Fragmentação da alfa-sinucleína utilizando o Sonicador VialTweeter

As fibrilas e fitas de α-sinucleína são fragmentadas na investigação científica para gerar fragmentos de fibrilas mais pequenos ou mesmo moléculas de proteína individuais, que podem ser mais facilmente analisadas utilizando várias técnicas experimentais. O VialTweeter Sonicator é um dos ultrasonicators mais utilizados para a fragmentação eficiente e confiável da alfa-sinucleína.

α-Sinucleína na investigação

As fibrilhas de alfa-sinucleína são agregados proteicos que estão fortemente associados a doenças neurodegenerativas como a doença de Parkinson e certas formas de demência, incluindo a demência com corpos de Lewy. A investigação centrada nas fibrilhas de alfa-sinucleína tem como objetivo compreender o seu papel na progressão da doença e desenvolver potenciais intervenções terapêuticas. Ao dividir as fibrilhas de alfa-sinucleína em fragmentos mais pequenos, os investigadores podem investigar as suas caraterísticas estruturais específicas. Por exemplo, a fragmentação das fibrilhas de alfa-sinucleína permite aos investigadores investigar as suas interações com outras moléculas, tais como proteínas, lípidos ou pequenas moléculas. Ao produzir fragmentos mais pequenos, os locais de ligação e a afinidade para estes parceiros de interação podem ser sondados de forma mais eficaz. As fribrilas e fitas de α-Syn mais pequenas podem também apresentar toxicidade e efeitos bioquímicos alterados. Por conseguinte, é crucial uma técnica de fragmentação fiável e eficiente, que produza resultados reprodutíveis num tratamento de amostras rápido e simples.
Fragmentação ultra-sónica de alfa-sina: O sonicador VialTweeter é o sistema estabelecido de preparação de amostras por ultra-sons que sonicam até 10 frascos simultaneamente sob exatamente as mesmas condições. As definições programáveis permitem a repetição simples e rápida das mesmas experiências, o que dá resultados altamente fiáveis e reprodutíveis na fragmentação de fibrilas de alfa-sinucleína.

Preparação de amostras de α-sinucleína com um Sonicador

Uma abordagem para estudar as fibrilhas de alfa-sinucleína envolve a sua extração e fragmentação utilizando técnicas como a sonicação. A sonicação é um processo que utiliza ondas de ultra-sons de alta intensidade e baixa frequência para romper e quebrar agregados de proteínas, levando à libertação de fibrilas mais pequenas ou de moléculas de proteínas individuais. O sonicador VialTweeter é um dispositivo habitualmente utilizado em estudos de investigação relacionados com a α-sinucleína para este fim.

Numerosos estudos de investigação descrevem protocolos precisos de preparação de amostras de sonicação de fibrilas de alfa-sinucleína, que utilizam o Hielscher VialTweeter para uma fragmentação eficiente e fiável das fibrilas de α-sinucleína. Ao fragmentar as fibrilas por ultra-sons, os investigadores podem analisar os produtos resultantes e examinar a sua estrutura, toxicidade e interações com outras moléculas. Esta investigação fornece informações importantes sobre os mecanismos subjacentes à neurodegenerescência e identifica potencialmente novos alvos terapêuticos. Os protocolos bem estabelecidos de sonicação da α-sinucleína utilizando o sonicador VialTweeter permitem obter resultados fiáveis e reprodutíveis.

Imagens superiores: fibrilhas de alfa-sinucleína não fragmentadas
Imagens inferiores: Fibrilas de alfa-sinucleína fragmentadas por ultra-sons com o sonicador VialTweeter
(estudo e imagens: ©Dieriks et al., 2022)

Fragmentação ultra-sónica de fibrilas de α-sinucleína – Protocolos

Uma vez que numerosos investigadores utilizam o sonicador VialTweeter como técnica de fragmentação preferida para produzir fragmentos uniformes de fibrilhas de α-sinucleína, os protocolos estabelecidos estão prontamente disponíveis. Abaixo pode encontrar alguns protocolos de fragmentação exemplares.
 

 
Preparação de sementes ClearTau: As fibrilas ClearTau foram diluídas a 10 μM em dH2O e sonicadas a 70% de amplitude durante 50 s com um ciclo de 1 s ON e 1 s OFF no tubo, utilizando o sonicador UP200St com VialTweeter. As sementes foram caracterizadas por microscopia eletrónica.
Medição da fluorescência do ThS: As fibrilas ClearTau foram diluídas a 2,5 μM em dH2O e sonicadas a 70% de amplitude durante 50 s com um ciclo de 1 s ON e 1 s OFF no tubo utilizando UP200St com VialTweeter. O monómero Tau 4R2N de comprimento total de 2,5 μM foi utilizado como controlo. À reação de 100 μl, foram adicionados 100 μl de ThS (10 μM), produzindo concentrações finais de proteína de 1,25 μM. A fluorescência de ThS num único momento foi medida utilizando placas de 96 poços de fundo transparente instaladas num leitor de microplacas FLUOstar Omega com excitação a 445 nm e emissão a 485 nm.
(cf. Limorenko et al., 2023)
 
Comprimento uniforme da α-sinucleína utilizando a sonicação: A heterogeneidade do comprimento das fibrilas e fitas de α-syn foi reduzida por sonicação durante 20 minutos no gelo em tubos Eppendorf de 2 ml num VialTweeter regulado para uma amplitude de 75%, impulsos de 0,5 s.
(cf. Bousset et al., 2013)
 
Foi efectuado o controlo de qualidade da a-Syn recombinante humana monomérica WT ou S129A e dos polimorfos fibrilares que geram, bem como o da a-Syn 1-110. Subsequentemente, os polimorfos fibrilares foram fragmentados por sonicação durante 20 min em tubos Eppendorf de 2 ml no ultrassonizador VialTweeter para gerar partículas fibrilares com um tamanho médio de 42-52 nm que são adequadas para endocitose.
(cf. Shrivastava et al., 2020)
 

Caracterização de cinco polimorfos fibrilares de α-Syn. (A) São apresentadas micrografias electrónicas de transmissão de fibrilas, fitas, fibrilas-91, fibrilas-65 e fibrilas-110 de polimorfos de α-Syn corados negativamente antes (pista superior) e após fragmentação com o VialTweeter (pista inferior). (B) É apresentada a distribuição do comprimento dos polimorfos fibrilares fragmentados. É indicado o número (n) de conjuntos fibrilares dos quais os histogramas foram derivados.
(estudo e imagens: Shrivastava et al., 2020)

 
As fibrilhas de α-Syn foram fragmentadas por sonicação durante 20 minutos em tubos Eppendorf de 2 ml num VialTweeter para gerar partículas fibrilares com um tamanho médio de 42-52 nm, conforme avaliado por análise TEM.
(cf. Negrini et al., 2022)
 
As fibrilas ressuspensas91 (em PBS) foram fragmentadas antes da adição às culturas celulares por sonicação durante 20 min em tubos Eppendorf de 2 mL utilizando o sonicador Vial Tweeter, aliquotadas, congeladas em nitrogénio líquido e armazenadas até à utilização a -80 ̊C.
(cf. Vajhøj et al., 2021)
 

VialTweeter e Sonicadores de Laboratório para Fragmentação de α-Syn

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