Fragmentação de alfa-sinucleína com o sonicador VialTweeter

As fibrilas e fitas de α-sinucleína são fragmentadas na investigação científica para gerar pequenos fragmentos de fibrilas ou mesmo moléculas proteicas individuais, que podem ser analisados mais facilmente com várias técnicas experimentais. O sonicador VialTweeter é um dos sonicadores mais utilizados para a fragmentação eficiente e fiável de alfa-sinucleína.

α-Sinucleína na investigação

As fibrilas de alfa-sinucleína são agregados proteicos fortemente associados a doenças neurodegenerativas, como a doença de Parkinson e certas formas de demência, incluindo a demência com corpos de Lewy. A investigação centrada nas fibrilas de alfa-sinucleína visa compreender o seu papel na progressão da doença e desenvolver potenciais intervenções terapêuticas. Ao decompor as fibrilas de alfa-sinucleína em fragmentos mais pequenos, os investigadores podem estudar as suas características estruturais específicas. Por exemplo, a fragmentação das fibrilas de alfa-sinucleína permite aos investigadores estudar as suas interações com outras moléculas, como proteínas, lípidos ou pequenas moléculas. Ao produzir fragmentos mais pequenos, os locais de ligação e a afinidade por estes parceiros de interação podem ser estudados de forma mais eficaz. As fibrilas e fitas de α-Syn mais pequenas podem também apresentar alterações na toxicidade e nos efeitos bioquímicos. Por conseguinte, é crucial uma técnica de fragmentação fiável e eficiente que produza resultados reprodutíveis através de um tratamento rápido e simples das amostras.
Fragmentação ultrassónica de Alpha-Syn: O sonicador VialTweeter é o sistema ultrassónico consolidado de preparação de amostras que efetua a sonicação de até 10 frascos em simultâneo, exatamente nas mesmas condições. As definições programáveis permitem repetir as mesmas experiências de forma simples e rápida, proporcionando resultados altamente fiáveis e reprodutíveis na fragmentação de fibrilas de alfa-sinucleína.

Preparação de amostras de α-sinucleína com um sonicador

Uma abordagem ao estudo das fibrilas de alfa-sinucleína envolve a sua extração e fragmentação através de técnicas como a sonicação. A sonicação é um processo que utiliza ondas ultrassónicas de alta intensidade e baixa frequência para desagregar e decompor agregados proteicos, levando à libertação de fibrilas mais pequenas ou de moléculas proteicas individuais. O sonicador VialTweeter é um dispositivo frequentemente utilizado para este fim em estudos de investigação relacionados com a α-sinucleína.

Numerosos estudos de investigação descrevem protocolos precisos de preparação de amostras por sonicação de fibrilas de alfa-sinucleína, que utilizam o Hielscher VialTweeter para a fragmentação eficiente e fiável de fibrilas de α-sinucleína. Ao fragmentar as fibrilas por ultrassons, os investigadores podem analisar os produtos resultantes e examinar a sua estrutura, toxicidade e interações com outras moléculas. Esta investigação fornece conhecimentos importantes sobre os mecanismos subjacentes à neurodegeneração e pode identificar novos alvos terapêuticos. Os protocolos bem estabelecidos de sonicação de α-sinucleína com o sonicador VialTweeter permitem obter resultados fiáveis e reprodutíveis.

Imagens superiores: fibrilas de alfa-sinucleína não fragmentadas
Imagens inferiores: fibrilas de alfa-sinucleína fragmentadas por ultrassons com o sonicador VialTweeter
(estudo e imagens: ©Dieriks et al., 2022)

Fragmentação ultrassónica de fibrilas de α-sinucleína – Protocolos

Uma vez que numerosos investigadores utilizam o sonicador VialTweeter como técnica de fragmentação preferida para produzir fragmentos uniformes de fibrilas de α-sinucleína, existem protocolos estabelecidos facilmente disponíveis. Abaixo encontra alguns exemplos de protocolos de fragmentação.
 

 
Preparação de sementes ClearTau: As fibrilas ClearTau foram diluídas para 10 μM em dH2O e submetidas a sonicação dentro do tubo a 70 % de amplitude durante 50 s, com um ciclo de 1 s ligado e 1 s desligado, utilizando o sonicador UP200St com VialTweeter. As sementes foram caracterizadas por microscopia eletrónica.
Medição da fluorescência de ThS: As fibrilas ClearTau foram diluídas para 2,5 μM em dH2O e submetidas a sonicação dentro do tubo a 70 % de amplitude durante 50 s, com um ciclo de 1 s ligado e 1 s desligado, utilizando o UP200St com VialTweeter. Foi utilizado como controlo o monómero Tau 4R2N de comprimento completo a 2,5 μM. Aos 100 μl da reação foram adicionados 100 μl de ThS (10 μM), obtendo-se concentrações proteicas finais de 1,25 μM. A fluorescência de ThS num único ponto temporal foi medida utilizando placas de 96 poços com fundo transparente colocadas num leitor de microplacas FLUOstar Omega, com excitação a 445 nm, e foi registada a emissão a 485 nm.
(cf. Limorenko et al., 2023)
 
Comprimento uniforme de α-sinucleína através de sonicação: A heterogeneidade do comprimento das fibrilas e fitas de α-syn foi reduzida por sonicação durante 20 min sobre gelo, em tubos Eppendorf de 2-ml, num VialTweeter definido para 75% de amplitude, com impulsos de 0,5 s.
(cf. Bousset et al., 2013)
 
Foi efetuado o controlo de qualidade da a-Syn humana recombinante monomérica WT ou S129A e dos polimorfos fibrilares que estas geram, bem como da a-Syn 1–110. Posteriormente, os polimorfos fibrilares foram fragmentados por sonicação durante 20 min em tubos Eppendorf de 2-mL no sonicador VialTweeter, para gerar partículas fibrilares com um tamanho médio de 42–52 nm, adequadas à endocitose.
(cf. Shrivastava et al., 2020)
 

Caracterização de cinco polimorfos fibrilares de α-Syn. (A) São apresentadas micrografias de microscopia eletrónica de transmissão dos polimorfos fibrilares de α-Syn fibrils, ribbons, fibrils-91, fibrils-65 e fibrils-110, com coloração negativa, antes (fila superior) e depois da fragmentação com o VialTweeter (fila inferior). (B) É apresentada a distribuição do comprimento dos polimorfos fibrilares fragmentados. É indicado o número (n) de estruturas fibrilares a partir das quais foram obtidos os histogramas.
(estudo e imagens: Shrivastava et al., 2020)

 
As fibrilas de α-Syn foram fragmentadas por sonicação durante 20 min em tubos Eppendorf de 2 ml num VialTweeter, para gerar partículas fibrilares com um tamanho médio de 42–52 nm, conforme avaliado por análise TEM.
(cf. Negrini et al., 2022)
 
As fibrils91 ressuspensas (em PBS) foram fragmentadas antes da adição às culturas celulares por sonicação durante 20 min em tubos Eppendorf de 2 mL, utilizando o sonicador Vial Tweeter, divididas em alíquotas, congeladas rapidamente em azoto líquido e armazenadas até à utilização a -80 ̊C.
(cf. Vajhøj et al., 2021)
 

VialTweeter e sonicadores de laboratório para a fragmentação de α-Syn

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A tabela abaixo dá-lhe uma indicação da capacidade aproximada de processamento dos nossos sonicadores de dimensão laboratorial: