Wysokoprzepustowe przygotowanie próbek do diagnostyki mitochondriów
Diagnostyka mitochondrialna w badaniach i klinikach jest wykonywana przy użyciu różnych technik, takich jak sekwencjonowanie, PCR i testy biochemiczne. Metody te są wykorzystywane do identyfikacji mutacji DNA i pomiaru funkcji mitochondriów. Sekwencjonowanie pomaga wykryć mutacje genetyczne, podczas gdy PCR może określić ilościowo określone sekwencje DNA. Testy biochemiczne oceniają funkcjonalność białek i enzymów mitochondrialnych.
Diagnostyka chorób mitochondrialnych jest szczególnie trudna ze względu na wyraźną zmienność kliniczną tych chorób, a także ze względu na złożoną interakcję między dwoma różnie dziedziczonymi genomami: mitochondrialnym DNA (mtDNA) i genomem jądrowym.
Ekstrakcja i fragmentacja DNA przy użyciu sonikacji
Ekstrakcja DNA z tkanki mięśniowej jest szczególnie przydatna, gdy podejrzewa się specyficzne dla tkanki zmiany w mtDNA. Zmiany te mogą obejmować delecje mtDNA w przewlekłej postępującej oftalmoplegii zewnętrznej (CPEO), mutacje punktowe mtDNA w miopatiach mitochondrialnych lub zubożenie mtDNA w zespole Alpersa. DNA wyekstrahowane z tkanki mięśniowej można następnie wykorzystać do różnych testów genetycznych, takich jak Southern blot i PCR dalekiego zasięgu w przypadku delecji, PCR w czasie rzeczywistym w przypadku zubożenia lub sekwencjonowanie w przypadku mutacji punktowych.
Sonikacja, wykorzystująca intensywne fale ultradźwiękowe, jest stosowana do kilku zastosowań w diagnostyce mitochondriów. Służy do lizy komórek w celu ekstrakcji zawartości wewnątrzkomórkowej, takiej jak mitochondria i DNA, do ścinania DNA, takiego jak mtDNA i nDNA do sekwencjonowania oraz do homogenizacji próbek.
Sonikator płytkowy UIP400MTP do wysokowydajnego przygotowywania próbek równomiernie sonikowane próbki w płytkach wielodołkowych i 96-dołkowych
Jak izolować mitochondria z komórek i tkanek?
Izolacja mitochondriów obejmuje dwa zasadnicze etapy: rozbicie komórek w celu uwolnienia ich zawartości oraz zastosowanie wirowania różnicowego w celu oddzielenia i odzyskania frakcji mitochondriów.
sonikacja
Sonikatory Hielscher są kompatybilne ze standardowymi buforami do lizy i zestawami, dzięki czemu nadają się do izolacji mitochondriów. Sonikacja służy dwóm głównym celom:
- Liza komórek: Fale ultradźwiękowe rozbijają błony komórkowe, uwalniając zawartość wewnątrzkomórkową.
- Zaburzenia mitochondrialne: Sonikacja w kolejnym etapie może rozerwać mitochondria w celu uwolnienia białek mitochondrialnych lub mitochondrialnego DNA.
- Fragmentacja mtDNA: Sonikacja jest niezawodną techniką ścinania mitochondrialnego DNA do sekwencjonowania.
Sonikator wielodołkowy UIP400MTP umożliwia przygotowanie próbek mitochondrialnych z wysoką wydajnością. W połączeniu z wirowaniem różnicowym, sonikacja zwiększa wydajność izolacji mitochondriów, zapewniając wysoką wydajność nienaruszonych mitochondriów odpowiednich do różnych dalszych zastosowań.
Sonikator do płytek wielodołkowych Hielscher UIP400MTP Działa z każdą standardową płytą
Sonikator wielodołkowy UIP400MTP oferuje liczne korzyści w zakresie wysokowydajnego przygotowywania próbek, np. w diagnostyce mitochondrialnej.
Sonikator UIP400MTP Multiwell Plate Sonicator do wysokowydajnego przygotowywania próbek w diagnostyce biomarkerów.
Przykładowe instrukcje dotyczące ultradźwiękowej fragmentacji mtDNA
Przygotowanie i ekstrakcja:
- Myszy C57BL/6 uśmiercono przez zwichnięcie szyjki macicy.
- Wątroby były szybko ekstrahowane i płukane w lodowatym sterylnym PBS.
Izolacja mitochondriów:
- Mitochondria izolowano przy użyciu 2-mililitrowego młynka do tkanek Dounce i zestawu do izolacji mitochondriów z tkanek.
- Wstępne wirowanie przy 700×g i 3000×g.
- Wykonać dwa dodatkowe etapy płukania buforem C.
Izolacja DNA:
- Osad z pierwszego wirowania przy 700×g został użyty do izolacji jądrowego DNA (nDNA).
- DNA wyizolowano przy użyciu kolumn wirówkowych.
- Mitochondrialne DNA (mtDNA) ekstrahowano z wyizolowanych mitochondriów.
- Jądrowe DNA (nDNA) ekstrahowano z surowych ekstraktów jądrowych, zarówno z tkanki wątroby myszy.
Fragmentacja DNA:
- DNA pofragmentowano na lodzie przy użyciu ultradźwiękowego sonikatora UP50H 30 kHz/50 W z sonotrodą z mikrokońcówką 0,5 mm przy 14 μm przez 2 × 30 sekund.
Wizualizacja i kwantyfikacja fragmentacji:
- Fragmentację po ultradźwiękach uwidoczniono na 1% żelu agarozowym z bezpiecznym barwnikiem DNA SYBR.
- Względna obfitość mtDNA i nDNA została określona za pomocą qPCR.
(por. Mariero i in., 2019)
Sonikator wielodołkowy UIP400MTP ułatwia przygotowanie dużej liczby próbek w standardowych płytkach 96-dołkowych, wielodołkowych i mikrotitracyjnych w celu przygotowania próbek o wysokiej wydajności.
Dowiedz się więcej o zaletach wysokowydajnego przygotowywania próbek przy użyciu UIP400MTP!
Wskazówki dotyczące optymalnej izolacji mitochondriów za pomocą sonikacji:
- Kontrola temperatury: Wszystkie etapy należy przeprowadzać w temperaturze od 0°C do 4°C. Ma to kluczowe znaczenie dla zachowania integralności i funkcjonalności mitochondriów.
- Wydajność i szybkość: Należy pracować szybko i oczyszczać mitochondria tylko w zakresie wymaganym dla konkretnego zastosowania. Nadmierna manipulacja może prowadzić do znacznych strat zawartości mitochondriów.
- Rozcieńczanie zawiesin: Utrzymuj niskie stężenia zawiesin komórek i organelli podczas całego procesu izolacji. Pomaga to zminimalizować ryzyko pułapkowania i aglutynacji, poprawiając tym samym czystość wyizolowanych mitochondriów.
- Objętość próbki: Należy zdecydować się na wiele preparatów na małą skalę zamiast jednego dużego. Takie podejście zazwyczaj skutkuje lepszą wydajnością, ponieważ skalowanie w górę nie zwiększa proporcjonalnie ilości odzyskiwanych mitochondriów. Sonikator wielodołkowy UIP400MTP ułatwia szybką i niezawodną lizę komórek w celu izolacji mitochondriów, a także ekstrakcję białek z mitochondriów.
Wytyczne te sprawią, że proces izolacji przy użyciu lizy ultradźwiękowej i wirowania będzie bardziej wydajny, dając wysokiej jakości preparaty mitochondrialne odpowiednie do dalszych zastosowań.
Sonikatory Hielscher – Jakość Made in Germany
Ultradźwięki Hielscher są dobrze znane z najwyższej jakości i standardów projektowych. Solidność i łatwa obsługa pozwalają na płynną integrację naszych ultradźwiękowców z obiektami przemysłowymi. Trudne warunki i wymagające środowiska są łatwo obsługiwane przez ultradźwięki Hielscher.
Hielscher Ultrasonics jest firmą posiadającą certyfikat ISO i kładzie szczególny nacisk na wysokowydajne ultradźwięki z najnowocześniejszą technologią i łatwością obsługi. Oczywiście ultradźwięki Hielscher są zgodne z CE i spełniają wymagania UL, CSA i RoHs.
Sonikator do płytek 96-dołkowych UIP400MTP do sonikacji płytek mikrotitracyjnych i wielodołkowych
Literatura / Referencje
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- UIP400MTP-Multi-well-Plate-Sonicator-Infographic
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
Często zadawane pytania dotyczące mitochondriów i diagnostyki mitochondrialnej
Czym są mitochondria?
Mitochondria są organellami związanymi z błoną komórkową, występującymi w komórkach większości organizmów eukariotycznych. Są one znane jako elektrownie komórki, ponieważ wytwarzają energię w postaci adenozynotrójfosforanu (ATP) w procesie oddychania komórkowego. Ponadto mitochondria mają własne DNA i odgrywają kluczową rolę w innych procesach komórkowych, w tym w regulacji cyklu komórkowego i śmierci komórki.
Co odróżnia mtDNA od genomowego DNA?
Mitochondrialny DNA (mtDNA) różni się od genomowego DNA (gDNA) na kilka kluczowych sposobów. MtDNA znajduje się w mitochondriach, jest koliste i jest dziedziczone po matce, podczas gdy gDNA znajduje się w jądrze komórkowym, jest liniowe i jest dziedziczone po obojgu rodzicach. MtDNA jest znacznie mniejsze, kodując tylko 37 genów, podczas gdy gDNA zawiera około 20 000-25 000 genów. MtDNA występuje w wielu kopiach na komórkę, ma wyższy wskaźnik mutacji i koduje głównie białka zaangażowane w funkcje mitochondriów. Z kolei gDNA jest zazwyczaj diploidalne, ma niższy wskaźnik mutacji i koduje szeroką gamę genów niezbędnych do rozwoju i funkcjonowania organizmu. Dodatkowo, transkrypcja i translacja mtDNA zachodzi w mitochondriach, podczas gdy transkrypcja gDNA zachodzi w jądrze, a translacja w cytoplazmie. Różnice te odzwierciedlają ich różne role i ewolucyjne pochodzenie.
Czym jest ekstrakt Cell-Free?
Ekstrakt bezkomórkowy to roztwór zawierający zawartość lizowanych komórek, w tym białka, kwasy nukleinowe i inne składniki komórkowe, ale bez nienaruszonych błon komórkowych. Ekstrakt ten jest wykorzystywany w badaniach biochemicznych i biologii molekularnej do badania procesów komórkowych in vitro, umożliwiając naukowcom analizę reakcji i mechanizmów poza żywymi komórkami.
Jaką rolę odgrywają testy PCR w diagnostyce mitochondrialnej?
Testy PCR odgrywają kluczową rolę w diagnostyce mitochondrialnej, umożliwiając wykrywanie mutacji, delecji lub zmian liczby kopii mitochondrialnego DNA (mtDNA). Pozwalają one na amplifikację określonych regionów mtDNA w celu identyfikacji patogennych wariantów związanych z zaburzeniami mitochondrialnymi. Techniki oparte na PCR, takie jak ilościowy PCR (qPCR) i PCR dalekiego zasięgu, są również wykorzystywane do oceny integralności mtDNA, poziomów heteroplazmii i zubożenia mtDNA, zapewniając istotny wgląd w funkcje mitochondriów i choroby.
Dowiedz się, w jaki sposób sonikator mikropłytek UIP400MTP ułatwia testy i analizy PCR!
Co to jest wirowanie różnicowe?
Wirowanie różnicowe jest szeroko stosowaną techniką frakcjonowania komórek i izolacji mitochondriów. Metoda ta oddziela struktury komórkowe na podstawie ich współczynnika sedymentacji, który zależy zarówno od gęstości, jak i kształtu. Proces ten polega na stosowaniu różnych poziomów siły odśrodkowej do próbek w buforowanych roztworach soli o określonej gęstości. Struktury o podobnych współczynnikach sedymentacji osadzą się na dnie probówki w tym samym czasie, umożliwiając ich odzyskanie.
Jak wykorzystuje się wirowanie różnicowe do izolacji mitochondriów?
Wirowanie różnicowe pozwala badaczom skutecznie oddzielić frakcje mitochondriów od innych składników komórkowych. Izolacja mitochondriów obejmuje kilka etapów wirowania, a następnie odzyskanie izolatu.
Wstępne wirowanie: Zastosować niską siłę odśrodkową, aby osadzić duże szczątki komórkowe i jądra.
Kolejne wirowania: Stopniowo zwiększać siłę wirowania, aby uzyskać frakcje osadu wzbogacone w mitochondria. Każdy etap wirowania usuwa struktury o coraz wyższych współczynnikach sedymentacji.
Odzyskiwanie frakcji: Po każdym wirowaniu zbierany jest osad, a supernatant poddawany jest wyższym siłom g w celu wyizolowania kolejnej frakcji. Czynność ta jest powtarzana do momentu uzyskania pożądanej czystości mitochondriów.