prin încălzire la 95 ° C timp de 5 minute.

C. Imunoprecipitarea

  • Ia 200 pl lizat de celule și se adaugă anticorpul primar. Se incubează cu agitare ușoară peste noapte la 4 ° C.
  • Se adaugă fie proteină A sau perle de agaroză G (20 pl de 50% suspensie microsfere). Incubeaza cu agitare blândă timp de 1-3 ore la temperatura de 4 ° C.
  • Microcentrifugă timp de 30 secunde la 4 ° C. Se spală granula de cinci ori cu 500 pl de tampon de liză celulară 1X. Păstrați pe gheață în timpul spălărilor.
  • Resuspenda peleta cu 20 pl tampon mostră SDS 3X. Vortex, apoi microcentrifugă timp de 30 de secunde.
  • Proba se încălzește la 95-100 ° C timp de 2-5 minute și microcentrifugă timp de 1 minut la 14.000 X g.
  • Se încarcă proba (15-30 pl) pe gel SDS-PAGE (12-15%).
  • Analizeaza eșantion prin Western blotting.

Contactati-ne / cere mai multe informații

Vorbeste cu noi despre cerințele dumneavoastră de prelucrare. Vă vom recomanda cele mai potrivite de instalare și de prelucrare a parametrilor pentru proiectul dumneavoastră.





Vă rugăm să rețineți Politica de confidentialitate.


Mai multe protocoale sonicare

Analiza Western Blot cu UP50H ultrasonicator

Urmând protocolul a fost utilizat în studiul Kriebisch et al. (2011):
Proteina totală a fost izolată din celule MC3T3-E1 tratate cu 1,25 (OH)2D3 (10 de ani-8 M) sau vehicul. Celulele au fost lizate cu un tampon conținând 50 mM Tris HCI, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1% dodecil sulfat de sodiu (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) și 0,5% deoxicolat de sodiu (Merck). Lizatul celular a fost sonicată timp de 2 x 10 s, la ciclul 1 și amplitudine 80 cu Procesor UP50H cu ultrasunete (Hielscher, Ultrasound Technology, Teltow, Germania). Ulterior, materialul a fost centrifugat timp de 10 minute la 14000 rpm și supernatantul a fost utilizat pentru Western blotting. Douăzeci și cinci μg de proteină au fost fierte în tampon de probă și agent de reducere (Invitrogen) și ulterior au fost separate prin SDS-PAGE utilizând geluri de poliacrilamidă 4-12% (Invitrogen) și transferate pe o membrană de nitroceluloză (îngrijirea sănătății GE). Membrana a fost blocată timp de 1 oră cu TBS (10 mM Tris-HCI, pH 7,6, 150 mM NaCI) conținând 1% cazeină (Sigma-Aldrich) și 1% Tris (1 M). După blocare, membrana a fost incubată cu ușoară agitare peste noapte la 4 ° C cu anticorpul primar (CBS 1/500 de iepure anti-uman, dezvoltat în laboratorul Prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, SUA). Incubarea cu un anticorp secundar conjugat cu peroxidază de hrean (HPR) (Dako) a fost efectuată timp de 1 oră la temperatura camerei. Toate bloturile au fost dezvoltate prin chemiluminiscență îmbunătățită (Perkin Elmer).

Literatura / Referințe



Despre Western blotting

Bloturile sunt proceduri analitice în care ADN-ul, ARN-ul și proteinele sunt transferate pe un purtător, astfel încât acestea să poată separa.
Southern blot este utilizat pentru detectarea ADN-ului, Northern blot pentru ARN și Western blot pentru proteine.
Western blotting este numită și immunoblotting proteină deoarece un anticorp este utilizat pentru a detecta în mod specific antigenul său. Analiza Western blot este una dintre cele mai importante metode de analiză pentru detectarea proteinelor specifice în eșantion. In Western blot, proteinele sunt imobilizate pe membrane pentru a le detecta folosind anticorpi monoclonali sau policlonali.
Prin electroforeză pe gel SDS-poliacrilamidă (SDS-PAGE) proteinele native sunt separate prin structura 3-D sau proteine ​​denaturate prin lungimea polipeptidei. Proteinele sunt apoi transferate într-o membrană (în mod obișnuit nitroceluloză sau PVDF), unde sunt colorate cu anticorpi specifici proteinei țintă. Etapa de electroforeză în gel este inclusă în analiza Western blot pentru a rezolva problema reactivității încrucișate a anticorpilor.
Ulterior, proteinele separate sunt blotate pe o matrice (mai ales pe o membrană de nitroceluloză sau PVDF), unde sunt colorate cu anticorpi. Anticorpii funcționează ca o probă și sunt selectați în mod specific pentru proteina țintă. Analiza localizării și a intensității reacției specifice dezvăluie detaliile de exprimare a proteinelor țintă din proba dată. Western blotting-ul ar putea detecta o proteină țintă care este la fel de mică ca 1 ng datorită rezoluției mari a electroforezei în gel și a specificității puternice și sensibilității ridicate a testului imunologic. Metoda Western blot este utilizată în biologia moleculară, biochimie, imunogenetică și alte domenii de cercetare moleculară.
Alte tehnici înrudite includ analiza dot blot, imunohistochimie și imunocitochimie unde anticorpii sunt utilizate pentru a detecta proteinele din țesuturi și celule de immunostaining și testul de imunosorbție legată de enzimă (ELISA).