Fermentação assistida por ultrassons para a produção de bioetanol

A fermentação assistida por ultrassons pode melhorar a produção de bioetanol ao promover a decomposição de hidratos de carbono complexos em açúcares mais simples, tornando-os mais facilmente disponíveis para as leveduras os converterem em etanol. Simultaneamente, a sonicação também melhora a eficiência da permeabilidade da parede celular das leveduras, permitindo uma libertação mais rápida do etanol e um aumento da produção global. Assim, a fermentação de bioetanol assistida por ultrassons resulta em taxas de conversão mais elevadas e melhores rendimentos.

Fermentação

A fermentação pode ser um processo aeróbio (= fermentação oxidativa) ou anaeróbio, utilizado em aplicações biotecnológicas para converter matéria orgânica através de culturas de células bacterianas, fúngicas ou de outras células biológicas, ou através de enzimas. A fermentação extrai energia da oxidação de compostos orgânicos, por exemplo, hidratos de carbono.
O açúcar é o substrato mais comum da fermentação, dando origem, após a fermentação, a produtos como ácido láctico, lactose, etanol e hidrogénio. Na fermentação alcoólica, o etanol – especialmente para utilização como combustível, mas também em bebidas alcoólicas – é produzido por fermentação. Quando determinadas estirpes de leveduras, como Saccharomyces cerevisiae metabolizam o açúcar, as células de levedura convertem a matéria-prima em etanol e dióxido de carbono.

As equações químicas abaixo resumem a conversão:

Se a matéria-prima for amido, por exemplo, proveniente do milho, primeiro é necessário converter o amido em açúcar. Para o bioetanol utilizado como combustível, é necessária a hidrólise para converter o amido. Normalmente, a hidrólise é acelerada por tratamento ácido ou enzimático, ou pela combinação de ambos. Em geral, a fermentação é realizada a cerca de 35–40 °C.
Panorâmica de vários processos de fermentação:

Alimentos:

• produção & conservação
• laticínios (fermentação láctica), por exemplo, iogurte, leitelho, kefir
• vegetais fermentados por fermentação láctica, por exemplo, kimchi, miso, natto, tsukemono, chucrute
• desenvolvimento de compostos aromáticos, por exemplo, molho de soja
• decomposição de agentes tanantes, por exemplo, chá, cacau, café, tabaco
• bebidas alcoólicas, por exemplo, cerveja, vinho, uísque

Medicamentos:

• produção de compostos medicinais, por exemplo, insulina, ácido hialurónico

Biogás/ Etanol:

• melhoria da produção de biogás/ bioetanol

Vários trabalhos de investigação e ensaios à escala de bancada e piloto demonstraram que os ultrassons melhoram o processo de fermentação ao disponibilizarem mais biomassa para a fermentação enzimática. Na secção seguinte, os efeitos dos ultrassons num líquido serão explicados em pormenor.

Efeitos do processamento ultrassónico de líquidos

Os ultrassons de alta potência/ baixa frequência permitem gerar amplitudes elevadas. Assim, os ultrassons de alta potência/ baixa frequência podem ser utilizados no processamento de líquidos, nomeadamente na mistura, emulsificação, dispersão e desaglomeração, ou na moagem.
Ao sonicar líquidos a intensidades elevadas, as ondas sonoras que se propagam nos meios líquidos originam ciclos alternados de alta pressão (compressão) e baixa pressão (rarefação), cuja cadência depende da frequência. Durante o ciclo de baixa pressão, as ondas ultrassónicas de alta intensidade criam pequenas bolhas de vácuo ou cavidades no líquido. Quando as bolhas atingem um volume em que já não conseguem absorver energia, colapsam violentamente durante um ciclo de alta pressão. Este fenómeno denomina-se cavitação. Cavitação, ou seja, “a formação, o crescimento e o colapso implosivo de bolhas num líquido. O colapso cavitacional produz um aquecimento local intenso (~5000 K), pressões elevadas (~1000 atm) e taxas de aquecimento e arrefecimento enormes (>109 K/sec)” e jatos de líquido (~400 km/h)”. (Suslick 1998)

Existem diferentes meios de criar cavitação, como bocais de alta pressão, misturadores de rotor-estator ou processadores ultrassónicos. Em todos estes sistemas, a energia fornecida é transformada em atrito, turbulência, ondas e cavitação. A fração da energia fornecida que é transformada em cavitação depende de vários fatores que descrevem o movimento do equipamento gerador de cavitação no líquido. A intensidade da aceleração é um dos fatores mais importantes que influenciam a transformação eficiente de energia em cavitação. Uma aceleração mais elevada cria diferenças de pressão maiores. Isto, por sua vez, aumenta a probabilidade de criação de bolhas de vácuo em vez de ondas que se propagam através do líquido. Assim, quanto maior for a aceleração, maior será a fração de energia transformada em cavitação.
No caso de um transdutor ultrassónico, a amplitude de oscilação descreve a intensidade da aceleração. Amplitudes mais elevadas resultam numa criação de cavitação mais eficaz. Além da intensidade, o líquido deve ser acelerado de forma a criar perdas mínimas em termos de turbulência, atrito e geração de ondas. Para isso, a forma ideal é um movimento numa única direção. Ao alterar a intensidade e os parâmetros do processo de sonicação, os ultrassons podem ser muito intensos ou muito suaves. Isto torna os ultrassons uma ferramenta muito versátil para várias aplicações.

As aplicações suaves, que utilizam sonicação suave em condições moderadas, incluem desgaseificação, emulsificação e ativação de enzimas. As aplicações intensivas com ultrassons de alta intensidade/ alta potência (sobretudo a pressão elevada) são moagem por via húmida, desaglomeração e redução do tamanho das partículas, e dispersão. Para muitas aplicações, como extração, desintegração ou sonoquímica, a intensidade ultrassónica necessária depende do material específico a sonicar. Graças à variedade de parâmetros, que podem ser adaptados a cada processo, os ultrassons permitem encontrar o ponto ideal para cada processo individual.
Além de uma excelente conversão de potência, a sonicação oferece a grande vantagem de um controlo total dos parâmetros mais importantes: Amplitude, Pressão, Temperatura, Viscosidade e Concentração. Isto permite ajustar todos estes parâmetros com o objetivo de encontrar os parâmetros de processamento ideais para cada material específico. Daqui resultam uma maior eficácia e uma eficiência otimizada.

Ultrassons para melhorar os processos de fermentação, explicados através do exemplo da produção de bioetanol

O bioetanol é um produto da decomposição de biomassa ou de matéria biodegradável de resíduos por bactérias anaeróbias ou aeróbias. O etanol produzido é utilizado principalmente como biocombustível. Isto torna o bioetanol uma alternativa renovável e amiga do ambiente aos combustíveis fósseis, como o gás natural.
Para produzir etanol a partir de biomassa, podem utilizar-se açúcar, amido e material lignocelulósico como matérias-primas. À escala de produção industrial, o açúcar e o amido são atualmente predominantes, por serem economicamente favoráveis.
A forma como os ultrassons melhoram um processo específico de um cliente, com uma matéria-prima específica em determinadas condições, pode ser testada de forma muito simples através de ensaios de viabilidade. Numa primeira etapa, a sonicação de uma pequena quantidade da suspensão de matéria-prima com um dispositivo ultrassónico de laboratório mostrará se os ultrassons têm efetivamente algum efeito sobre a matéria-prima.

Ensaios de viabilidade

Na primeira fase de ensaios, é adequado introduzir uma quantidade relativamente elevada de energia ultrassónica num pequeno volume de líquido, pois assim aumenta a possibilidade de verificar se é possível obter algum resultado. Um pequeno volume de amostra também reduz o tempo de utilização de um dispositivo de laboratório e diminui os custos dos primeiros ensaios.
As ondas ultrassónicas são transmitidas para o líquido através da superfície do sonotrodo. Abaixo da superfície do sonotrodo, a intensidade dos ultrassons é máxima. Por isso, são preferíveis distâncias curtas entre o sonotrodo e o material sonicado. Quando se expõe um pequeno volume de líquido, a distância ao sonotrodo pode manter-se curta.
A tabela abaixo apresenta níveis típicos de energia/volume para processos de sonicação após a otimização. Como os primeiros ensaios não serão realizados com a configuração ideal, uma intensidade e um tempo de sonicação de 10 a 50 vezes o valor típico mostrarão se existe ou não algum efeito sobre o material sonicado.

Processo	Energia/ Volume	Volume da amostra	Potência	Tempo
Simples	< 100Ws/mL	10mL	50W	< 20 sec
Médio	100Ws/mL a 500Ws/mL	10mL	50W	20 a 100 sec
Intensivo	> 500Ws/mL	10mL	50W	>100 sec

Tabela 1 – Valores típicos de sonicação após a otimização do processo

A potência efetivamente fornecida nos ensaios pode ser registada através do registo de dados integrado (UP200Ht e UP200St), de uma interface para PC ou de um medidor de potência. Em combinação com os dados registados da definição de amplitude e da temperatura, os resultados de cada ensaio podem ser avaliados e pode estabelecer-se um valor de referência para a energia/volume.
Se tiver sido escolhida uma configuração ideal durante os ensaios, o desempenho dessa configuração poderá ser verificado numa etapa de otimização e, por fim, poderá aumentar-se a escala até ao nível comercial. Para facilitar a otimização, recomenda-se vivamente examinar também os limites da sonicação, por exemplo, a temperatura, a amplitude ou a energia/volume para formulações específicas. Como os ultrassons poderão gerar efeitos negativos em células, produtos químicos ou partículas, é necessário examinar os níveis críticos de cada parâmetro para limitar a otimização subsequente ao intervalo de parâmetros em que não se observam efeitos negativos. Para o estudo de viabilidade, recomendam-se pequenas unidades de laboratório ou de bancada para limitar as despesas com equipamento e amostras nestes ensaios. Em geral, as unidades de 100 a 1 000 Watts servem muito bem os objetivos do estudo de viabilidade. (cf. Hielscher 2005)

Otimização

Os resultados obtidos durante os estudos de viabilidade podem revelar um consumo de energia bastante elevado em relação ao pequeno volume tratado. Porém, o objetivo do ensaio de viabilidade é sobretudo demonstrar os efeitos dos ultrassons sobre o material. Se tiverem ocorrido efeitos positivos nos ensaios de viabilidade, é necessário desenvolver esforços adicionais para otimizar a relação energia/volume. Isto significa explorar a configuração ideal dos parâmetros ultrassónicos para alcançar o rendimento mais elevado utilizando o mínimo de energia possível, de modo a tornar o processo o mais economicamente razoável e eficiente possível. Para encontrar a configuração ideal dos parâmetros – obtendo os benefícios pretendidos com um fornecimento mínimo de energia – é necessário investigar a correlação entre os parâmetros mais importantes: amplitude, pressão, temperatura e composição do líquido . Nesta segunda etapa, recomenda-se a passagem da sonicação em lote para uma configuração de sonicação contínua com reator de célula de fluxo, pois o importante parâmetro da pressão não pode ser alterado na sonicação em lote. Durante a sonicação em lote, a pressão está limitada à pressão ambiente. Se o processo de sonicação decorrer numa câmara de célula de fluxo pressurizável, a pressão pode ser aumentada (ou reduzida), o que, em geral, afeta drasticamente a cavitação ultrassónica. Utilizando uma célula de fluxo, é possível determinar a correlação entre a pressão e a eficiência do processo. Os processadores ultrassónicos com potências entre 500 watts e 2000 watts são os mais adequados para otimizar um processo.

Aumento de escala para a produção comercial

Se tiver sido encontrada a configuração ideal, o aumento de escala subsequente é simples, uma vez que os processos ultrassónicos são totalmente reprodutíveis numa escala linear. Isto significa que, quando se aplicam ultrassons a uma formulação líquida idêntica com uma configuração idêntica dos parâmetros de processamento, é necessária a mesma energia por volume para obter um resultado idêntico, independentemente da escala de processamento. (Hielscher 2005). Isto permite implementar a configuração ideal dos parâmetros ultrassónicos à escala total de produção. O volume que pode ser processado por ultrassons é praticamente ilimitado. Estão disponíveis sistemas ultrassónicos comerciais com até 16 000 watts por unidade, que podem ser instalados em grupos. Estes grupos de processadores ultrassónicos podem ser instalados em paralelo ou em série. A instalação em grupos de processadores ultrassónicos de alta potência permite uma potência total quase ilimitada, de modo a processar fluxos de grande volume sem problemas. Mesmo quando é necessária uma adaptação do sistema ultrassónico, por exemplo, para ajustar os parâmetros a uma formulação líquida modificada, na maioria dos casos isso pode ser feito substituindo o sonotrodo, o amplificador de amplitude ou a célula de fluxo. A escalabilidade linear, a reprodutibilidade e a adaptabilidade dos ultrassons tornam esta tecnologia inovadora eficiente e economicamente vantajosa.

Parâmetros do processamento ultrassónico

O processamento ultrassónico de líquidos é descrito por vários parâmetros. Os mais importantes são a amplitude, a pressão, a temperatura, a viscosidade e a concentração. O resultado do processo, como o tamanho das partículas, para uma determinada configuração dos parâmetros, é uma função da energia por volume processado. A função muda com as alterações dos parâmetros individuais. Além disso, a potência efetivamente produzida por unidade de área da superfície do sonotrodo de uma unidade ultrassónica depende dos parâmetros. A potência produzida por unidade de área da superfície do sonotrodo é a intensidade superficial (I). A intensidade superficial depende da amplitude (A), da pressão (p), do volume do reator (VR), da temperatura (T), da viscosidade (η) e de outros parâmetros.

O impacto da cavitação gerada depende da intensidade superficial. O resultado do processo apresenta a mesma correlação. A potência total produzida por uma unidade ultrassónica é o produto da intensidade superficial (I) pela área da superfície (S):

P [W] I [W / mm²]* S[mm²]

Amplitude

A amplitude de oscilação descreve a distância (por exemplo, 50 µm) que a superfície do sonotrodo percorre num determinado tempo (por exemplo, 1/20 000s a 20kHz). Quanto maior for a amplitude, maior será a rapidez com que a pressão diminui e aumenta em cada movimento. Além disso, o volume deslocado em cada movimento aumenta, resultando num maior volume de cavitação (tamanho e/ou número de bolhas). Quando aplicadas a dispersões, amplitudes mais elevadas apresentam um maior efeito destrutivo sobre as partículas sólidas. A Tabela 1 apresenta valores gerais para alguns processos ultrassónicos.

Pressão

O ponto de ebulição de um líquido depende da pressão. Quanto maior for a pressão, maior será o ponto de ebulição, e vice-versa. A pressão elevada permite a cavitação a temperaturas próximas ou superiores ao ponto de ebulição. Também aumenta a intensidade da implosão, que está relacionada com a diferença entre a pressão estática e a pressão de vapor no interior da bolha (cf. Vercet et al. 1999). Como a potência e a intensidade ultrassónicas mudam rapidamente com as alterações da pressão, é preferível uma bomba de pressão constante. Ao fornecer líquido a uma célula de fluxo, a bomba deve ser capaz de assegurar o caudal específico do líquido a pressões adequadas. As bombas de diafragma ou de membrana; as bombas de tubo flexível, de mangueira ou de compressão; as bombas peristálticas; ou as bombas de pistão ou de êmbolo criarão flutuações alternadas de pressão. São preferíveis as bombas centrífugas, as bombas de engrenagens, as bombas espirais e as bombas de cavidade progressiva que fornecem o líquido a sonicar a uma pressão continuamente estável. (Hielscher 2005)

Temperatura

Ao sonicar um líquido, transmite-se potência para o meio. Como a oscilação gerada por ultrassons provoca turbulência e atrito, o líquido sonicado – de acordo com a lei da termodinâmica – aquecerá. As temperaturas elevadas do meio processado podem ser destrutivas para o material e diminuir a eficácia da cavitação ultrassónica. As células de fluxo ultrassónicas inovadoras estão equipadas com uma camisa de arrefecimento (ver figura). Isto permite um controlo exato da temperatura do material durante o processamento ultrassónico. Para a sonicação de volumes menores em copo de laboratório, recomenda-se um banho de gelo para dissipar o calor.

Viscosidade e concentração

Os processos ultrassónicos de moagem e dispersão são processos em meio líquido. As partículas têm de estar numa suspensão, por exemplo, em água, óleo, solventes ou resinas. A utilização de sistemas ultrassónicos de fluxo contínuo permite sonicar material pastoso e muito viscoso.
Um processador ultrassónico de alta potência pode funcionar com concentrações de sólidos bastante elevadas. Uma concentração elevada proporciona eficácia ao processamento ultrassónico, uma vez que o efeito de moagem ultrassónica é causado pela colisão entre partículas. As investigações demonstraram que a taxa de fragmentação da sílica é independente da concentração de sólidos até 50% em peso. O processamento de misturas-mãe com uma proporção de material altamente concentrada é um procedimento de produção comum que utiliza sonicação.

Potência e intensidade vs. energia

A intensidade superficial e a potência total descrevem apenas a intensidade do processamento. O volume da amostra sonicada e o tempo de exposição a uma determinada intensidade têm de ser considerados para descrever um processo de sonicação de modo a torná-lo escalável e reprodutível. Para uma determinada configuração dos parâmetros, o resultado do processo, por exemplo, o tamanho das partículas ou a conversão química, dependerá da energia por volume (E/V).

Resultado = f (E /V )

Em que a energia (E) é o produto da potência produzida (P) pelo tempo de exposição (t).

E[Ws] = P[W]*t[s]

As alterações na configuração dos parâmetros modificarão a função do resultado. Isto, por sua vez, fará variar a quantidade de energia (E) necessária para um determinado valor da amostra (V), de modo a obter um valor específico do resultado. Por esta razão, não basta aplicar uma determinada potência ultrassónica a um processo para obter um resultado. É necessária uma abordagem mais sofisticada para identificar a potência necessária e a configuração dos parâmetros com que essa potência deve ser aplicada ao material do processo. (Hielscher 2005)

Produção de bioetanol assistida por ultrassons

Já se sabe que os ultrassons melhoram a produção de bioetanol. Recomenda-se espessar o líquido com biomassa até obter uma suspensão muito viscosa que continue a ser bombeável. Os reatores ultrassónicos conseguem processar concentrações de sólidos bastante elevadas, permitindo que o processo de sonicação decorra com a máxima eficiência. Quanto mais material estiver contido na suspensão, menor será a quantidade de líquido de transporte tratado, que não beneficiará do processo de sonicação. Como o fornecimento de energia a um líquido provoca o seu aquecimento de acordo com a lei da termodinâmica, isto significa que a energia ultrassónica é aplicada, tanto quanto possível, ao material-alvo. Esta conceção eficiente do processo evita o aquecimento desnecessário do líquido de transporte em excesso.
Os ultrassons auxiliam a extração do material intracelular, tornando-o assim disponível para a fermentação enzimática. Um tratamento ultrassónico suave pode aumentar a atividade enzimática, mas a extração de biomassa exigirá ultrassons mais intensos. Por isso, as enzimas devem ser adicionadas à suspensão de biomassa após a sonicação, pois os ultrassons intensos inativam as enzimas, o que é um efeito indesejado.

Resultados atuais obtidos pela investigação científica:

Os estudos de Yoswathana et al. (2010) sobre a produção de bioetanol a partir de palha de arroz demonstraram que a combinação de pré-tratamento ácido e ultrassons antes do tratamento enzimático conduz a um rendimento de açúcar aumentado de até 44% (com base na palha de arroz). Isto demonstra a eficácia da combinação de pré-tratamento físico e químico antes da hidrólise enzimática do material lignocelulósico em açúcar. 

O Gráfico 2 ilustra graficamente os efeitos positivos da irradiação ultrassónica durante a produção de bioetanol a partir de palha de arroz. (Foi utilizado carvão vegetal para destoxificar as amostras pré-tratadas provenientes do pré-tratamento ácido/ enzimático e do pré-tratamento ultrassónico.)

Noutro estudo recente, foi examinada a influência da sonicação sobre os níveis extracelulares e intracelulares da enzima β-galactosidase. Sulaiman et al. (2011) conseguiram melhorar substancialmente a produtividade da produção de bioetanol utilizando ultrassons a uma temperatura controlada, estimulando o crescimento da levedura Kluyveromyces marxianus (ATCC 46537). Os autores do artigo concluem que a sonicação intermitente com ultrassons de potência (20 kHz), com ciclos de trabalho de ≤20%, estimulou a produção de biomassa, o metabolismo da lactose e a produção de etanol em K. marxianus, a uma intensidade de sonicação relativamente elevada de 11,8Wcm². Nas melhores condições, a sonicação aumentou a concentração final de etanol para quase 3,5 vezes a do controlo. Isto correspondeu a um aumento da produtividade de etanol para 3,5 vezes a do controlo, mas exigiu um fornecimento adicional de potência de 952W por metro cúbico de caldo através da sonicação. Esta necessidade adicional de energia estava certamente dentro das normas operacionais aceitáveis para biorreatores e, no caso de produtos de elevado valor, poderia ser facilmente compensada pelo aumento da produtividade.

Conclusão: benefícios da fermentação assistida por ultrassons

O tratamento ultrassónico revelou-se uma técnica eficiente e inovadora para aumentar o rendimento de bioetanol. Os ultrassons são utilizados principalmente para extrair material intracelular da biomassa, como milho, soja, palha, material lignocelulósico ou resíduos vegetais.

• Aumento do rendimento de bioetanol
• Desintegração/ Destruição celular e libertação de material intracelular
• Melhoria da decomposição anaeróbia
• Ativação de enzimas por sonicação suave
• Melhoria da eficiência do processo através de suspensões de elevada concentração

A simplicidade dos ensaios, o aumento de escala reprodutível e a facilidade de instalação (também em fluxos de produção já existentes) tornam os ultrassons uma tecnologia rentável e eficiente. Estão disponíveis processadores ultrassónicos industriais fiáveis para processamento comercial, que permitem sonicar volumes de líquido praticamente ilimitados.