Fragmentação de alfa-sinucleína usando o VialTweeter Sonicator

As fibrilas e fitas de α-sinucleína são fragmentadas em pesquisas científicas para gerar fragmentos de fibrilas menores ou mesmo moléculas de proteínas individuais, que podem ser mais facilmente analisadas usando várias técnicas experimentais. O VialTweeter Sonicator é um dos ultrassônicos mais comumente usados para fragmentação eficiente e confiável de alfa-sinucleína.

α-Sinucleína em Pesquisa

As fibrilas de alfa-sinucleína são agregados de proteínas fortemente associados a distúrbios neurodegenerativos, como a doença de Parkinson e certas formas de demência, incluindo demência com corpos de Lewy. A pesquisa focada em fibrilas de alfa-sinucleína visa entender seu papel na progressão da doença e desenvolver potenciais intervenções terapêuticas. Ao quebrar as fibrilas de alfa-sinucleína em fragmentos menores, os pesquisadores podem investigar suas características estruturais específicas. Por exemplo, a fragmentação de fibrilas de alfa-sinucleína permite que os pesquisadores investiguem suas interações com outras moléculas, como proteínas, lipídios ou pequenas moléculas. Ao produzir fragmentos menores, os locais de ligação e a afinidade por esses parceiros de interação podem ser sondados de forma mais eficaz. Fribrils e fitas α-Syn menores também podem apresentar toxicidade alterada e efeitos bioquímicos. Portanto, uma técnica de fragmentação confiável e eficiente, que produza resultados reprodutíveis em um tratamento de amostra rápido e simples, é crucial.
Fragmentação ultrassônica de Alpha-Syn: O sonicador VialTweeter é o sistema de preparação de amostras ultrassônico estabelecido que sonica até 10 frascos simultaneamente exatamente nas mesmas condições. As configurações programáveis permitem a repetição simples e rápida dos mesmos experimentos, o que fornece resultados altamente confiáveis e reprodutíveis na fragmentação da fibrila de alfa-sinucleína.

Preparação de amostras de α-sinucleína com um sonicador

Uma abordagem para estudar as fibrilas de alfa-sinucleína envolve sua extração e fragmentação usando técnicas como a sonicação. A sonicação é um processo que usa ondas de ultrassom de alta intensidade e baixa frequência para interromper e quebrar agregados de proteínas, levando à liberação de fibrilas menores ou moléculas de proteínas individuais. O sonicador VialTweeter é um dispositivo comumente usado em estudos de pesquisa relacionados à α-sinucleína para esse fim.

Numerosos estudos de pesquisa descrevem protocolos precisos de preparação de amostras de sonicação de fibrilas de alfa-sinucleína, que usam o Hielscher VialTweeter para fragmentação eficiente e confiável de fibrilas de α-sinucleína. Ao fragmentar as fibrilas por ultrassom, os pesquisadores podem analisar os produtos resultantes e examinar sua estrutura, toxicidade e interações com outras moléculas. Esta pesquisa fornece informações importantes sobre os mecanismos subjacentes à neurodegeneração e potencialmente identifica novos alvos terapêuticos. Os protocolos de sonicação de α-sinucleína bem estabelecidos usando o sonicador VialTweeter permitem resultados confiáveis e reprodutíveis.

Imagens superiores: fibrilas de alfa-sinucleína não fragmentadas
Imagens inferiores: fibrilas de alfa-sinucleína fragmentadas por ultrassom com o sonicador VialTweeter
(estudo e imagens: ©Dieriks et al., 2022)

Fragmentação ultrassônica de fibrilas de α-sinucleína – Protocolos

Como vários pesquisadores usam o sonicador VialTweeter como técnica de fragmentação preferida para produzir fragmentos uniformes de fibrilas de α-sinucleína, os protocolos estabelecidos estão prontamente disponíveis. Abaixo você pode encontrar alguns protocolos de fragmentação exemplares.
 

 
Preparação de sementes ClearTau: As fibrilas ClearTau foram diluídas a 10 μM em dH2O e sonicadas a 70% de amplitude por 50 s com 1 s ON 1 s OFF ciclo in-tube usando o sonicador UP200St com VialTweeter. As sementes foram caracterizadas por microscopia eletrônica.
Medição de fluorescência ThS: As fibrilas ClearTau foram diluídas a 2,5 μM em dH2O e sonicadas a 70% de amplitude por 50 s com 1 s ON 1 s OFF ciclo in-tube usando UP200St com VialTweeter. O monômero Tau 4R2N de comprimento total de 2,5 μM foi usado como controle. À reação de 100 μl, foram adicionados 100 μl de ThS (10 μM), obtendo-se concentrações proteicas finais de 1,25 μM. A fluorescência ThS de ponto único foi medida usando 96 placas de fundo bem transparentes configuradas no leitor de microplacas FLUOstar Omega com excitação a 445 nm e emissão a 485 nm foi registrada.
(cf. Limorenko et al., 2023)
 
Comprimento uniforme de α-sinucleína usando sonicação: A heterogeneidade do comprimento das fibrilas e fitas α-syn foi reduzida por sonicação por 20 min em gelo em tubos Eppendorf de 2 ml em um VialTweeter ajustado para 75% de amplitude, pulsos de 0,5 s.
(cf. Bousset et al., 2013)
 
O controle de qualidade do WT monomérico recombinante humano ou S129A a-Syn e os polimorfos fibrilares que eles geram, bem como o de a-Syn 1-110, foi realizado. Posteriormente, os polimorfos fibrilares foram fragmentados por sonicação por 20 min em tubos Eppendorf de 2 mL no ultrassom VialTweeter para gerar partículas fibrilares com tamanho médio de 42–52 nm adequadas para endocitose.
(cf. Shrivastava et al., 2020)
 

Caracterização de cinco polimorfos fibrilares α-Syn. (A) Micrografias eletrônicas de transmissão de fibrilas polimorfas fibrilares α-Syn coradas negativamente, fitas, fibrilas-91, fibrilas-65 e fibrilas-110 antes (faixa superior) e após a fragmentação com o VialTweeter (faixa inferior) são mostradas. (B) A distribuição de comprimento dos polimorfos fibrilares fragmentados é mostrada. O número (n) de conjuntos fibrilares dos quais os histogramas foram derivados é indicado.
(estudo e imagens: Shrivastava et al., 2020)

 
As fibrilas α-Syn foram fragmentadas por sonicação por 20 min em tubos Eppendorf de 2 ml em um VialTweeter para gerar partículas fibrilares com um tamanho médio de 42 a 52 nm, conforme avaliado pela análise TEM.
(cf. Negrini et al., 2022)
 
As fibrilas ressuspensas91 (em PBS) foram fragmentadas antes da adição às culturas de células por sonicação por 20 min em tubos Eppendorf de 2 mL usando o sonicador Vial Tweeter, alíquotas, congeladas rapidamente em nitrogênio líquido e armazenadas até o uso a -80 ̊C.
(cf. Vajhøj et al., 2021)
 

VialTweeter e Sonicatadores de Laboratório para Fragmentação α-Syn

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A tabela abaixo fornece uma indicação da capacidade de processamento aproximada de nossos ultrassonicadores do tamanho de um laboratório: