Liza cu ultrasunete pentru Western blotting

• Western blot este o procedură analitică pentru detectarea unor proteine specifice într-o probă de omogenat tisular sau de extract celular.
• Pentru a efectua un Western blot sau pentru a măsura activitatea enzimatică, multe teste necesită accesul la materialele (de ex. proteine, ADN, fragmente subcelulare) închise în celulă.
• Sonicarea este o metodă fiabilă și ușor de utilizat pentru dezintegrarea controlată a celulelor și liză.

Dezintegrarea celulelor cu ultrasunete

Extracția proteinelor din țesuturi și din celule cultivate este primul pas pentru multe tehnici biologice, biochimice și analitice (PAGE, Western blotting, ELISA, spectrometrie de masă etc.) sau pentru purificarea proteinelor. Pentru a obține un randament ridicat de proteine, materialul celular și țesutul trebuie dezintegrate/ lizate eficient. Fie că este vorba de celule vegetale sau de țesut animal, sonicarea este metoda prin care vă puteți prepara lizatul celular ușor și rapid.

Avantajele sonicării

• rapidă și eficientă
• operare ușoară
• randament ridicat de proteine
• reproductibilă/ repetabilă
• controlată cu precizie
• scalabilă

Protocol de imunoprecipitare pentru imunoblotting Western

A. Reactivi

Pentru prepararea soluțiilor, utilizați apă purificată, cum ar fi Milli-Q.

• Soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) 1X
• Tampon de liză celulară 1X: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM pirofosfat de sodiu, 1 mM β-glicerofosfat, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml leupeptină
  Important: Adăugați 1 mM PMSF imediat înainte de utilizare.
• 15 μl proteină A+15 μl proteină G sunt suficiente pentru IP, dar acest lucru poate depinde de anticorpul primar și de volumul probei. Puteți utiliza și agaroză cu proteină A/ G preamestecată (de ex. proteina A pentru pull-down de IgG de iepure și proteina G pentru pull-down de IgG de șoarece)
• Tampon de probă SDS 3X: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 la 25°C), 6% w/v SDS, 30% glicerol, 150 mM DTT, 0,03% w/v albastru de bromofenol

B. Prepararea lizatelor celulare

• Recoltați celulele. Pentru a recolta celulele în condiții nedenaturante, îndepărtați mediul și clătiți celulele o dată cu PBS rece ca gheața.
• Îndepărtați PBS-ul și adăugați 0,5 ml de tampon de liză celulară 1X rece ca gheața în fiecare placă (10 cm), apoi incubați plăcile pe gheață timp de 5 minute.
• Răzuiți celulele de pe plăci și transferați-le în tuburi de microcentrifugă. Păstrați pe gheață.
• Sonicați de două ori câte 10 secunde în tampon de imunoprecipitare rece ca gheața (tampon IP: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 și amestecul de inhibitori de protează). Pentru sonicare, VialTweeter sau un ultrasonicator cu sondă, precum UP100H sau UP200Ht, sunt cele mai potrivite.
• Centrifugați lizatele la 15.000 g timp de 10 minute la 4°C.
• Transferați supernatantul într-un tub nou. (Dacă este necesar, lizatul poate fi depozitat la –80°C.)
• Adăugați anticorpul primar în supernatant. Supernatantul cu anticorpul primar se incubează timp de 1 h la 4°C, sub agitare ușoară. Anticorpul primar se adaugă de obicei într-o cantitate de 10x mai concentrată decât cea utilizată pentru Western blotting. (Puteți începe cu 1μg per 100μL.)
• Supernatantul se incubează apoi în continuare cu amestecul de cantități egale de agaroză cu proteină A (Invitrogen) și agaroză cu proteină G timp de încă 1 h.
• Spălați peletele de agaroză de trei ori cu tampon IP. Apoi extrageți proteinele legate cu tamponul de încărcare SDS-PAGE prin încălzire la 95°C timp de 5 minute.

C. Imunoprecipitare

• Luați 200 μl de lizat celular și adăugați anticorpul primar. Incubați peste noapte la 4°C, sub balansare ușoară.
• Adăugați bile de agaroză cu proteină A sau G (20 μl de suspensie de bile 50%). Incubați sub balansare ușoară timp de 1–3 ore la 4°C.
• Microcentrifugați timp de 30 de secunde la 4°C. Spălați peleta de cinci ori cu 500 µl de tampon de liză celulară 1X. Păstrați pe gheață în timpul spălărilor.
• Resuspendați peleta în 20 μl de tampon de probă SDS 3X. Vortexați, apoi microcentrifugați timp de 30 de secunde.
• Încălziți proba la 95–100°C timp de 2–5 minute și microcentrifugați timp de 1 minut la 14.000 X g.
• Încărcați proba (15–30 μl) pe gel SDS-PAGE (12–15%).
• Analizați proba prin Western blotting.

Analiza Western blot cu sonicatorul UP50H

Următorul protocol cu sonicatorul cu sondă UP50H a fost utilizat în studiul lui Kriebisch et al. (2011):
Proteina totală a fost izolată din celule MC3T3-E1 tratate cu 1,25(OH)₂D₃ (10⁻⁸ M) sau cu vehicul. Celulele au fost lizate cu un tampon care conținea 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1% dodecil sulfat de sodiu (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) și 0,5% deoxicolat de sodiu (Merck). Lizatul celular a fost sonicat timp de 2 × 10 s la ciclul 1 și amplitudinea 80 cu procesorul ultrasonic UP50H (Hielscher, Ultrasound Technology, Teltow, Germania). Ulterior, materialul a fost centrifugat timp de 10 min la 14.000 rpm, iar supernatantul a fost utilizat pentru Western blotting. Douăzeci și cinci de μg de proteină au fost fierte în tampon de probă și agent reducător (Invitrogen), apoi separate prin SDS-PAGE folosind geluri de poliacrilamidă 4–12% (Invitrogen) și transferate pe o membrană de nitroceluloză (GE health care). Membrana a fost blocată timp de 1 h cu TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl) care conținea 1% cazeină (Sigma-Aldrich) și 1% Tris (1 M). După blocare, membrana a fost incubată peste noapte la 4°C, sub agitare ușoară, cu anticorpul primar (anti-CBS uman de iepure 1/500, dezvoltat în laboratorul Prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, SUA). Incubarea cu un anticorp secundar conjugat cu peroxidază de hrean (HPR) (Dako) a fost efectuată timp de 1 h la temperatura camerei. Toate bloturile au fost developate prin chemiluminescență amplificată (Perkin Elmer).

Faceți clic aici pentru a citi mai multe despre cele mai bune practici pentru liza și extracția celulară cu ultrasunete, prepararea lizatului și recomandări pentru îmbunătățirea proceselor!

Tabelul de mai jos vă oferă o indicație privind capacitatea aproximativă de procesare a ultrasonicatoarelor noastre de laborator:

Literatură / Referințe

• Koch RJ, Barrette AM, Stern AD, et al. Validating Antibodies for Quantitative Western Blot Measurements with Microwestern Array. Sci Rep. 2018;8(1):11329. Published 2018 Jul 27. doi:10.1038/s41598-018-29436-0
• Carsten Kriebitzsch, Lieve Verlinden, Guy Eelen, Natasja M. van Schoor, Karin Swart, Paul Lips, Mark B. Meyer, J Wesley Pike, Steven Boonen, Carsten Carlberg, Victor Vitvitsky, Roger Bouillon, Ruma Banerjee, and Annemieke Verstuyf (2011): 1,25-dihydroxyvitamin D3 influences cellular homocysteine levels in murine pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells by direct regulation of cystathionine β-synthase. J Bone Miner Res. 26(12), 2011. 2991–3000.
• Tahrin Mahmood, Ping-Chang Yang (2012): Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4(9), 2012. 429-434.