Produção ultrassônica de beta-glucanos esquizofilanos altamente purificados

Schizophyallan é um fungo β-glucano com propriedades imunomoduladoras. Para efeitos medicinais altamente ativos, o esquizofilano deve ter um baixo peso molecular para mostrar melhor biodisponibilidade. Foi comprovado que a ultrassonografia reduz o peso molecular da esquizofila. Como método confiável e eficaz, a sonicação pode ser facilmente aplicada para a produção de esquizofilano de baixo peso molecular.

Cogumelos Schizophyllum e extração ultrassônica de beta-glucano

Espécies do cogumelo Schizophyllum crescem na natureza em árvores em decomposição após as estações chuvosas. Os corpos frutíferos são coletados na estação seca seguinte. As espécies de Schizophyllum são ricas em compostos bioquímicos, como os glucanos, e por isso são consumidas especialmente em países tropicais como alimentos e medicamentos. Devido às suas propriedades imunomoduladoras, antifúngicas, antineoplásicas e antivirais, Schizophyllum commune, também conhecido como cogumelo Splitgill, atraiu empresas biotecnológicas e farmacêuticas.
O polissacarídeo esquizofilano, também conhecido como sizofiran, sonifilano ou sizofilano, é o principal β-glucano encontrado nos cogumelos Schizophyllum, que oferecem o bioativo altamente eficaz β-glucano esquizofilano.
Os cogumelos Schizophyllum commune crescem na natureza nas árvores, o micélio também pode ser cultivado em caldo de fermentação. Para aplicações farmacêuticas e cosméticas, o esquizofilano de baixo peso molecular é muito mais eficaz do que o esquizofilano de alto peso molecular. Isso se deve ao fato de que o esquizofilano de baixo peso molecular apresenta taxas de biodisponibilidade e absorção significativamente melhores. Além disso, o esquizofilano de alto peso molecular é frequentemente problemático em aplicações, pois resulta em alta viscosidade de suas soluções aquosas.
A redução ultrassônica do tamanho é uma técnica altamente eficaz e segura para abaixar o peso molecular do esquizofilano, aumentando desse modo a qualidade da molécula do β-glucano.

Protocolo para a Produção de Esquizofilano de Baixo Peso Molecular

Uma vez que o esquizofilano de peso molecular demonstra biodisponibilidade e propriedades de aplicação drasticamente melhores, a equipe de pesquisa de Smirnou investigou a ultrassonografia para clivagem e redução de tamanho da molécula de β-glucano esquizofilano.

Ultrassonografia de esquizofilano

β-1.3(1.6)-Glucan schizophyllan (SPG) foi produzido pelo cultivo submerso do fungo S. commune em biorreator usando sacarose como substrato.
Após o término do cultivo, o caldo de cultura foi diluído em água desmineralizada até a concentração de esquizofilano 2 g/L e ultrassônico com o processador ultrassônico UIP2000hdT (Hielscher Ultrasonics GmbH, Alemanha) em modo de reciclagem nos seguintes parâmetros e condições: fluxo médio 50 mL/s, frequência 20 kHz, saída 2000 W, sonotrodo tipo BS2d22, booster tipo B2-1,4 e amplitude 100%. A temperatura do caldo de cultura no início da sonicação foi de 25°C. O caldo de cultura ultrassônico (entrada de energia específica 100 Ws/mL) foi filtrado através do filtro de profundidade Seitz HS800 sob pressão de 1,5 bar a 40°C. O esquizofilano ultrassônico (uSPG) para caracterização química foi precipitado do filtrado com quantidade tripla de álcool isopropílico à temperatura de laboratório e seco a 60°C por 12h soluções de uSPG para estudos imunológicos foram preparados da seguinte forma: (1) o filtrado de caldo de cultura ultrassônico foi diafiltrado através de PES Pall Centramate série T de 0,1m2 (corte de 100 kDa) a 0,8 bar e a diafiltração continuou até que a condutividade do retentado fosse de 20 μS/cm; (2) a solução foi concentrada por diafiltração até a concentração de uSPG 1 g/L e esterilizada por autoclavagem a 120°C/20 min. O uSPG desnaturado foi preparado de maneira semelhante, exceto que o NaOH foi adicionado ao filtrado do caldo de cultura na concentração de 0,2 M e a solução alcalinizada foi incubada por 30 min em temperatura de laboratório antes da diafiltração.

Métodos analíticos

O rendimento de micélio foi estimado gravimetricamente: o caldo de cultura foi diluído com água 1:4, centrifugado a 10000 × g a 25°C por 20 min, o precipitado foi lavado com o triplo da quantidade de água, seco a 60°C e pesado. O esquizofilano foi precipitado a partir do sobrenadante com quantidade tripla de álcool isopropílico, seco a 60°C por 24h e seu rendimento foi determinado gravimetricamente. A pO2 no caldo de cultura foi medida pela sonda óptica Hamilton-Visiferm DO 120 (Hamilton, Suíça).
A viscosidade dinâmica do caldo de cultura foi medida no HAAKE Visco Tester 6L com fusos 1L e 2L a 4°C e velocidade de rotação de 30 rpm. A velocidade de filtração foi calculada a partir do tempo de filtração de 500 mL de caldo de cultura até 200 × filtro de profundidade Seitz HS800 (Pall, EUA) de 200 mm a 1,5 bar de pressão e 40°C.
O peso molecular uSPG foi medido por SEC-MALLS no sistema HPLC Alliance (Waters) com colunas PL aquagel OH60 e PL aquagel OH40 conectadas em série, e o detector miniDAWN TREOS (Wyatt) foi concentrado por diafiltração até a concentração uSPG 1 g/L e esterilizado por autoclavagem a 120°C/20 min. O uSPG desnaturado foi preparado de maneira semelhante, exceto que o NaOH foi adicionado ao filtrado do caldo de cultura na concentração de 0,2 M e a solução alcalinizada foi incubada por 30 min em temperatura de laboratório antes da diafiltração.

Resultados:
O tratamento de ultrassom foi aplicado diretamente ao caldo de cultura de 144 horas de S. commune com micélio para facilitar o processamento a jusante do SPG.
 
Características do esquizofilano sonicado: O esquizofilano ultrassônico (uSPG) foi precipitado do filtrado do caldo de cultura por álcool e caracterizado. A SEC-MALLS estimou o Mw de uSPG em cerca de 1 MDa. O peso molecular médio do esquizofilano da fermentação líquida é de aproximadamente 5 MDa, enquanto no cultivo em estado sólido pode chegar a 10 MDa. Comparando o peso molecular do esquizofilano ultrassônico com os pesos moleculares do esquizofilano nativo não tratado, pode-se observar um peso molecular reduzido de 5 a 10 vezes devido à ultrassonografia.
O polissacarídeo sonicado uSPG continha 0,7% p? p de proteína e 1,0% p? p de resíduo após a ignição. O hidrolisado de uSPG consistiu em glicose com mais de 99%. Os resultados analíticos indicam que a sonicação cliva a estrutura do β-glucano aleatoriamente e os ramos laterais permanecem intactos, reduzindo assim o tamanho e o peso molecular do esquizofilano. Estudos imunológicos sobre uSPG essencialmente livre de proteínas e endotoxinas mostraram que a esquizofilana ultrassônica de baixo Mw tem atividade imunomoduladora pronunciada.

 
Viscosidade reduzida: A ultrassonografia resultou em uma diminuição significativa da viscosidade do caldo de cultura. Durante a ultrassonografia, a viscosidade do caldo de cultura mudou de forma não linear: a diminuição da viscosidade foi rápida no início da ultrassonografia, mas depois diminuiu. A entrada de energia específica de 100 Ws/mL foi suficiente para reduzir a viscosidade do caldo de cultura em quase 7 vezes.

Filtragem aprimorada: O caldo de cultura tratado com ultrassom fluiu através do filtro mais rapidamente do que o caldo de cultura não tratado (entrada de energia específica 0 Ws/mL) com SPG de alto peso molecular. Além disso, a ultrassonografia reduziu significativamente a perda de produto durante a filtração. O filtrado de caldo de cultura não tratado com SPG de alto peso molecular (entrada de energia específica 0 Ws? mL) continha 0,3 ± 0,07 g? L SPG, enquanto a concentração de SPG antes da filtração em profundidade era de 2 g? L. Em contraste, o filtrado de 100 Ws/mL de cultura ultrassônica continha SPG na concentração de 2,2 ± 0,2 g/L, o que corresponde a quase zero perda de produto.

Conclusão: Em sua conclusão, a equipe de pesquisa resume que o processamento ultrassônico é uma tecnologia eficiente para a fabricação de esquizofilano de baixo peso molecular, que pode ser usado em cosméticos e medicamentos. A ultrassonografia, quando aplicada em caldo de cultura completo com micélio, traz certas vantagens para a produção de esquizofilanos. Reduz as perdas de produto durante o processamento a jusante e possibilita a produção de polissacarídeos altamente purificados devido ao uso eficiente da ultrafiltração.
Além disso, os pesquisadores descobriram que o processamento ultrassônico de esquizofilano é facilmente escalável. Uma unidade do desintegrador ultrassônico UIP2000hdT da planta piloto processou 1 litro de caldo de cultura em 110 s no modo de fluxo. A produtividade do sistema pode ser facilmente aumentada pela conexão sequencial de unidades de ultrassom adicionais.

 
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Equipamento ultrassônico de alto desempenho para processamento de glucano fúngico

A fragmentação de polissacarídeos, como glucanos, bem como outros compostos bioativos, como quitina e quitosana, pode ser processada de forma confiável com o equipamento ultrassônico de alto desempenho da Hielscher. Nossos ultrasonicadores podem fornecer altas amplitudes, oferecem controlabilidade precisa sobre os parâmetros do processo e podem ser operados 24 horas por dia, 7 dias por semana, sob carga pesada e em ambientes exigentes. A linha de equipamentos Hielscher Ultrasonics atende a esses requisitos de forma confiável. Além do excelente desempenho de ultrassom, os ultrassônicos Hielscher apresentam alta eficiência energética, o que é uma vantagem econômica significativa – especialmente quando empregado na produção comercial em larga escala.
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A tabela abaixo fornece uma indicação da capacidade aproximada de processamento de nossos ultrassônicos: