Produção ultrassónica de beta-glucanos de esquizofilano altamente purificados

O esquizofilano é um β-glucano fúngico com propriedades imunomoduladoras. Para produzir efeitos medicinais altamente ativos, o esquizofilano deve ter um baixo peso molecular para apresentar uma melhor biodisponibilidade. Está comprovado que a ultrassonicação reduz o peso molecular do esquizofilano. Como método fiável e eficaz, a sonicação pode ser facilmente aplicada à produção de esquizofilano de baixo peso molecular.

Cogumelos Schizophyllum e extração ultrassónica de beta-glucanos

As espécies de cogumelos Schizophyllum crescem na natureza em árvores em decomposição após as épocas chuvosas. Os corpos frutíferos são recolhidos na época seca seguinte. As espécies de Schizophyllum são ricas em compostos bioquímicos, como os glucanos, pelo que são consumidas, sobretudo em países tropicais, como alimento e medicamento. Devido às suas propriedades imunomoduladoras, antifúngicas, antineoplásicas e antivirais, Schizophyllum commune, também conhecido como cogumelo de lamelas fendidas, tem atraído empresas de biotecnologia e farmacêuticas.
O polissacárido esquizofilano, também conhecido como sizofiran, sonifilan ou sizofilan, é o principal β-glucano encontrado nos cogumelos Schizophyllum, que fornecem o β-glucano bioativo altamente eficaz esquizofilano.
Os cogumelos Schizophyllum commune crescem na natureza em árvores; o micélio também pode ser cultivado em caldo de fermentação. Para aplicações farmacêuticas e cosméticas, o esquizofilano de baixo peso molecular é muito mais eficaz do que o esquizofilano de elevado peso molecular. Isto deve-se ao facto de o esquizofilano de baixo peso molecular apresentar uma biodisponibilidade e taxas de absorção significativamente melhores. Além disso, o esquizofilano de elevado peso molecular é frequentemente problemático nas aplicações, uma vez que resulta numa elevada viscosidade das suas soluções aquosas.
A redução de tamanho por ultrassons é uma técnica altamente eficaz e fiável para diminuir o peso molecular do esquizofilano, aumentando assim a qualidade da molécula de β-glucano.

Protocolo para a produção de esquizofilano de baixo peso molecular

Uma vez que o esquizofilano de peso molecular apresenta uma biodisponibilidade e propriedades de aplicação drasticamente melhores, a equipa de investigação de Smirnou estudou a ultrassonicação para a clivagem e a redução de tamanho da molécula do β-glucano esquizofilano.

Ultrassonicação do esquizofilano

O β-1.3(1.6)-glucano esquizofilano (SPG) foi produzido por cultivo submerso do fungo S. commune num biorreator, utilizando sacarose como substrato.
Após o fim do cultivo, o caldo de cultura foi diluído com água desmineralizada até uma concentração de esquizofilano de 2 g/L e submetido a ultrassonicação com o processador ultrassónico UIP2000hdT (Hielscher Ultrasonics GmbH, Alemanha) em modo de recirculação, com os seguintes parâmetros e condições: caudal do meio de 50 mL/s, frequência de 20 kHz, potência de saída de 2000 W, sonotrodo do tipo BS2d22, amplificador do tipo B2-1.4 e amplitude de 100%. A temperatura do caldo de cultura no início da sonicação era de 25°C. O caldo de cultura submetido a ultrassonicação (energia específica fornecida de 100 Ws/mL) foi filtrado através de um filtro de profundidade Seitz HS800, sob uma pressão de 1,5 bar, a 40°C. O esquizofilano submetido a ultrassonicação (uSPG) destinado à caracterização química foi precipitado a partir do filtrado com o triplo da quantidade de álcool isopropílico, à temperatura do laboratório, e seco a 60°C durante 12h. As soluções de uSPG para estudos imunológicos foram preparadas da seguinte forma: (1) o filtrado do caldo de cultura submetido a ultrassonicação foi diafiltrado através de uma cassete PES Pall Centramate da série T de 0,1m2 (limite de corte de 100 kDa), a 0,8 bar, e a diafiltração prosseguiu até a condutividade do retentado ser de 20 μS/cm; (2) a solução foi concentrada por diafiltração até uma concentração de uSPG de 1 g/L e esterilizada em autoclave a 120°C/20 min. O uSPG desnaturado foi preparado de forma semelhante, exceto que se adicionou NaOH ao filtrado do caldo de cultura numa concentração de 0,2 M e a solução alcalinizada foi incubada durante 30 min à temperatura do laboratório antes da diafiltração.

Métodos analíticos

O rendimento de micélio foi estimado por gravimetria: o caldo de cultura foi diluído com água na proporção de 1:4 e centrifugado a 10 000 × g, a 25°C, durante 20 min; o precipitado foi lavado com o triplo da quantidade de água, seco a 60°C e pesado. O esquizofilano foi precipitado a partir do sobrenadante com o triplo da quantidade de álcool isopropílico, seco a 60°C durante 24h e o seu rendimento foi determinado por gravimetria. A pO2 no caldo de cultura foi medida com uma sonda ótica Hamilton-Visiferm DO 120 (Hamilton, Suíça).
A viscosidade dinâmica do caldo de cultura foi medida num HAAKE Visco Tester 6L com fusos 1L e 2L, a 4°C e com uma velocidade de rotação de 30 rpm. A velocidade de filtração foi calculada a partir do tempo de filtração de 500 mL de caldo de cultura através de um filtro de profundidade Seitz HS800 (Pall, EUA) de 200 × 200 mm, a uma pressão de 1,5 bar e a 40°C.
O peso molecular do uSPG foi medido por SEC-MALLS num sistema HPLC Alliance (Waters) com colunas PL aquagel OH60 e PL aquagel OH40 ligadas em série, e o detetor miniDAWN TREOS (Wyatt) foi concentrado por diafiltração até uma concentração de uSPG de 1 g/L e esterilizado em autoclave a 120°C/20 min. O uSPG desnaturado foi preparado de forma semelhante, exceto que se adicionou NaOH ao filtrado do caldo de cultura numa concentração de 0,2 M e a solução alcalinizada foi incubada durante 30 min à temperatura do laboratório antes da diafiltração.

Resultados:
O tratamento por ultrassonicação foi aplicado diretamente ao caldo de cultura de S. commune de 144 h com micélio, para facilitar o processamento subsequente do SPG.
 
Características do esquizofilano sonicado: O esquizofilano submetido a ultrassonicação (uSPG) foi precipitado com álcool a partir do filtrado do caldo de cultura e caracterizado. A SEC-MALLS estimou o Mw do uSPG em cerca de 1 MDa. O peso molecular médio do esquizofilano proveniente de fermentação líquida é de aproximadamente 5 MDa, enquanto no cultivo em estado sólido pode atingir até 10 MDa. Comparando o peso molecular do esquizofilano submetido a ultrassonicação com os pesos moleculares do esquizofilano nativo não tratado, pode observar-se uma redução do peso molecular de 5 a 10 vezes devido à ultrassonicação.
O polissacárido sonicado uSPG continha 0,7%w/w de proteína e 1,0%w/w de resíduo após ignição. O hidrolisado de uSPG era constituído por mais de 99% de glucose. Os resultados analíticos indicam que a sonicação cliva aleatoriamente a cadeia principal do β-glucano e que as ramificações laterais permanecem intactas, reduzindo assim o tamanho e o peso molecular do esquizofilano. Os estudos imunológicos com uSPG essencialmente isento de proteínas e endotoxinas mostraram que o esquizofilano de baixo Mw submetido a ultrassonicação apresenta uma atividade imunomoduladora pronunciada.

 
Viscosidade reduzida: A ultrassonicação resultou numa diminuição significativa da viscosidade do caldo de cultura. Durante a ultrassonicação, a viscosidade do caldo de cultura variou de forma não linear: a diminuição da viscosidade foi rápida no início da ultrassonicação, mas posteriormente abrandou. Uma energia específica fornecida de 100 Ws/mL foi suficiente para reduzir a viscosidade do caldo de cultura quase 7 vezes.

Filtração melhorada: O caldo de cultura tratado com ultrassons passou pelo filtro mais rapidamente do que o caldo de cultura não tratado (energia específica fornecida de 0 Ws/mL) com SPG de elevado peso molecular. Além disso, a ultrassonicação reduziu significativamente a perda de produto durante a filtração. O filtrado do caldo de cultura não tratado com SPG de elevado peso molecular (energia específica fornecida de 0 Ws/mL) continha 0,3 ± 0,07 g/L de SPG, enquanto a concentração de SPG antes da filtração em profundidade era de 2 g/L. Em contrapartida, o filtrado do caldo de cultura submetido a ultrassonicação com 100 Ws/mL continha SPG numa concentração de 2,2 ± 0,2 g/L, o que corresponde a uma perda de produto quase nula.

Conclusão: Na sua conclusão, a equipa de investigação resume que o processamento ultrassónico é uma tecnologia eficiente para o fabrico de esquizofilano de baixo peso molecular, que pode depois ser utilizado em cosmética e medicina. A ultrassonicação, quando aplicada ao caldo de cultura completo com micélio, traz certas vantagens à produção de esquizofilano. Reduz as perdas de produto durante o processamento subsequente e permite a produção de um polissacárido altamente purificado graças à utilização eficiente da ultrafiltração.
Além disso, os investigadores verificaram que é fácil aumentar a escala do processamento ultrassónico do esquizofilano. Uma unidade do desintegrador ultrassónico UIP2000hdT da instalação piloto processou 1 litro de caldo de cultura em 110 s em modo de fluxo. A produtividade do sistema pode ser facilmente aumentada através da ligação sequencial de unidades de ultrassons adicionais.

 
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A redução do peso molecular de β-glucanos, como o esquizofilano, requer ultrassons potentes para obter a clivagem pretendida e um produto final de esquizofilano de elevada qualidade, que pode ser utilizado em aplicações farmacêuticas.
 
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