Produção ultra-sônica de Schizophyllan Beta-Glucans altamente purificados

O esquizofilano é um β-glucano fúngico com propriedades imunomoduladoras. Para efeitos medicinais altamente activos, o esquizofilano deve ter um baixo peso molecular, a fim de mostrar uma melhor biodisponibilidade. Ultrasonication foi provado para reduzir o peso molecular de schizophyllan. Como método fiável e eficaz, a sonicação pode ser facilmente aplicada para a produção de esquizofilano de baixo peso molecular.

Cogumelos Schizophyllum e extração ultra-sónica de beta-glucano

As espécies do cogumelo Schizophyllum crescem na natureza em árvores em decomposição, depois das estações chuvosas. Os corpos de fruto são recolhidos na estação seca seguinte. As espécies de Schizophyllum são ricas em compostos bioquímicos como glucanos e são, por isso, consumidas especialmente em países tropicais como alimento e medicamento. Devido às suas propriedades imunomoduladoras, antifúngicas, antineoplásicas e antivirais, o Schizophyllum commune, também conhecido como cogumelo Splitgill, tem atraído empresas biotecnológicas e farmacêuticas.
O polissacarídeo esquizofilano, também conhecido como sizofirano, sonifilano ou sizofilano, é o principal β-glucano encontrado nos cogumelos Schizophyllum, que oferecem o β-glucano esquizofilano bioativo altamente eficaz.
Os cogumelos Schizophyllum commune crescem na natureza em árvores, o micélio também pode ser cultivado em caldo de fermentação. Para aplicações farmacêuticas e cosméticas, o esquizofilano de baixo peso molecular é muito mais eficaz do que o esquizofilano de alto peso molecular. Isto deve-se ao facto de o esquizofilano de baixo peso molecular apresentar uma biodisponibilidade e taxas de absorção significativamente melhores. Além disso, o esquizofilano de elevado peso molecular é frequentemente problemático nas aplicações, uma vez que resulta numa elevada viscosidade das suas soluções aquosas.
A redução do tamanho ultrassónico é uma técnica altamente eficaz e fiável para diminuir o peso molecular do esquizofilano, aumentando assim a qualidade da molécula de β-glucano.

Protocolo para a produção de esquizofilano de baixo peso molecular

Desde schizophyllan peso molecular demonstra drasticamente melhor biodisponibilidade e propriedades de aplicação, a equipe de pesquisa de Smirnou investigou ultrassom para clivagem e redução de tamanho da molécula de β-glucano schizophyllan.

Ultrassom de Schizophyllan

β-1,3(1,6)-Glucan schizophyllan (SPG) foi produzido por cultura submersa do fungo S. commune em bioreactor utilizando sacarose como substrato.
Após o final do cultivo, o caldo de cultura foi diluído com água desmineralizada para a concentração de esquizofilano 2 g / L e ultrasonicated com o processador ultrassónico UIP2000hdT (Hielscher Ultrasonics GmbH, Alemanha) em modo de reciclagem nos seguintes parâmetros e condições: fluxo médio 50 mL/s, frequência 20 kHz, saída 2000 W, sonotrodo tipo BS2d22, tipo de reforço B2-1.4 e amplitude 100%. A temperatura do caldo de cultura no início da sonicação foi de 25 ° C. O caldo de cultura ultrasonicated (entrada de energia específica 100 Ws/mL) foi filtrada através de Seitz HS800 filtro de profundidade sob pressão de 1,5 bar a 40 ° C. O schizophyllan ultrasonicated (uSPG) para a caraterização química foi precipitado a partir do filtrado com quantidade tripla de álcool isopropílico à temperatura do laboratório, e seco a 60 ° C durante 12h soluções uSPG para estudos imunológicos foram preparados como se segue: (1) o filtrado de caldo de cultura ultrassónico foi diafiltrado através de uma cassete PES Pall Centramate série T de 0,1 m2 (corte de 100 kDa) a 0,8 bar e a diafiltração continuou até a condutividade do retentado ser de 20 μS/cm; (2) a solução foi concentrada por diafiltração para uma concentração de uSPG de 1 g/L e esterilizada por autoclavagem a 120°C/20 min. A uSPG desnaturada foi preparada de forma semelhante, exceto que foi adicionado NaOH ao filtrado do caldo de cultura na concentração de 0,2 M e a solução alcalinizada foi incubada durante 30 minutos à temperatura do laboratório antes da diafiltração.

Métodos analíticos

O rendimento do micélio foi estimado gravimetricamente: o caldo de cultura foi diluído com água 1:4, centrifugado a 10000 × g a 25°C durante 20 min, o precipitado foi lavado com uma quantidade tripla de água, seco a 60°C e pesado. O esquizofilano foi precipitado do sobrenadante com uma quantidade tripla de álcool isopropílico, seco a 60°C durante 24 horas e o seu rendimento foi determinado gravimetricamente. O pO2 no caldo de cultura foi medido por uma sonda ótica Hamilton-Visiferm DO 120 (Hamilton, Suíça).
A viscosidade dinâmica do caldo de cultura foi medida no HAAKE Visco Tester 6L com fusos 1L e 2L a 4°C e velocidade de rotação de 30 rpm. A velocidade de filtração foi calculada a partir do tempo de filtração de 500 ml de caldo de cultura através de um filtro de profundidade Seitz HS800 (Pall, EUA) de 200 × 200 mm a 1,5 bar de pressão e 40 °C.
O peso molecular da uSPG foi medido por SEC-MALLS no sistema HPLC Alliance (Waters) com colunas PL aquagel OH60 e PL aquagel OH40 ligadas em série, e o detetor miniDAWN TREOS (Wyatt) foi concentrado por diafiltração até à concentração de uSPG de 1 g/L e esterilizado por autoclavagem a 120°C/20 min. A uSPG desnaturada foi preparada de forma semelhante, exceto que foi adicionado NaOH ao filtrado do caldo de cultura numa concentração de 0,2 M e a solução alcalinizada foi incubada durante 30 minutos à temperatura do laboratório antes da diafiltração.

Resultados:
O tratamento de ultra-sons foi aplicado diretamente a S. commune 144-h caldo de cultura com micélio para facilitar SPG processamento a jusante.
 
Caraterísticas do Esquizofilano Sonicado: A esquizofilana ultra-sónica (uSPG) foi precipitada a partir de filtrado de caldo de cultura por álcool e caracterizada. O SEC-MALLS estimou o Mw da uSPG em cerca de 1 MDa. O peso molecular médio da esquizofilana proveniente da fermentação líquida é de aproximadamente 5 MDa, enquanto que no cultivo em estado sólido pode atingir até 10 MDa. Comparando o peso molecular do esquizofilano ultrassónico com os pesos moleculares do esquizofilano nativo não tratado, pode ser observado um peso molecular reduzido de 5 a 10 vezes devido à ultrassonografia.
O polissacarídeo sonicado uSPG continha 0,7%w/w de proteína e 1,0%w/w de resíduo após ignição. O hidrolisado de uSPG consistia em glucose com mais de 99%. Os resultados analíticos indicam que a sonicação cliva aleatoriamente a espinha dorsal do β-glucano e os ramos laterais permanecem intactos, reduzindo assim o tamanho e o peso molecular do esquizofilano. Estudos imunológicos sobre essencialmente proteína e endotoxina livre uSPG mostrou, que ultrasonicated baixo-Mw schizophyllan tem pronunciada atividade imunomoduladora.

 
Viscosidade reduzida: A ultra-sonificação resultou numa diminuição significativa da viscosidade do caldo de cultura. Durante a ultra-sonificação, a viscosidade do caldo de cultura mudou de forma não linear: a diminuição da viscosidade foi rápida no início da ultra-sonificação, mas depois abrandou. A entrada de energia específica de 100 Ws/mL foi suficiente para reduzir a viscosidade do caldo de cultura quase 7 vezes.

Filtragem melhorada: O caldo de cultura tratado com ultrassom fluiu através do filtro mais rápido do que o caldo de cultura não tratado (entrada de energia específica 0 Ws / mL) com SPG de alto peso molecular. Além disso, a ultrassonografia reduziu significativamente a perda de produto durante a filtração. O filtrado de caldo de cultura não tratado com SPG de alto peso molecular (entrada de energia específica 0 Ws/mL) continha 0,3 ± 0,07 g/L SPG, enquanto a concentração de SPG antes da filtração em profundidade era de 2 g/L. Em contraste, o filtrado de 100 Ws/mL cultura ultrasonicated tanto continha SPG em concentração 2,2 ± 0,2 g/L, o que corresponde a quase zero perda de produto.

Conclusão: Em sua conclusão, a equipe de pesquisa resume que o processamento ultra-sônico é uma tecnologia effcient para a fabricação de baixo peso molecular schizophyllan, que pode então usado em cosméticos e medicina. Ultrasonication, quando aplicado em caldo de cultura completa com micélio, traz certas vantagens para a produção de esquizofilano. Ele reduz as perdas de produto durante o processamento a jusante e torna possível a produção de polissacarídeo altamente purificado devido ao uso eficiente de ultrafiltração.
Além disso, os pesquisadores descobriram que o processamento ultra-sônico de schizophyllan é facilmente escalável. Uma unidade do desintegrador ultra-sônico da planta piloto UIP2000hdT processou 1 litro de caldo de cultura em 110 s no modo de fluxo. A produtividade do sistema pode ser facilmente aumentada pela conexão seqüencial de unidades de ultrassom adicionais.

 
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